我々は彼らの技術支援のためのトランHuynhとアンドリューサンアントニオ、ジェリー·リンに感謝します。この作品は、XXに健康助成DA023700とDA023700-04S1の国立研究所によって資金を供給された

1。脳スライス標本<ol><li>トランスジェニックマウスは、ペントバルビタールナトリウム（&gt; 100 mg / kgを腹腔内）と深く麻酔し、急速に断頭し、自分の脳は、凍結と酸素切断溶液中に抽出。 </li><li> GFPのゴーグルは、マウスの脳は確かにGFPを発現した場合視覚的にスクリーニングするために使用されています。 </li><li>厚さ400μmの一次体性感覚皮質のセクションはスクロース含有人工脳脊髄液（ACSF）でビブラトームで切断されています。スライスは、最初の32°Cで30分〜1時間スクロース含有ACSF中でインキュベートし、初期の潜伏期間の後、室温で記録ACSFに転送されます。インキュベーションと記録を通して、スライスが連続して95％O 2 -5％CO 2で泡立てています。 </li></ol> 2。装置の起動全体的なシステムの実装は、図1に示されている。 <ol><li>レーザー冷却システムと電力供給者はturneですdに、レーザーが準備。 </li><li>光刺激コントロール（走査ミラーシステム、光変調器、電子シャッターとフォトダイオード入力アンプを含む）に関連するすべてのハードウェアがオンになっています。 </li><li>電気生理学機器（Multiclamp 700Bアンプとマイクロマニピュレータを含む）が有効になっています。電気生理学的記録、光刺激、そしてスライス標本のイメージング顕微鏡の電動ステージに搭載されたスライスの灌流チャンバーで行われます。 </li><li>撮像カメラ（Retiga 2000、Qイメージング、テキサス州オースティン）がオンになっています。スライスは、赤外線微分干渉コントラスト（DIC）およびイメージングシステムを介したエピ蛍光光学系と正立顕微鏡（BW51X、オリンパス）で可視化されています。 </li><li> MATLABベース山なりの投球ソフトウェアとQキャプチャカメラソフトウェアが起動されます。山なりの投球ソフトウェアのカスタム修飾されたバージョン（山なりの投球で入手できる<a href="https://openwiki.janelia.org/">https://openwiki.janelia.org/ &lt;</a>/&gt;）は、光刺激プロトコルを制御し、光刺激データを取得するために使用されます。 </li><li>システムがオンになった後、1つは、レーザー光刺激システムが稼動状態であるかどうかを確認する必要があります。 4倍顕微鏡対物がグルタミン酸アンケージング用UV点滅を送達するために使用されているように、白い紙は、システムの実行中にレーザ走査パターンを観察するために下に置くことができます。 </li></ol> 3。スライス潅流を設定<ol><li>加圧された灌流システムはスライス室に記録ACSFを養うためにオンになっています。ケアは、チャンバー内のスライス上2.0mmの一定の流体レベルを確保するために取られる。 </li><li> MNI-ケージド-グルタミン酸のストック溶液のアリコートを0.2mMのケージドグルタミン酸の濃度をACSFを循環させる25ミリリットルに追加されます。実験の5-6時間後、浴溶液とMNI-グルタミン酸がリフレッシュされますのでご注意ください。 </li><li>脳切片は、記録室に移動されます。一つは、イメージングsを実行することができますスライスの品質をチェックして、解剖学的に一次体性感覚野を見つけるためystem。その後、スライスはカスタムメイド弦楽器プラチナリングで固定されています。記録のために意図された脳の領域の上にアンカーをかけないように注意してください。 </li></ol> 4。全細胞パッチクランプ記録<ol><li>ガラス電極（4-6MΩの抵抗）が細胞標識および形態学的同定には0.1％のビオシチンを含む内部溶液を引っ張られ、満たされている。 </li><li>パッチ記録を実行するには、細胞が60倍対物レンズで可視化する。抑制性細胞型が最初に同定され、蛍光/ DICオリンパス顕微鏡下でGFP発現の可視化に基づいて選択され;録音が続いて赤外線DICのビデオ監視によって助け視覚制御下で実行される。