とチャールズHフード財団若手研究者母子保健研究賞（ボストン、マサチューセッツ州）によって - この作品の一部は国立小児保健発育研究所（R21 HD059015 NICHD）の生殖支店によって資金を供給された。

1。非常にGC -リッチなKISS1Rの遺伝子配列の部位特異的変異誘発<ol><li>テンプレート：そのN末端に融合させたMycタグとの人間KISS1Rの完全なcDNA配列。このシーケンスは、その後、トランスフェクションに使用される哺乳動物細胞株との互換性があるpCS2 +発現ベクターにクローニングされています。この発現ベクターは、pCS2 + MycのKISS1Rと称する。 </li><li>プライマーの設計プライマーはQuikchange部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene社）の指示にしたがって、所望の変異を運ぶために設計されています。要約すると： <ul><li>両方（フォワードおよびリバース）プライマーは、所望の変異を含み、プラスミドの反対の鎖に同じシーケンスにアニールする必要があります（例えば、フォワードプライマーとリバースプライマーは、互いに相補的である） <img src="/files/ftp_upload/2897/step1.jpg" alt="ステップ1" /></li><li>プライマーは25〜45塩基長および1つまたは複数のCまたはG塩基で終了してください <img src="/files/ftp_upload/2897/step2.jpg" alt="ステップ2" /> <img src="files/ftp_upload/2897/step3.jpg" alt="ステップ3" /></li><li>導入された変異（s）はプライマーの中央になると両側に正しいシーケンスの〜10月15日基地が隣接してください</li><li>プライマーの融解温度（Tm）が等しいか、または78℃以上でなければなりませんTmを推定するためには、次の式を使用します。 <ul><li>変異を導入した場合：Tm値= 81.5 + 0.41（％GC） - 675 / N - ％のミスマッチ（Nは塩基のプライマーの長さです） </li><li> - 675 / N（Nは、挿入または削除されている塩基を含んでいない）のTm = 81.5 + 0.41（％GC）：挿入または欠失を導入した場合</li><li>脱塩プライマーを（必要に応じてそれ以上の精製）を使用してください。 <img src="/files/ftp_upload/2897/step4.jpg" alt="ステップ4" /></li></ul></li></ul></li><li>最高の増幅条件は、PCRxエンハンサー溶液（Invitrogen社）とDMSOの添加が含まれています。例えば4％と8％とDMSOの少なくとも2濃度は、、テストする必要があります。 PCR条件は、Iと図1の表に示されている、とpCS2 + MycKISS1Rの代表的なPCR増幅の結果を図2に示されています。 </li><li> DpnIの10倍NEBuffer 42μlを持つPCR産物の遠心分離管の17.5μlのミックスと0.5μl（;ニューイングランドバイオラボ10U）：37℃で1時間30分間DpnIによるメチル化DNAの消化により、増幅産物について、親のDNAを排除する。 </li><li> XL10 - GoldをUltracompetent E.の45μlをDpnI処理DNAのミックス2μlの：DpnI処理したPCR産物を変換あらかじめ冷却した15 mlの細胞培養チューブの大腸菌 （ストラタジーン社製）。 β-メルカプトエタノールの2μlのを追加し、Stratagene社の指示に従ってください。プレート37100μg/mlアンピシリンとインキュベートを含むLB -寒天プレートで形質転換されたバクテリア℃の100 -400μl </li><li>ミニプレップ2〜4個のコロニーは、プラスミドDNAを単離する。単離されたDNAの塩基配列決定と解析による所望の変異の導入に成功を確認してください。 </li></ol> 2。 HEK - 293細胞へのMycKISS1Rの一過性トランスフェクション<ol><li>以下の実験は37℃CO 2インキュベーター（5％CO 2）で培養したヒト胎児腎臓細胞（HEK - 293）で実行されます° DMEMでCは、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した。 </li><li>シード6ウェルプレートにHEK - 293 2.5x10 5細胞/ mlの細胞は、それらを37℃で一晩増殖° Cをトランスフェクションの前にしましょう。注：（i）各実験条件に対して3つのウェルを使用すること、（ii）トランスフェクション時の理想的な細胞の合流は30％〜50％である。 </li><li>トランスフェクションHEK - 293、製造元の指示に従ってGenePorterトランスフェクション試薬（Genlantis）を用いて細胞、：DNA /ウェルの1μgの積算に0.5μgpCS2 + MycKISS1Rプラス0.5μg制御（空の）ベクトルと無血清DMEMのミックスの半分。トランスフェクトしたDNAのμgのあたり10μlをトランスフェクション試薬を使用して残りの半分を混ぜる。注：理想的なプラスミドDNAの濃度は異なる場合があります。 </li></ol> 3。細胞治療と溶解<ol><li>トランスフェクション後24時間、1ミリリットルDMEM、2.5％FBSを（細胞の代謝を減少させる）を含むと、細胞培地を交換してください。注意：血清中のこの減少は、容易に、および/または結果の検出を増幅することができる。 </li><li>リソソーム阻害剤（100μg/ウェルロイペプチンの）直接重ね全体を6ウェルプレートの各ウェルに追加します。 37℃6または16時間（またはその他の所望の時間）のためのCを</li><li>直接2つの全体の6ウェルプレートの全ウェルに調製したばかりのプロテアソーム阻害剤（MG132の10μM/ウェル）を追加します。 ° C、2、4、6または16時間（または必要な時間）を37でインキュベートする。第四6ウェルプレート（0タイムポイント）の全ウェルに車両を追加し、37℃で16時間のためのC </li><li>インキュベーションが終了すると、氷にプレートを移動し、蛋白質の劣化を防止するために、氷上でこの全体の溶解の手順を実行します。 <ul><li>タンパク質の収量を高めるために、単一のCENTRで6 - ウェルプレート上に三連を組み合わせるifugeチューブ</li><li>培地を吸引除去し、緩衝生理食塩水氷冷リン酸塩（PBS）を1mlで細胞を1回洗浄</li><li>氷冷した溶解バッファー（20mMのHEPES、pH7.4の、1％NP - 40、150MMのNaCl、1mMのEDTA、0.25％デオキシコール酸ナトリウム）を含むプロテアーゼ阻害剤（1Xカクテル100mMのAEBSF - 塩酸、80μmのアプロチニン、5mMのベスタチンを含む100μLを加える各ウェルに1.5mmのE - 64、0.5M EDTA、2mMのロイペプチン及び1mMのペプスタチンA、プラス2mMのPMSF） </li><li>チューブを遠心して細胞スクレーパーと転送細胞のライセートで細胞を取り除く</li><li> 20ゲージの針を介して細胞〜10回を渡します。注：膜タンパク質のウェスタンブロットの検出を目的としたサンプルを超音波処理しないでください。超音波処理は、電気泳動中に正しく移行されません膜タンパク質の凝集、につながる</li><li>ロッキングプラットフォーム上で4℃で1時間のために細胞ライセートをインキュベート</li><li> 4℃で遠心細胞ライセート° 10,000 ×回転数と新しいチューブへの転送上清で10分間。注：このステップの間にペレットを乱さないようにする</li><li> BCA法を用いて上清の10μlの（ピアース）でタンパク質濃度を決定する</li><li>プロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液で1mg/mlに溶解して希釈する。 </li></ul></li></ol> 4。免疫沈降とMycKISS1Rのウェスタンブロット検出<ol><li>氷（または4℃）で、次の免疫沈降の手順を実行します。 <ul><li>氷冷したPBSで2回アガロース結合抗- myc抗体（2.5μg/サンプル）の適切な量を洗うとライセートのタンパク質400μgにこれを追加します。 </li><li>ライセートにMycKISS1Rを免疫沈降4℃で一晩穏やかに撹拌しながらロッキングプラットフォームのC。 </li><li> 4でパルス遠心分離によってアガロースビーズをスピンダウン° C（最大10,000 ×回転数） </li><li>吸引し（ペレットを邪魔することなく）上清を捨てる</li><li>氷冷した溶解緩衝液で二回氷冷PBSで1回ビーズを洗浄する。紡績前に軽くチューブを反転</li><li> 10パーセントβ-メルカプトエタノールを含む2 ×サンプルローディングバッファーに抗体結合MycKISS1Rを含むRessuspendビーズ。 </li></ul></li><li> MycKISS1Rの免疫複合体のウェスタンブロット： <ul><li> 37℃で30分間加熱サンプル℃までの注：膜タンパク質のウェスタンブロットの検出を目的とした試料を沸騰しないでください。超音波処理と同様に、沸騰は、これらのタンパク質の凝集につながる</li><li> 5分間氷にすぐにチューブを移動する</li><li> 4〜15パーセントの勾配ゲルでSDS - PAGEで分離タンパク質。 </li><li> Bio - Rad社製セミドライトランスファーを使用してトランスファーバッファー中で30分間（48mMトリスベース、39mmのグリシン、1.2mmのSDS、20％メタノール、pHは9.2）のために25Vでイモビロン- FL PVDF膜（赤外線検出のため）に転送する装置</li><li> Licorのオデッセイは、ロッキングプラットフォーム（代わりに、TBSで5％の牛乳が非特異的結合をブロックするために使用することができる）のブロッキング室温で1時間のためにトリス緩衝食塩水（TBS）とブロックで、室温で5分間メンブレンを洗浄してください。 </li><li> 4℃で一晩インキュベートメンブレン· 0.1％Tween - 20を含むブロッキング溶液でウサギ抗myc抗体（1:500）とC </li><li>一次抗体を除去し、0.1％Tween - 20を含むTBSで5分間ずつ（TBST）の膜を3回洗浄</li><li> 0.1％のTween - 20、0.01％SDSを含むブロッキングバッファーでヤギ赤外線RedDye ® 800CW標識抗ウサギIgG抗体（1:10,000）と室温で1時間のための膜をインキュベート</li><li> 、二次抗体を削除する5分だけTBSとTBSTと最後にもう一度とそれぞれの膜を3回洗浄（Tween - 20を、残りを削除する） </li></ul></li><li> LI - CORのオデッセイ赤外線イメージャを使用してMycKISS1Rのイメージングと定量化： <ul><li>膜上MycKISS1Rは、LI - CORのオデッセイ赤外線イメージャーを用いて画像化されます。開始するには、グリッドでそれを合わせ、オデッセイのスキャナの左下隅に膜を置きます。ゴム製のマットで覆い、ローラーで気泡を滑らかにし、ふたを閉める</li><li>コンピュータ上で新しいプロジェクトファイルを作成します。ファイルに名前を付け、&quot;完了&quot;をクリックし、&quot;スキャン&quot;でスキャナのログインを入力します。サイズスキャナのコンソールボックスお膜をフィットし、169μmの解像度と媒体の画質を選択する</li><li>各信号の予想される強度に応じて700（赤）および800（緑）のチャネルの強度設定を選択します。これは、信号の可視化を目的としたものであり、定量化に影響を与えません。 &quot;スキャンを開始&quot;をクリックします</li><li>スキャンに名前を付けて保存し、定量化のための新しいウィンドウで開くために&quot;OK&quot;をクリックします。 MycKISS1Rモノマーは、約43kDで見えるはずです</li><li> &quot;ボックス&quot;ツール（左側のサイドバー上で）使用して、最初のバンドの周りにボックスを描きます。 &quot;コピー&quot;し、すべてのバンドがで収まることを確認するの周囲にボックスをドラッグして、すべてのバンド上にボックスを&quot;貼り付ける&quot; </li><li> &quot;Ctrlキー+ A&quot;を使用してすべてのボックスを選択し、[中央値、バックグラウンドを減算するためのオプションを選択します。上部メニューの&quot;レポート&quot;をクリックし、定量値とのスプレッドシートが表示されます。ここに示されている代表的な結果がrepreseです未処理の細胞上に折りたたみ式の増加（時間ゼロ）としてnted </li></ul></li></ol> 5。代表的な結果： <ol><li>非常にGC -リッチなKISS1Rの遺伝子配列の部位特異的突然変異誘発： 表1は、。KISS1R の増幅の効率を改善する試薬の組み合わせを示しています。