シリコンマスターモールドの作製 リソグラフィー 材料： <ul><li> 75mmのシリコンウェーハ</li><li> SU - 8 2ネガ型​​フォトレジスト（マイクロケム、ボストン、MA） </li><li> N2 </li></ul>方法： <ol><li> 2時間120℃でSiウェハを脱水する。 </li><li>有機物を除去するために7分間UVオゾンの御馳走の表面。 </li><li> N2ブローの表面には微粒子を除去する。 </li><li>表面の70％（75 mmウェーハ用〜10 mL）をカバーするためにSU - 8 2を適用します。 </li><li> 300回転/ sの加速度で20秒間2000rpmでスピン。 </li><li> 95℃に室温からホットプレートとランプにウェハを配置</li><li> 95℃で15分間フォトレジストをSoftbake℃に</li><li>洪水は、20のウェハを公開 - 25 mJ/cm2用量を365 nmの（I -ライン）で底層を形成する。 </li><li>第2フォトレジスト層のためのSU - 8 2を適用します。 </li><li>約11μmの厚さのフィルムを300rpm / sの加速度で20秒間で550 rpmでスピン。 </li><li> 65℃に室温からホットプレートとランプにウェハを配置</li><li> ℃で5分間65℃ウエハをSoftbake。 </li><li> 65からホットプレートをランプ℃〜95℃である。 </li><li> 95℃で55分間ウェーハをSoftbake℃に</li><li> 20分間室温に冷却ウェハ。 </li><li>ウェーハ上mPADマスクの位置を合わせ、95用に公開 - 波長365nm（i線）、100 mJ/cm2用量を。 </li><li> 95℃に室温からホットプレートとランプにウェハを配置</li><li>暴露後95℃で25分間、フォトレジストを焼く℃に</li></ol>開発 材料： <ul><li> 100ミリメートルのガラスの皿（5） </li><li>プロピレングリコールメチルエーテルアセテート（PGMEA） </li><li>イソプロパノール（IPA） </li><li> N2 </li></ul>方法： <ol><li>化学フードでは、PGMEA（2）、IPA、及びヘキサン（2）5つの料理を埋める。 </li><li> 10秒第1回PGMEAでウェハを保持する</li><li> 50秒のためのウェハを攪拌</li><li> PGMEAのメニスカスを伴う第2 PGMEAにウェハを転送する。 </li><li> 5秒間振とうする。 </li><li> PGMEAのメニスカスにIPAにウェハを転送する。 </li><li> 20秒間振とうする。 </li><li>第一IPAにウェハを転送する。 </li><li> 5秒間振とうする。 </li><li>第二IPAにウェハを転送する。 </li><li> 5秒間振とうする。 </li><li>すぐにIPAのメニスカスで第二IPAからウェーハを削除し、N2で乾燥</li><li>パターンを検査する。 </li><li> 120℃14〜20時間、クロスリンクSU - 8でHardbakeウエハ。 </li><li>ダイヤモンドカッターでウェハをダイシング</li><li>エポキシを使用してスライドガラス上にウェーハをマウントします。 </li><li> （複製の成形の手順を参照）ウェハをFluorosilanize </li></ol> mPADSの複製成形 負のモールド 材料： <ul><li>ボートの重量を量る使い捨てアルミ</li><li>ポリジメチルシロキサン（PDMS）ベース＆硬化剤（ダウ、ミッドランド、MI） </li><li>黒人</li><li>シラン：（トリデカフルオロ-1,1,2,2 - tetrahyrooctyl）-1 - トリクロロシラン</li><li>ガラススライド</li><li>ガラスパスツールピペット</li></ul>方法： <ol><li>気泡を除去するために1時間、真空下での重量とドガによるPDMS 10:1混ぜる。 </li><li>アルミボートでのシリコンのマスターの金型を置きます。 </li><li> 50注ぐ - アルミボートでのマスターモールド上にPDMSの60gを。 </li><li>気泡を除去するために30分間真空下で脱気する。 </li><li> N2の迅速な爆発とPDMSの表面の気泡を吹き飛ばす。 </li><li> 110対流のオーブンの場所のボートは、℃で15分間、PDMSは、会社になるまで。 </li><li>アルミボートを切り取る。 </li><li>黒人で、シリコンマスターの下にPDMSを切り落とす。 </li><li> PDMSピール離れてシリコンマスターからゆっくりとマスターを破壊してしまうのを避けるために、一方向に一定の動きで。 </li><li>損傷のためのシリコンのマスターを点検。 </li><li> 4個に否定的な金型を切り取ります。 </li><li>否定的な金型の大規模なバッチ1〜10の手順を繰り返します。 </li><li>酸素プラズマは、表面を活性化するために1.5分のための否定的な金型を扱う、または</li><li>オゾンは、表面を活性化するために10分間負の金型を扱う。 </li><li>露出mPAD機能付きデシケーターに否定的な金型を置きます。 </li><li>デシケーターの中央にスライドガラス上にシランの250から500μLを広げる</li><li>デシケーター内部の先端のシランの150〜200μlのある場所のガラスの牧草地のピペット。 </li><li> &gt; 14時間のためにシランとコート負の金型を蒸発させる真空チャンバー。 </li></ol> mPADS 材料： <ul><li>ポリジメチルシロキサン（PDMS）ベース＆硬化剤（ダウ、ミッドランド、MI） </li><li>広口使い捨てトランスファーピペット</li><li> 2&quot;× 3&quot;ガラスのスライド</li><li>ガラススクライブ</li><li> N2 </li></ul>方法： <ol><li>気泡を除去するために1時間、真空下での重量とドガによるPDMS 10:1混ぜる。 </li><li> &quot;クロス&quot;にシラン負の金型を締める</li><li>ピペットPDMSは、負の鋳型に機能が完全に1mmの厚さに覆われているように。 </li><li>表面に上昇するとPDMSで、気泡のための30分待ちます。&lt;/ LI&gt; <li> 30&#39;ダウンタイムで、N2の流れで埃22x22mm（2号）ガラス製カバースリップ。 </li><li>酸素プラズマは、ガラスをきれいにし、アクティブにするには1.5分のためのガラススライドの半分を扱う</li><li> N2の迅速な爆発とPDMSの表面の気泡を吹き飛ばす。 </li><li>静かにPDMSをプラズマ対向洗浄面にPDMSにガラスカバースリップの端を置く。ゆっくりPDMS完全に接触するように全体のガラス面をスライドガラスを下げ、ガラスのスライドの下に挟ま気泡を避ける。 </li><li>場所は、20時間℃で完全に治すために110対流式オーブンで金型を組み立てる。 </li><li>オーブンから型を削除し、RTにそれらを冷ます。 </li><li>離れてトップとゆっくりと皮負で片手mPADを解放するために底部からの否定的な金型でガラススライドをホールド。 </li><li>折りたたまれた記事のための顕微鏡下でmPADを検査する。 </li><li>プラズマとシラン個置き鋳物を経由して再silanizeモールド。良いレプリケーション用の負の金型の寿命は約60から20のキャストです。 </li></ol> mPADS上に播種細胞 スタンピング 材料： <ul><li> UCPのためのPDMSスタンプ（ティッシュエンジニアリングの手法でティエン、J＆チェン、CS、、2001、頁113から120を参照してください。） </li><li>エタノール（100％、70％） </li><li>滅菌脱イオン水</li><li>滅菌脱イオン水で50 ug / mlとヒトフィブロネクチン（BD Biosciences社） </li><li> 5 ug / mlとDIIのソリューションは、0.2μmの膜（D - 3886、Molecular Probes社、OR）でろ過</li><li> 2パーセントプルロニックF127（BASF、マウントオリーブ、ニュージャージー州） </li><li> 1Xリン酸緩衝液。 </li><li> 100ミリメートルXの25ミリメートルのシャーレ（4） </li><li> 150 × 25ミリメートルペトリ皿（2） </li><li>アルミ箔</li><li> N2 </li><li>ピンセット</li><li>無菌フード</li></ul>方法： <ol><li> mPADsからトリム過剰PDMS </li><li> PDMSスタンプが以前に使用されている場合は、夾雑タンパク質を離れてスクラブする5分間100％エタノールでスタンプを超音波で分解する。 </li><li>無菌フードでは、新鮮な100％エタノールと滅菌水でスタンプを浸漬した後、ピンセットとN2で乾燥して、その両側にスタンプを保持する</li><li>側を上に働くと150ミリメートルのペトリ皿の場所。 </li><li>アリコートを各スタンプにフィブロネクチンソリューションの滴。最後にして切手の各コーナー、エッジ、および内陸部で始まります。最初にタイムスタンプのPDMSの表面は疎水性であるが、タンパク質が吸着される親水性になる。フィブロネクチン溶液の少量生産が完全にコートスタンプに必要とされるように変更PDMSの接触角&quot;OutsideからInside&quot;の作業。 </li><li>タンパク質吸着用フードで1時間放置します。 </li><li>皿に注ぐと、スタンプ上の水位の上昇をできるようにすることで、DI水でスタンプを洗ってください。 </li><li> DI水で満たされた100ミリメートルのペトリ皿にスタンプを洗ってください。 </li><li>削除し、N2で乾燥させます。 </li><li>オゾンは、スタンプのために表面を活性化するために7分間mPADSを扱います。 </li><li>ボンネットの下に、mPADにスタンプのエッジを置き、静かに完全に接触するために下げることによってmPADSをスタンプ。軽くすべての領域が良好な接触を持って確保するためにピンセットで切手の上部をタップするだけの記事を折りたたむしないように注意してください。 </li><li>慎重にピンセットでスタンプを削除します。 </li><li> 〜15秒間100％のエタノールでは、100mmのペトリ皿で​​水没のmPADS。