NIHの助成金R01 HL085369、HL067322、HL082729、EB008999

1。準備<ol><li>焼きたてのTyrodes&quot;ソリューションを（MM、128.2塩化ナトリウム、1.3 CaCl 2で 、4.7のKCl、1.19のNaH 2 PO 4、1.05のMgCl 2、20.0飽和NaHCO 3、および11.1グルコースで）準備。ソリューションの毎日の準備を促進するために、事前に二つストック溶液を準備し、4でそれらを保存° C冷蔵庫：（1）ストックI（g/2Lで、374.6のNaCl、9.56のCaCl 2、17.52のKCl、8.21のNaH 2 PO 4 、10.67のMgCl 2）及び（2）ストックII（g/2Lで、84.01のNaHCO 3）。一つの実験を取るために十分なTyrodes&quot;ソリューションの2Lにするために証券私、証券IIの80mL、及びグルコースの4Gの80mLそれに脱イオン水と混合の1840mL。 </li><li>染料とuncouplersのストック溶液を準備します：（1）興奮収縮脱共役剤blebbistatinストック溶液（DMSOでTocrisバイオサイエンス、2mg/mLソリューション）、（2）膜電位感受性色素ジ-4 - ANEPPSのストック溶液（Invitrogen社、1mg/mL DMSO溶液）、（3）膜電位感受性色素RH 237ストック溶液（Invitrogen社、DMSOで1.25mg/mlソリューション）、（4）カルシウム指示薬rhodo -の異形2AMストック溶液（Invitrogen社、DMSOの1mg/ml溶液）。単一のウサギの実験では、di - 4 - ANEPPS原液、RH237ストック溶液30μL、およびrhodo -の異形2AMストック溶液を200μLの約30μLが必要です。繰り返し凍結融解を避けるために、我々は、-20℃でジ-4 - ANEPPS100μLのアリコートを保存する他の染料はまた、-20℃で保存されています+4℃の冷蔵庫中に溶解blebbistatinを保管してください。 </li><li>心臓を収穫する前に、2LボトルにTyrodes&quot;ソリューションを転送し、37℃で溶液温度を維持する水浴（フィッシャーサイエンティフィック）にそれを置く℃に5％CO 2 -溶液を95％O 2と酸素れている。 pHは、酸素のレベルを調整することによって7.35 ± 0.05に維持されている。ソリューションは、ランゲンドルフ灌流系で循環されており、ナイロンネットフィルター（孔径：11μm、ミリポア社）でフィルタリングされているカニューレの前に灌流ラインに配置された。 </li><li>心臓を収穫する前に、モニタリング機器を準備します。圧力トランスデューサ（WPI）は、実験時の大動脈圧を監視するために使用されます。心臓が灌流システムに接続されていないときに、圧力変換器のベースラインがゼロmmHgに調整されます。擬似ECG電極は、おおよそのリードI、II、およびアイントホーフェン三角形ECGのIIIにチャンバー内に配置されます。 </li></ol> 2。ウサギのハートの収穫と灌流<ol><li>ウサギの現像抑制剤のウサギを修正。ペントバルビタールナトリウム（50 mg / kg）を2000とUのヘパリンの静脈内注射によってウサギを安楽死させる。ウサギは痛み反射の欠如によって決定される、完全に安楽死の場合は、胸腔内がすぐに開かれ、心臓と肺を摘出されています。 </li><li>大動脈弓のすべての分岐の前に大動脈を昇順の上端で切断してください。上行大動脈から空気を洗い流すと、すぐに以前coronariesから空気を保つために非常に重要であるバブルトラッパーに添付されている16ゲージのカニューレに心をカニューレを挿入する。心臓が逆行非循環ランゲンドルフ灌流系で灌流されると、カットがすぐに心を開くようにしてください。 </li><li>血液が灌流によってフラッシュされている間、肺、気管、脂肪、および結合組織を削除します。 </li><li>非常に重要！シリコンチューブ（直径〜3cmの長い、と2mm）左心室（LV）に肺静脈および僧帽弁を通って挿入し、実験全体を通してそこに保持されます。このチューブは、LVの中に閉じ込めているソリューションを解放します。機械的に固定された心臓のLangedorff -灌流実験中の時間の循環することなく、それはLVのキャビティ内に重度の虚血を引き起こすと不整脈を生成する可能性があります。 </li><li>光学マッピング装置による循環ランゲンドルフ灌流システムへのカニューレと心を動かします。 </li></ol> 3。