この組み合わせが正常にKISS1R cDNA配列の異なる領域に対してだけでなく、この高度にGCリッチな遺伝子の増幅のために向けられたいくつかの突然変異を導入するために使用されています。図1は、KISS1Rの突然変異誘発のためのサイクリングと増幅の条件を示しています。これらの条件は、QuikChange部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene社製）から変更されています。 図2は、この最適化されたプロトコルを使用する代表的な結果を示しています。 PCRxエンハンサーと組み合わせて4パーセントまたは8％DMSOの添加は、GC -リッチなKISS1R cDNAを含有プラスミドの増幅の収量を大幅に向上します。この代表的な実験では、4％DMSOは8％DMSOに比べてわずかに良好な増幅条件を提供した。 ultracompetent E.とDpnI処理増幅産物の変換大腸菌は、通常、1,000以上のコロニーに100を得られる、そしてDNA配列決定によって決定される所望の変異の導入に成功率は80〜90％です。 </li><li>受容体の生理機能を研究するMycKISS1Rの構文の使用： この代表的な実験では、最適化されたプロトコルここで説明にしたがって増幅された野生型pCS2 + MycKISS1Rは一過性MycKISS1Rを発現して、関連する細胞株（HEK - 293） の in vivo KISS1受容体の劣化で勉強するために使用されます。トランスフェクションしたHEK - 293の方法で説明されているプロトコルに従ってリソソーム（ロイペプチン）またはプロテアソーム（MG132）阻害剤で細胞を処理した後、細胞は、ウェスタンブロットのために溶解し、処理されます。底面パネルはトップパネルに表示されているバンドの定量化を示すのに対し、図3の上部パネルには、MycKISS1Rモノマーのスキャンを示しています。バンドの定量は、ロイペプチン、治療の6時間も16HのどちらがMycKISS1Rタンパク質レベルに影響を与えたことを示しています。逆に、MG132で処理すると、MG132とのインキュベーションの16時間後の受容体の45倍の蓄積で絶頂に達するこれらの細胞におけるMycKISS1Rタンパク質の時間依存的な増加となりました。これらの観​​察は、ほとんどのGタンパク質共役受容体とは異なり、KISS1Rはプロテアソーム（というリソソームより）により分解される、ことを示している。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td> DMSO </td><td></td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> 0 </td><td> 4パーセント </td><td> 8パーセント </td></tr><tr><td>水</td><td> 35 </td><td> 33 </td><td> 31 </td></tr><tr><td> 10倍PfuのウルトラTaqポリメラーゼバッファー</td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> dNTPミックス（10mMの） </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>プライマーのセンス（25pmol/μl） </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>プライマーのアンチセンス（25pmol/μl） </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10倍PCRxエンハンサーソリューション</td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> PFUウルトラTaqポリメラーゼ（2.5U/μl） </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>プラスミドDNA（20ng/μl） </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 表1：無事 GC -リッチなKISS1Rを変異と増幅に用いる試薬の組み合わせ<img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 GC -リッチなKISS1Rの成功変異誘発および増幅のサイクリング条件：2分ホットスタートが95℃で30秒間の融解の18サイクル、続いていた℃、55℃でアニーリング1分間68℃、6分間の延長℃の68追加の10分の延長° Cは、最後のサイクルの終わりに追加されました。これらの設定は、QuikChange II XL -部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene社製）のオリジナルの変異誘発のプロトコルから調整した。 <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 pCS2の5μlを+ Mycの0の存在下で増幅KISS1R、4または8％DMSOをエチジウムで染色したこの代表的な1％アガロースゲルにロードされた：DMSOの存在下または非存在下で増幅されたGC -リッチなpCS2 + MycのKISS1Rの可視化ブロマイドと紫外線光を使用して可視化。 6KBのプラスミドのバンドは、PCRの4％の存在下で増幅産物と8％のDMSOを搭載した両レーンではなく、PCRでロードされた最初の車線、上に表示されますDMSOの存在下で増幅産物。 <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。 HEK - 293細胞にMycのKISS1Rタンパク質のレベルでロイペプチンまたはMG132の効果：MycのKISS1Rを発現している HEK - 293細胞を37℃で100μg/mlロイペプチンまたは10μMのMG132で処理°で指定された時間のためのC。細胞ライセートの400μg上MYC KISS1Rは、アガロース結合抗- myc抗体の2.5μgで免疫沈降とウェスタンブロットにより解析した。 IRDye 800CW標識抗ウサギとのインキュベーションに続いてウサギ抗Myc - tag抗体によるイムノブロットのインキュベーション後のMycのKISS1Rの（A）LI - CORのオデッセイの検出、使用に示すようにMycのKISS1Rのバンドの（B）定量（） LI - CORのオデッセイの定量化ソフトウェア。結果は、未処理の細胞倍以上 - 増加（時間0）として表されます。