料理との間で迅速に転送することにより、転送中にディウェッティングによるマイクロニードルを保つ。 </li><li> 〜15秒間、70％エタノールで100ミリメートルペトリ皿の中で水没のmPADS。 </li><li> 〜15秒のためのDI水では、100mmのペトリ皿で​​水没のmPADS。 </li><li> 〜15秒のための純水で2番目の100ミリメートルペトリ皿の中で水没のmPADS。 </li><li>純水で150ミリメートルのペトリ皿で​​水没のmPADS。 </li><li> DIIの溶液100 mLで150ミリメートルペトリ皿の中で水没のmPADS。 </li><li>アルミ箔で覆い、1時間浸す。 </li><li> 〜15秒のためのDI水では、100mmのペトリ皿で​​水没のmPADS。 </li><li> 2％プルロニック10mlと0.2％プルロニックの総濃度のPBS 90 mLで150ミリメートルペトリ皿の中で水没のmPADS。 </li><li>表紙と1時間浸す。 </li><li> 〜15秒のためのDI水では、100mmのペトリ皿で​​水没のmPADS。 </li><li> 〜15秒のための純水で2番目の100ミリメートルペトリ皿の中で水没のmPADS。 </li><li> 〜15秒のためのPBSで3位100ミリメートルペトリ皿の中で水没のmPADS。 </li></ol>種まき 材料： <ul><li>選択された細胞株</li><li>トリプシン- EDTA（EDTA•4NA、ギブコの猫と、0.25％トリプシン号25200〜056） </li><li>成長中</li><li> 1Xリン酸緩衝液。 </li></ul>方法： <ol><li>無菌フードが100mmのペトリ皿の場所のmPADSと、17 mLの培地を詰めます。 </li><li> 37 ° Cを温めるためにインキュベーターにペトリ皿を置き、 </li><li>トリプシンで細胞を懸濁し</li><li>細胞のクラスターを分割することを繰り返し吸引する。 </li><li> mPADS付きペトリ皿にピペットで細胞懸濁液。彼らは分析の時点で、単一の細胞（細胞間接触せずに）残るようなセルを追加します。追加するセルの正確な量は、細胞型特異的であり、細胞の拡散領域と成長率に依存します。 </li><li>静かにゆっくりとpippettingとペトリディッシュ内の細胞を分散させる。 </li><li>細胞が沈殿し、マイクロニードルに付着できるようにするために2時間インキュベーター内の場所。 </li><li>細胞が拡がっているかどうかを確認するmPADSを点検。細胞は扁平に見えるし、6以上の投稿をまたがる予定。 </li><li>細胞が散在している場合は、新鮮な培地21 mLで新しい100ミリメートルペトリ皿にmPADSを転送する。 </li><li> mPADSは、実験の準備ができている。 </li></ol> mPADSを染色し、マウント 固定 材料： <ul><li>脱イオン水</li><li> Paraformeldahyde（16％）バイアル</li><li> 10Xリン酸緩衝液。 </li><li> 1Xリン酸緩衝液。 </li></ul>方法： <ol><li> 50mLの遠沈管に、DIの30mLを、paraformeldahyde 10 mLの（全体のバイアル）、および固定液のための10 × PBS 4.5 mLを加える。 </li><li> 100ミリメートルペトリ皿にソリューションを固定する〜25 mLを加え。 </li><li>ゆっくりと水没は皿を固定に細胞とmPADと20分間インキュベートすることができます。 </li><li> 1X PBSで3回100 mmディッシュで水没のmPADS。 </li><li>免疫染色してマウントするための準備。 </li></ol> mPADSで携帯軍の分析 共焦点像 材料： <ul><li>共焦点顕微鏡</li><li> 63X対物</li><li>二次抗体のフィルターキューブ</li><li>マイクロニードルのDIIイメージングのためのグリーンフィルタキューブ（ローダミン）。 </li></ul>方法： <ol><li>場所のステージ上でmPADsと300ミリ秒の露光で、単一の細胞を見つけること、ないビニング。 </li><li> TOP IMAGEのためのマイクロニードルの画像のトップス。 </li><li> Z -制御の読み出しを使用して、下の画像のためのマイクロニードルのイメージをキャプチャします。 </li><li>画像はの汚れ（ヘキスト、ファロイジンなど）を持つ他のチャンネルを</li></ol>画像解析 材料： <ul><li> Image Processing ToolboxにあるMATLAB </li></ul>方法： <ol><li>上部と下部の画像を回転して登録</li><li>底面の重心（undeflected）と上部（偏向）の位置を測定</li><li>変位を計算する</li><li>投稿（知られている、後のジオメトリに依存する）のためのばね定数を使用して、各ポストに力のベクトルを計算する</li><li>エラーの分析は、力を解決する能力に基づいており、画像の解像度と重心検出の分解能に依存しています</li><li>さまざまな条件等を介してなど、力の大きさ及び/または方向、時間の経過として、多くの測定 - あなたのカスタマイズされたニーズに従ってデータを整理</li></ol>