標的細胞に電極を接近しながら、DICと蛍光灯モードの切り替えの数回は、GFPセルの位置を確認する必要があることに注意してください。 </li><li&gt;は従来のパッチクランプ技術が適用されます。電極は正圧で満たされており、標的細胞膜時に識別可能なディンプルを確立するために近い細胞表面へ移動し、その後負圧が素早くギガシールを形成し、ビデオモニタに注入電流応答を監視しながら慣らすには適用されます。 </li><li>で破壊すると、DICと蛍光モード下60Xにあるセルの画像が上のオンライン検証のために取られています。光刺激データの収集前に、電流パルスを過分極と脱分極は、各セルの基本的な電気生理学的特性を調べるために注入される。 </li><li>一度安定した全細胞記録は良いアクセス抵抗（通常MΩ&lt;20）で達成されており、顕微鏡の対物レンズは60倍からレーザ走査光刺激が4xに切り替えられます。 4倍速でのスライス画像が取得され、光刺激のサイトを案内して登録するために使用されます。 </li></ol> 5。レーザーSCAnning光刺激<ol><li>光刺激やデータ収集パラメータが山なりの投球のコンフィギュレーションスイッチモジュールを活性化することによって設定されます。通常、1秒の刺激間隔と1ミリ秒レーザー（20 mW）を光刺激マッピングに使用されます。 10kHzでサンプリングされた1秒のデータ·トレースが取得される。 </li><li> 4xのスライス画像は山なりの投球のマッパーモジュールにロードされます。細胞体の位置が定義されており、16×16のパターン（80μmの×80μmの間隔）の光刺激部位は、すべての皮質層をカバーし、セルの位置の周りに設定されています。 </li><li>記録されたニューロンの励起プロファイルは電流クランプモードでの光刺激に応答して、スパイクの位置を調べることによってマップされています。上のラインの表示機能を備えた当社のユーザーフレンドリーなソフトウェアは、マッピング実験を容易にします。 </li><li>レーザーは異なるで走査しながら、ローカル興奮回路接続は記録細胞から興奮性シナプス後電流（EPSC）の検出によってマッピングされ場所。セルは内側興奮電流を検出する電圧クランプモードで-70 mVで開催されます。 EPSCマップは光刺激パターンの回転で2〜3回繰り返しまたは反転されています。 </li><li>オプション：ローカル抑制回路の接続にも外側に抑制電流を検出する電圧クランプモードで0に近いmVで開催された記録された細胞からの抑制性シナプス後電流（IPSC）の検出によってマップすることができます。 IPSCのマッピングのためのセシウムに置き換えカリウムと電極内部液を使用するのが最適であることに注意してください。 </li><li>全ての生理学的アッセイが完了した後、電極を優しく記録されたセルから削除されます。脳切片を取り出し、一晩4％パラホルムアルデヒド中で固定されています。記録された細胞は、ビオシチンに対して染色されている。細胞形態はまた、各記録セルは確かに当初目標GFP発現介在ニューロンであることを確認または共焦点落射蛍光顕微鏡で検査されています。 </li></ol> 6。 Photostimulatイオンデータ解析今回開発した方法論とソフトウェア実装11は生データマップで光刺激誘発シナプス事象の検出および測定に適用されます。図2に例示するように、色分けされたマップが記録されたニューロンへのシナプス入力のパターンを説明するために構築されています。 7。代表的な結果： 電気生理学的記録と光刺激マッピングの結果の例を図2に示します。特定の抑制性細胞の種類の対象と録音が知られている抑制性の細胞種でGFPを発現するトランスジェニックマウスを用いて実現されています。抑制性介在ニューロンの多様性を考えると、GFP発現の分析は、本質的な電気生理学的および形態学的特徴（図2A）は最終的な細胞タイプの分類に到着するように結合されます。図2B-Cは、レーザ走査光刺激がローカルcorticの広範なマッピングを可能にすることを示して単一の抑制性ニューロンへアル回路接続。生データマップを図2Cに示されている。直接アンケージング応答はデータ解析（図2C）から除外されます。定量的な入力マップは、色分けされた図2D-Fに示されている。例速いスパイク抑制性介在層4は、より深い層から強い興奮性シナプス入力（EPSCS）を受け取った。