心血管の機能不全は、世界中の主要な死因です。我々がここに提示する孤立した心臓モデルは、ヒト心臓ダイナミクスへの実験的な窓として役立つ。このアプローチは、古典的な電気生理学の研究と膜貫通電圧と細胞間カルシウムの同時光学マッピングを組み合わせて心臓の状態を評価する。
この方法論は、疾患のモデル化、薬理学、および毒物学の研究に適用することができます。例えば、私たちの焦点の分野の1つは、心臓電気生理学に対するガラスサイザーの影響を特徴付けるものです。この方法論は、より小さな動物モデルを利用するプロトコルよりも技術的に難しいですが、全体的に、プロトコルはすべての部分が整ったら比較的簡単です。
イメージングおよび灌流システムのすべてのコンポーネントをテキストで記述することは困難であるため、このプロセスの視覚的なデモンストレーションは、準備の成功を実現するのに役立ちます。上昇大オルタをそのままに心臓を隔離した後、切除された器官を氷冷心プレギアに突っ込み、止結して大間の壁をつかむ。心臓の上に約95センチメートルを吊るされた氷冷心プレギア培地の1リットルに接続されたチューブに取り付けられたリブ付きカニューレに容器を滑り込ませます。
容器が溢れるまで液体が大腸を満たし、気泡が脈管構造に入るのを防ぎ、臍帯テープを使用して大腸をカニューレに固定します。止まり小屋を結んでカニューレから吊り下げる心臓の重さを負い、組織をさらに固定し、冷たい媒体が重力によって70ミリメートルの水銀の一定の圧力で心臓を逆行できるようにします。カニューレに空気を入れずに37°Cランゲンドルフシステムに音を伝えます。
そして、正常な大線のリズムが残っている血液および心筋の脈管を洗い流すことを可能にする。ショック可能な不整脈の場合、心臓の頂点と基部に外部パドルを置いて臓器を除細させ、5ジュールで単一の衝撃を与え、50ジュール、カーディオバージョン、またはショック不可能なリズムまで5ジュール単位で増加する。次に、少なくとも1リットルの修飾クレブス・ヘンセレイト培地で心臓を再循環することなく洗い流し、残留血液および心胸筋を除去する。
培地が心臓を通って透明に走るとき、循環ループを閉じてパーフューズを再循環させる。研究の過程を通してECGへの標準的なリードを記録するには、頂点近くの心室心外膜に29ゲージの針電極を取り付け、右心房に別の電極を取り付けます。差動バイオアンプの正と負の入力をそれぞれ頂点と右心房に接続し、右心房に1つのバイポーラ刺激電極を取り付け、2番目のバイポーラ刺激電極をペーシング目的で左右左心室に取り付けます。
初期電流を拡張期閾値の2倍、パルス幅を1ミリ秒に設定して、電気生理学刺激装置を使用して心臓をペースします。ペーシングの閾値を特定するには、一貫した刺激応答を確保するために、定義されたペーシングサイクル長さで1ミリ秒のパルス幅を持つ一連の1〜2ミリアンペア刺激インパルスを適用します。S1、S1、S1、S2ペーシングトレインを使用して、余分な刺激ペーシングを実行します。
ペーシングがキャプチャーに失敗するまで、S2ペーシング・サイクルの長さを段階的に10ミリ秒短縮します。次に、ペースサイクルの長さを最後から 2 番目に長くして、サイクル長を 1 ミリ秒間隔で短くして、キャプチャを失う前に最も正確なペーシング サイクル長を決定します。心室有効難治期間を確立するために、S2早期拍動が心室脱分極を開始する最短S1、S2間隔を特定するために、左心室の側側に刺激電極を使用する。
Wenckebach サイクル長を定義するには、右心房の刺激電極を使用して、通常の伝導経路を介して 1 対 1 の房室伝導が伝播する最短 S1、S1 間隔を見つけます。正位ノードの回復時間を定義するには、右心房の刺激電極を使用してS1、S1ペーシングトレインを適用し、ペーシングトレインの最後のインパルスと自発的な正局ノード媒介活動の回復との間の時間遅延を測定します。房室ノード有効耐火期間を確立するには、右心房の刺激電極を使用します。
早期の心房刺激が続く最短のS1、S2カップリング間隔に続いて、QRS複合体を引き起こすヒスバンド電位が見つかります。膜貫通電圧と細胞内カルシウムの光学マッピングでは、まず、調製した新しい電圧色素を大動脈カニューレに近い5ミリリットルまでゆっくりと加え、次いで調製したカルシウム色素をゆっくりと添加します。次に、イメージングハードウェアを適切な視野に焦点を合わせ、カメラをワークステーションに接続します。
選択したソフトウェアを使用して、5~2ミリ秒の露光時間で画像を取得します。また、目的の領域を分割してオーバーレイし、グレースケールの減算または疑似色の加算をハイライトのミスアライメントに表示できるソフトウェアの助けを借りて、画像のアライメントを実行します。周囲の照明を最小限に抑えた状態で、LEDライトをテストして、センサの深度によって決定される均一で最大の心外膜照明を確認します。
次に、左心室に配置された刺激電極を使用して、心座のリズム、心室細動、または動的ペーシング中に心筋を画像化し、ペーシングサイクルの長さを350ミリ秒から始め、10〜50ミリ秒減少して払戻曲線を生成します。実験全体を通して品質の光信号の取得を確認するには、ビデオファイルを開き、対象領域を選択し、時間の経過とともに平均蛍光をプロットします。実験の最後に、システムから心臓を取り出し、パーフューザを排出します。
次に、システムチューブとチャンバーを精製水で洗浄します。定期的なメンテナンスのために、必要に応じて定期的に洗剤溶液でシステムを洗いすります。これらの代表的な研究では、手順は、実体的なモデルで行われ、実証されているように、体重の2.5〜10.5キログラムと心臓体重の18〜137グラムのサイズの範囲であった。
孤立した心臓をランゲンドルフ系に移した後、心拍数は除細動の約10分以内に毎分約70拍に安定し、研究期間中一定のままである。平均流量は、通常、1分あたり約184ミリリットルの測定される。機械的なアンカプラを含む温かい媒体を温めた後、毎分70ミリリットルに減速する。
リード2 ECGは、脳波リズムの間、または電気生理学的パラメータを定量化するための外部ペーシングに応答して、研究の期間を通して記録することができる。光学マッピング実験は、心座のリズムと自発的な心室細動の間に行うこともできます。色素を装填した心臓の代表的な画像は、対応する光学的作用電位を有して得ることができる。
そしてカルシウム過渡性は、心外膜表面上の関心のある2つの領域から収集することができる。さらに、動的心筋ペーシングは、光マッピング実験中に使用して、固有の心拍数のわずかな違いを正規化することができます。生信号は、作用電位カルシウム過渡結合時間、活性化時間および持続時間、および電気およびカルシウムの払戻しを描写するために使用することができる。
泡が大腸に入ることを避け、動物から系への移動時間を最小限に抑え、より大きな心臓を支えることが重要である。電気生理学および光信号データは、取得後に解析することができる。さらに、心臓は、研究後に保存され、その後、神体、免疫染色、または遺伝子発現解析が可能です。
この技術を使用して、若年性心臓の発達を特徴付け、環境暴露が心臓生理学に及ぼす影響を調べています。動きを最小限に抑えるために使用される機械的なアンカプラとアルブミン泡立ちに対処するために使用される反泡化学物質は両方とも有毒であるため、適切な個人用保護具を使用することは絶対に不可欠です。
