細胞ベースのアッセイによるひと血清抗アクアポリン 4 免疫グロブリン G の検出

神経髄炎の光学スペクトル障害に関する最近の国際的な診断基準によると、抗AQP4 IgGは、コア診断バイオマーカーであると考えられている。細胞ベースのアッセイによる抗AQP4 IgG検出は、臨床診断を容易にすることができる。したがって、細胞ベースのアッセイは、他の検出方法よりも感度が高く、特異的です。

そして、それは臨床診断と科学的研究の両方に適用することができます。まず、患者の血清サンプル、バイオチップスライド、PBS粉末、およびTWEEN 20を冷蔵された細胞ベースのアッセイキットから室温に持ち込む。次いで、各バイオチップスライドに対して0.2%のTWEEN 20を含むPBS洗浄バッファーを200ミリリットル以上調製した。

洗浄バッファーを使用して、各血清サンプルの 10 倍の連続希釈液を作ります。メーカーの指示に従って、正と負のコントロールを準備します。試薬トレイ上の5つの個々の反応フィールドに、サンプルの10倍の連続希釈液、陽性対照、および陰性対照の30マイクロリットルを加えます。

バイオチップスライドをスライドで保持し、反応フィールドに触れることなく保護カバーを取り外します。試薬トレイの上にスライドを置き、30分間室温でセットアップをインキュベートします。洗浄バッファーで、バイオチップスライドをそっと洗い流します。

その後、洗浄バッファーの100ミリリットルで満たされた500ミリリットルのビーカーに浸し、室温で10分間放置します。洗浄バッファーからバイオチップスライドを取り出します。ペーパータオルを使用して、残りのバッファーを反応フィールドの外側から慎重に拭き取ります。

スライドを1~2分間空気乾燥させます。暗室では、試薬トレイの各反応フィールドに25マイクロリットルの蛍光二次抗体を加えます。試薬トレイの上にスライドを置き、30分間室温でセットアップをインキュベートします。

洗浄バッファーで、バイオチップスライドをそっと洗い流します。その後、新鮮な洗浄バッファーの100ミリリットルで満たされた500ミリリットルのビーカーに浸し、室温で10分間放置します。洗浄バッファーからバイオチップスライドを取り出します。

ペーパータオルを使用して、残りのバッファーを反応フィールドの外側から慎重に拭き取ります。スライドを1~2分間空気乾燥させます。バイオチップスライドの各反応フィールドに、埋め込み培地を1滴慎重に追加します。

最後に、気泡を避けながらカバーガラスでバイオチップスライドをシールし、イメージングを進めます。感染領域で観察された陰性対照の弱い蛍光強度は、二次抗体の非特異的結合を示す。感染した領域と感染していない領域における陽性対照の検出された蛍光強度の比較は、感染細胞におけるAQP4 IgGとAQP4M1の特異的結合を示す。

抗AQP4 IgG陰性血清は、感染した領域と感染していない領域の両方で陰性対照と同様の結合パターンを示す。陽性血清は、感染した領域と感染していない領域の両方で陽性対照と同様の結合パターンを示す。サンプルは、感染領域で蛍光が不均一に増加すると、抗AQP4 IgG陽性と見なされます。

蛍光強度は、血清中の抗AQP4 IgG価に相関する。サンプルは、トランスフェクション領域内の少数の細胞のみが検出可能な蛍光強度を示す場合に、おそらく陽性と考えられる。感染領域の強度が感染していない領域よりも均質に強い場合、サンプルは抗AQP4 IgG陰性とみなされるべきです。

気泡を避けることは非常に重要で困難です。気泡を除去するには、まずピペットを使用して、液滴中の気泡を避けてください。第2に、試薬トレイにバイオチップスライドを施しながら、まずスライドの片側を液滴に触らせ、次にゆっくりとスライドをレベル付けする。

また、実験中は反応場に触れないでください。