定義された皮質経路と細胞のシナプス入力の組織を関連付けることにより、我々は、大脳皮質の情報処理でその役割の可能性（例えば、フィードバックとフィードフォワード抑制）を推測することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig1.jpg" /> 図1。レーザ走査型光刺激のための一般的なシステムの計装。当社の全体的なシステムは、光刺激制御、ビデオイメージング、電気生理学的記録システムから構成されています。我々は以前に7,17を説明LSPは、システムの設計を採用しました。レーザーユニットは、355nmの紫外·ラスを生成するために使用されグルタミン酸アンケージングのためのER。レーザービームは、我々のシステムの光路を通って導かれる。レーザーが点滅し、短い期間（例えば、1から3ミリ）は電気光学変調器（すなわち、ポッケルスセル）と、メカニカルシャッタを使用することによって制御されます。レーザービームパワーは中性密度勾配ホイールで変調され、フォトダイオードへのカバーガラスのレーザ光のごく一部を流用して監視されています。レーザスキャニングシステムは、スキャンミラー、走査レンズ、チューブレンズ、対物レンズのXYのペアが含まれています。ミラーはスキャンレンズを通してレーザービームを実現してから、ビームは、ダイクロイックミラーを介して顕微鏡に入り、カスタムメイドのUV透過チューブレンズにより集光される。ビームは軸方向の解像度を減らすことによって、可能な限り二次元のようなマッピングを維持し、より円柱状（円錐形としてではなく）照射ビームを提供するために、顕微鏡の対物レンズの背面開口部をアンダーフィル。 4xの目的の下で、レーザビームはアンケージングスポット、各approximatiを形成ngの焦点面（挿入を参照）で横方向に153μmの幅を持つガウス分布。ミラーと客観の背面開口部は、対物レンズ焦点面に異なるスキャン位置にミラー位置を翻訳し、共役平面にあるように、様々なレーザー刺激の位置は、ガルバノメータ駆動型XY走査ミラーによって達成することができます。アンケージング中に、フィールド全体を覆っているパターン化されたサイトの数が可変は最近刺激を受けた部位の近傍を再訪避けるためnonraster、非ランダムシーケンスで順次刺激される。詳細情報については、Xu ら （2010）を参照してください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig2.jpg" /> 図2。マウス一次感覚皮質の層4におけるGFP発現速いスパイク介在ニューロンへの興奮性局所回路の接続をマッピングし 、A1、A2は60倍で、標的細胞のDICとGFP蛍光の画像を表示生きている脳切片における客観的、A3はポスト記録、固定スライス内ビオシチン染色により明らかになった細胞形態を示している。 A4は異なる強度のintrasomatic電流注入に応答して、速いスパイク抑制性介在ニューロンの特性、記録されたGFPの細胞の発火パターンを示しています。 B 16×16光刺激のサイト（*）が重畳されたスライス画像を表示します。セルの位置は、小さな赤い丸で示されます。 Cは、細胞を内側に興奮性電流を検出するために-70 mVに保持しながら、Bに示すように、刺激の場所から光刺激誘発応答トレースの配列を示しています。光刺激応答の異なる形式が拡張され、別々に挿入に示されている1と2の位置でトレースで示されている。トレース1は、細胞体と樹状突起上promximalアンケージンググルタミン酸に直接応答の例（赤い矢印で示されている）です。 2の他のトレースは、興奮性シナプスでの典型的な例です応答（青）をつけて下さい。ダイレクトレスポンスとシナプス入力は、振幅と応答待ち時間によって区別す​​ることができる。生データは、Cでそれぞれの平均入力振幅を示したマップは、D、E、Fは、それぞれ、平均EPSC振幅、EPSC番号、サイトごとに最初に検出されたEPSC待ち時間の色分けされたマップ（16×16サイト）です刺激部位は、同じサイトの光刺激応答から減算基線自発的な応答で、分析ウィンドウ内EPSCSの平均振幅である。 EPSCSとサイトごとに最初に検出されたEPSCの到着時間や待ち時間の数も測定してプロットされます。詳細については、（Shi ら 、2010）を参照してください。