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利害の衝突は宣言されません。

部位特異的突然変異誘発法は、30年以上を対象とした遺伝子のコーディング配列でヌクレオチド変化を導入することによって、蛋白質機能を研究するために使用されています。オリジナルの技術は、英国、カナダの化学者、ノーベル賞受賞者のマイケルスミス10で1978年に記述されていた。マイケルスミスはケイリーンマリス、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）11を発明したアメリ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 10倍PCRxエンハンサーソリューション</td><td>インビトロジェン</td><td> 52391 </td></tr><tr><td> PfuUltra高忠実度DNAポリメラーゼの代替洗浄剤</td><td>ストラタジーン</td><td> 600385 </td></tr><tr><td> DPN - I </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10 - GoldをUltracompetent E.大腸菌細胞 </td><td>ストラタジーン</td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10から013 - CV </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporterトランスフェクション試薬</td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>カルビオケム</td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td>カルビオケム</td><td> 47491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td>アンビオン</td><td> AM9625 </td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテルとPMSF </td><td>サンタクルスバイオテクノロジー</td><td> SC - 24948 </td></tr><tr><td>ピアスBCAタンパク質アッセイキット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 23225 </td></tr><tr><td>抗Mycタグ（クローン4A6）アガロース抱合体</td><td>ミリポア</td><td> 16から219 </td></tr><tr><td> 2倍のローディングバッファー</td><td> BioRad社</td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td>基準のトリス- HClプレキャストゲル、4-15％の勾配</td><td> BioRad社</td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td>イモビロン- FL PVDF膜</td><td>ミリポア</td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td>オデッセイブロッキングバッファー</td><td> LI - COR Biosciences社</td><td> 927から40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad社</td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td>ウサギ抗myc抗体</td><td>細胞シグナリング</td><td> 2272 </td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIRDye 800CW </td><td> LI - COR Biosciences社</td><td> 926から32211 </td></tr><tr><td>オデッセイイメージング赤外線システム</td><td> LI - COR Biosciences社</td><td></td></tr><tr><td>停止のプロテアーゼインヒビターカクテル（100倍） </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 78430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