<ol>
	<li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D., Gray, D. S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 100, 1484-1489 (2003).</li><li>Sniadecki, N. J., Chen, C. S., Wang, Y. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Silicone+Elastomeric+Post+Arrays+for+Measuring+Traction+Forces+of+Adherent+Cells.">Microfabricated Silicone Elastomeric Post Arrays for Measuring Traction Forces of Adherent Cells.</a> Methods in Cell Biology - Cell Mechanics. 83, 313-328 (2007).</li><li>Lemmon, C. A., Sniadecki, N. J., Ruiz, S. A., Tan, J. T., Romer, L. H., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface:+Enhanced+Analysis+For+Microfabricated+Post+Array+Detectors.">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis For Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mechanics &amp; Chemistry of Biosystems. 2, 1-16 (2005).</li></ol>

microfabricated post-array-detectors (mpads): an approach to isolate mechanical forces

このビデオでは、我々は、投稿の微細加工の配列を使用して細胞牽引力を測定するために我々のアプローチを紹介します。牽引力は、ミオシン - アクチンの相互作用を通して生成され、私たちの生理機能に重要な役割を果たしています。開発中に、彼らは、細胞が組織の初期構造を形成する1つの場所から順番に次のに移動することができます。牽引力は治癒のプロセスに役立つ。彼らは傷の適切な閉鎖または私達の体を介して移行し、白血球のクロールに必要です。これらの同じ力は、癌の転移や腫瘍に向かって血管の成長の場合には私たちの健康に有害であることができる。 in vitroで細胞を研究するために使用される、最も一般的な方法は、ガラスまたはポリスチレン皿を使用してきました。しかし、基板の剛性は、それが不可能な物理的に細胞の牽引力を測定すること、および牽引力を研究するために、比較的少数の方法があります。私たちの研究室では、これらの制限を克服する技術を開発しました。方法は、柔軟なカンチレバーの垂直配列、個々の細胞は多くのカンチレバーに分散し、その過程で、それらを偏向するようであるの剛性とサイズのスケールに基づいています。我々が使用する柱は、10μmの高さ、直径3μmの、であり、および9μmの中心間距離との定期的な配列で構成されています。しかし、これらの物理的な寸法は、容易に様々な研究に対応するために変化させることができます。我々は、シリコンのマスターで始まりますが、最後のポストは、ポリ（ジメチルシロキサン）、またはPDMSと呼ばれるシリコーンゴムから作られています。我々は、顕微鏡下でたわみを測定し、観測された変形を作成するために必要な牽引力の大きさと方向を計算することができます。我々は、これらのポストアレイディテクタ微細加工基板、またはmPADsを呼び出します。ここで、我々は細胞の収縮性の変調を評価するためにmPADsを作製および使用方法を説明します。

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Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

このビデオでは、我々は細胞の収縮性の変調を評価するための微細加工後のアレイ検出器を（mPADs）の製造と利用する方法を示しています。

微細加工後のアレイ検出器（mPADs）：機械的な力を単離するためのアプローチ

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

microfabricated-post-array-detectors-mpads-an-approach-to-isolate

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

12.4K ビュー.  University of Pennsylvania. このビデオでは、我々は細胞の収縮性の変調を評価するための微細加工後のアレイ検出器を（mPADs）の製造と利用する方法を示しています。

ビデオ: Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

診断ツールを開発するマイクロエレクト​​ロメカニカルシステム（MEMS）の使用

生物学

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

アン EX - OVO</emイメージングとマイクロサーアプリケーションに適して>ニワトリ胚培養システム

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

アン in vivoで</emからのタンパク質複合体を分離するために>架橋アプローチショウジョウバエ胚

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM分析のための低細胞数とサンプル調製のための代替的アプローチ

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

磁気ビーズを使用した機械的張力に応答して細胞表面接着リフォームの分析

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

突起力顕微鏡: 細胞突起が開発した力を定量化する方法

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

マウスから脳ペリサイトを分離する高出力法

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...