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	<li>Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology:+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature. 9, 557-568 (2008).</li><li>Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system.">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nature. 5, 793-807 (2004).</li><li>Xu, X., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+specificity+of+functional+input+to+distinct+types+of+inhibitory+cortical+neurons.">Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 70-85 (2009).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons:+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells.">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li><li>Dantzker, J. L., Callaway, E. 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D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+and+fast+functional+mapping+of+cortical+circuitry+through+a+combination+of+voltage+sensitive+dye+imaging+and+laser+scanning+photostimulation.">High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation.</a> J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. 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S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression.">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).</li><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+fast-spiking+cells+induces+gamma+rhythm+and+controls+sensory+responses.">Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses.</a> Nature. 459, 663-667 (2009).</li><li>Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+columnar+organization+of+ascending+excitatory+projections+to+layer+2/3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex.">Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex.</a> J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

光刺激ベースのマッピング技術が効果的に皮質の回路を解析するために適用されています。多くの異なる場所でのシナプス前ニューロンのクラスターの光刺激によるシナプス後ニューロンからの同時記録が興奮の空間分布の定量的尺度を提供するため、全細胞記録と組み合わせるレーザ走査光刺激は、単一のニューロンへのシナプス前の入力ソースの層分布の高分解能マッピングが可能また?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>トランスジェニックマウス系統</td><td>ジャクソンラボや他の情報源</td><td></td><td> Xuさんとキャロウェイ（2009）を参照してください</td></tr><tr><td> GFPのゴーグル</td><td> BLS（株）、ハンガリー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカシステムズ</td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> MNIケージドグルタミン酸（4 - メトキシ-7 - nitroindolinyl-ケージL-グルタミン酸） </td><td>バイオサイエンスTocris、エリスビル、ミズーリ</td><td>カタログ番号1490 </td><td></td></tr><tr><td>ビオシチン</td><td></td><td> B4261 </td><td></td></tr><tr><td>電極プラー</td><td>サッター楽器、ノヴァト、カリフォルニア</td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td>電極を作るためのガラス管</td><td&gt; </td><td> BF150-86から10 </td><td></td></tr><tr><td> 700BアンプをMulticlamp </td><td> Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール</td><td> Multiclamp 700B </td><td></td></tr><tr><td>デジタルCCDカメラ</td><td> Q-イメージング、オースティン、テキサス州</td><td> Retiga 2000 </td><td></td></tr><tr><td>リサーチ顕微鏡</td><td>オリンパス、東京、日本</td><td> BW51X </td><td></td></tr><tr><td> UVレーザユニット</td><td> DPSSレーザー、カリフォルニア州サンタクララ</td><td>モデル3501 </td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査phostimulation他の機器</td><td></td><td></td><td> Xu らを参照してください。（2010） </td></tr></tbody></table>ソリューション： <ul><li>スクロース含有スライス切断用人工脳脊髄液（ACSF）（mMで：85のNaCl、75スクロース、2.5のKCl、25グルコース、1.25のNaH 2 PO 4、4のMgCl 2、0.5 CaCl 2、および24のNaHCO 3）。 </lI&gt; <li>記録ACSF（mMで：126のNaCl、2.5 KClを、26のNaHCO 3、2のCaCl 2、2のMgCl 2、1.25のNaH 2 PO 4、10グルコース） </li><li>電極内部液（mMで：126 K-グルコン酸、4のKCl、10mMのHEPES、4 ATP-Mgの、0.3 GTP-Na、および10クレアチンリン酸、pHは7.2、300 mOsm）。 </li></ul>

mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation

抑制性ニューロンは皮質機能に不可欠である。彼らは、全体の大脳皮質の神経人口の約20％を構成し、さらに1月4日 、その免疫化学的、形態学的および生理学的特性に基づいて多様なサブタイプに細分化することができます。以前の研究では、抑制性ニューロンの個々のタイプの固有の特性についてはあまり明らかになってきたが、地元の回路接続に関する知識はまだ3,5,6比較的限られている。個々のニューロンの機能は皮質回路内での興奮性と抑制性シナプス入力によって形作られていることを考えると、我々は特定の抑制性細胞型へのマップローカル回線接続にレーザースキャニング光刺激（LSP）を使用してきました。従来の電気刺激やグルタミン酸パフ刺激に比べて、LSPは個別に記録されたニューロン3,7-9への広範なマッピングおよびローカル機能入力の定量分析を可能にするユニークな利点を持っています。レーザー写真グルタミン酸アンケージング経由刺激が選択的に通過またはサブ層マッピング分解能を保証遠位樹状突起、軸索を活性化することなく、perisomaticallyニューロンを活性化する。広い地域に比べて多くの刺激部位からの入力をマッピングするためのLSPsの感度と効率がよく皮質回路解析に適しています。 ここでは、地元の抑制回路マッピングするためのクランプホールセルパッチと組み合わせたLSPsのテクニックをご紹介します。標的細胞の種類と記録された細胞型の明確な同定の一貫したサンプリングを可能にする特異的な阻害細胞タイプの標的録音皮質3,10の限られた抑制性ニューロン集団における緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するトランスジェニックマウスを使用することによって促進され、 。 LSPは、マッピングのように、我々は、システム装置の概要を説明実験の手順及びデータ収集を説明し、マウス初代somatoseにおける回路マッピングの現在の例nsory皮質。我々の実験で示されているように、かごに入れられたグルタミン酸は、UVレーザー光分解による脳切片の空間的に限定された領域で活性化され、同時に電圧クランプ記録は、光刺激誘発シナプス応答の検出を可能にする。標的ニューロンへの興奮性または抑制性シナプス入力のどちらかのマップは、潜在的なシナプス前の数百のサイトを促進するために、レーザビームを走査することによって生成されます。したがって、LSPは繰り返し実験を通じて抑制性神経細胞の特定の種類に当たるシナプス入力の詳細な地図の構築を可能にします。一緒になって、光刺激ベースの手法は、神経科学者の大脳皮質の局所回路の機能的な組織を決定するための強力なツールを提供しています。

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Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

本稿では、限られた抑制性ニューロン集団でGFPを発現するトランスジェニックマウスにおける細胞全体の録音でレーザ走査光刺激を組み合わせたアプローチを紹介します。手法は特異的な阻害皮質ニューロンの局所シナプス回路の広範なマッピングと定量分析が可能になります。

レーザースキャニングの光刺激によって抑制神経回路のマッピング

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

mapping-inhibitory-neuronal-circuits-laser-scanning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K ビュー.  University of California, Irvine. 本稿では、限られた抑制性ニューロン集団でGFPを発現するトランスジェニックマウスにおける細胞全体の録音でレーザ走査光刺激を組み合わせたアプローチを紹介します。手法は特異的な阻害皮質ニューロンの局所シナプス回路の広範なマッピングと定量分析が可能になります。

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Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

神経科学

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire of dynamical motifs, which underlie most diverse brain functions, can emerge out of a fixed topological and modular organization of brain circuits. Compared to in vivo studies of neuronal circuits which present intrinsic experimental difficulties, in vitro preparations offer a much larger possibility to manipulate and probe the structural, dynamical and chemical properties of experimental neuronal systems. This work describes an in vitro experimental methodology which allows growing of modular networks composed by spatially distinct, functionally interconnected neuronal assemblies. The protocol allows controlling the two-dimensional (2D) architecture of the neuronal network at different levels of topological complexity.
A desired network patterning can be achieved both on regular cover slips and substrate embedded micro electrode arrays. Micromachined structures are embossed on a silicon wafer and used to create biocompatible polymeric stencils, which incorporate the negative features of the desired network architecture. The stencils are placed on the culturing substrates during the surface coating procedure with a molecular layer for promoting cellular adhesion. After removal of the stencils, neurons are plated and they spontaneously redirected to the coated areas. By decreasing the inter-compartment distance, it is possible to obtain either isolated or interconnected neuronal circuits. To promote cell survival, cells are co-cultured with a supporting neuronal network which is located at the periphery of the culture dish. Electrophysiological and optical recordings of the activity of modular networks obtained respectively by using substrate embedded micro electrode arrays and calcium imaging are presented. While each module shows spontaneous global synchronizations, the occurrence of inter-module synchronization is regulated by the density of connection among the circuits.

This manuscript describes a protocol to grow in vitro modular networks consisting of spatially confined, functionally inter-connected neuronal circuits. A polymeric mask is used to pattern a protein layer to promote cellular adhesion over the culturing substrate. Plated neurons grow on coated areas establishing spontaneous connections and exhibiting electrophysiological activity.

デザイン、治療、セルラーめっき、機能的に相互接続された回路で構成モジュラー神経回路網の培養表面

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

ニューロン回路の再学習：速い神経突起伸長と機能的ニューロン結合の新しい方法

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

慢性的な経頭蓋電気刺激およびラットの皮質内の記録

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

行動するマウスにおける海馬シータ振動の光同調

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

生体内ニューロン回路接続を模倣するためのインビトロウェッジスライスの準備

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.