キスペプチン受容体（KISS1R）は思春期の引き金と成人1,2,3の生殖能力の調節因子として認識され、Gタンパク質共役型受容体です。患者で同定KISS1Rの不活性化変異がiodiopathic低ゴナドトロピン性性腺機能低下症（IHH）1,2と思春期早発症4に関連している。これらの変異体の機能的研究は、この受容体による生殖の調節だけでなく、病気の結果を整形したものと、結果は異常KISS1Rシグナリングと機能からの根底にあるメカニズムの理解にとってきわめて重要である。しかし、KISS1Rの遺伝子の高度にGC -リッチ配列は、それはかなり困難な突然変異を導入またはPCRによってこの受容体をコードする遺伝子を増幅することができます。 ここでは、我々の研究室で十数KISS1R変異体を介して生成するために正常に使用されているこの非常にGCリッチな配列に興味の変異を導入する方法を説明します。我々はKISS1Rシーケンスで置換、欠失又は挿入を含むKISS1R変異体の範囲の増幅を促進するためのPCR条件を最適化してきました。 PCRエンハンサー溶液の添加は、同様にDMSOのわずかな割合のような増幅を向上させるために特に有用であった。この最適化された手順は、他のGCリッチなテンプレートの役に立つかもしれません。 KISS1Rをコードする発現ベクターは、変異がKISS1R機能を変更すると関連する生殖表現型に導く方法を理解するために、この受容体のシグナル伝達と機能を特徴付けるために使用されています。従って、部位特異的突然変異誘発により生成されたKISS1R変異体の潜在的なアプリケーションは、多くの研究1,4,5,6,7,8によって説明することができます。例として、思春期早発症に関連付けられているKISS1R（Arg386Pro）、、の機能獲得型変異はKISS1R 9の分解速度を変化させるリガンド刺激4と同様に受容体の応答性を延長することが示されている。興味深いことに、我々の研究は、ほとんどのGタンパク質共役受容体9のために説明古典リソソーム分解するのではなく、KISS1Rはプロテアソームにより分解されることを示している。ここで紹介する例では、KISS1Rの劣化は、一時的にmycタグKISS1R（MycKISS1R）を発現するヒト胎児腎臓細胞（HEK - 293）で検討されており、プロテアソームやリソソーム阻害剤で処理した。細胞溶解物をウェスタンブロット分析に続いてアガロース結合抗- myc抗体を用いて免疫沈降している。ブロット上MycKISS1Rの検出および定量は、LI - CORのオデッセイ赤外線システムを使用して実行されます。このアプローチでは、同様に関心のある他のタンパク質の分解の研究に有用である。

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Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

キスペプチン受容体（KISS1R）の変異は患者の生殖障害に関連付けられています。ここでは、免疫沈降とウェスタンブロットによる受容体の分解経路を特徴づけるためにKISS1RのGC -リッチ配列と同様にKISS1Rの構文の使用に関心の突然変異を導入する方法について説明します。

生殖障害を持つヒトで同定されたGC -リッチなKISS1受容体配列の遺伝的変異の変異導入と解析

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

mutagenesis-analysis-genetic-mutations-gc-rich-kiss1-receptor

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K ビュー.  University of Miami Miller School of Medicine. キスペプチン受容体（KISS1R）の変異は患者の生殖障害に関連付けられています。ここでは、免疫沈降とウェスタンブロットによる受容体の分解経路を特徴づけるためにKISS1RのGC -リッチ配列と同様にKISS1Rの構文の使用に関心の突然変異を導入する方法について説明します。

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Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

鶏胚における神経誘導のためのアッセイ

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

ヒト多能性のための代替培養はセル生産、メンテナンス、および遺伝子解析幹

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;タンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.