パノラマ光学マッピングシステムを用いて実験を行っ<ol><li>カスタムメイドの六角形のチャンバー内の中心を置き、灌流システムにカニューレを接続してください。血流ポンプの流量を調整することによって、60℃大動脈圧± 5 mmHgに維持する。私は擬似心電図リード監視。 7.35付近でのpHを維持± 0.05。 </li><li> blebbistatinはスペクトルの可視部分のUVおよびローエンド（450〜490 nm）を17でphotoinactivatedされているので、部屋のライトをオフにします。ゆっくりカニューレの上にある空気気泡トラッパーの注入ポートを介してblebbistatinストック溶液を注入する。徐々にすべてのボーラス注射用0.1ミリリットルblebbistatinを注入する。次の注入の前に安定させるために圧力を待ちます。 </li><li>穏やかにあなたの実験計画に特定の場所にペーシング電極を配置。 </li><li> 3から各フォトダイオードアレイ（PDA）の像面にある曇りガラスの心臓の画像をフォーカス均等に心臓を取り巻く角度は等間隔。すべての3つのPDAの視野で心臓を収めるために、カニューレと各PDAと心間の距離の位置を調整します。すりガラスの各焦点画像の写真を撮る。 </li><li>徐々に灌流液への空気バブルトラップの注入ポートを介して〜20μLジ-4 - ANEPPSストック溶液10を注入する。光学的記録を取る前に1〜3分間待ちます。 </li><li>最初のレコーディングの場合は、、緑のLEDの光を（なし励起フィルター、LEDフラッド、Lumileds社）をオンにカスタムメイドのデータ収集システムに接続された3つのPDAを、5から同時に光学録音を取ると、LEDライトをオフにしてください。すべての3つのPDAの異なる画素からの信号の品質を確認してください。光学的活動電位におけるモーションアーチファクトが気づいている場合、0.1〜0.2mlのblebbistatin原液を追加。信号対雑音比が低い場合は別の5μLジ-4 - ANEPPS原液を追加。 </li><li>機能的研究のために設計された実験プロトコルを終了します。信号が光退色またはウォッシュアウトによる実験中に悪化した場合、追加5μLジ-4 - ANEPPS原液で心臓を再染色。 </li><li>機能的研究の完了後に部屋のライトをオンにします。 36の等間隔の角度から心臓の写真を撮ります。これは、一つのPDAの位置に固定デジタルカメラで10 °のステップで心臓を回転させることによって達成されます。 </li><li>チャンバーの外心を取る。すべてのソリューションをドレインします。 DI水、70％試薬のアルコール、そして再び純水の順序で灌流システムを洗う。 </li><li>データ分析は、36のデジタル写真、再構築されたジオメトリの表面に光信号の登録、および活動電位持続時間（APD）の定量化、伝導速度（CV）、位相、等6から心臓形状の再構築が含まれ</li></ol> 4。デュアルマッピングシステムを用いて実験を行っ<ol><li> （パート2の後続行は）ガラス室（Radnoti）でカニューレ心を置き、灌流システムにカニューレを接続してください。心室心尖部および心房におけるチャンバーのシリコン底部に心臓を突き止める。 </li><li>部屋のライトをオフにします。ゆっくり心を固定化するために血流カニューレに注入する前のポートを介して（10μMに達するまで15〜20分）blebbistatinストック溶液を注入する。 </li><li>溶液表面の動きを減らすために心外膜面上に、プラスチック製のペトリ皿、または他のガラス窓のカバーを置く。 </li><li>ビューの同じフィールドでデュアルマッピングシステム（ウルティマ- L、SciMedia）二つのCMOSカメラをフォーカス。放出された蛍光は、ダイクロイックミラー（635カット、オメガオプティカル）で分離し、電圧信号用700nmのロングパスフィルター（Thorlabs）によって、カルシウムの信号用の30分の590 nmのバンドパスフィルタ（オメガオプティカル）によってフィルタリングされます。 </li><li>均一な照明を実現するために、ビューのマッピングのフィールドに向かって、2つのハロゲンランプ（SciMedia、コスタメサ、カリフォルニア州ニューポートオリエインスツルメンツ、ストラットフォード、コネチカット州）のライトガイドを目指しています。励起フィルター（40分の531 nmの、SemRock）が使用されています。 </li><li>注入ポートを介して膜電位感受性色素RH 237ストック溶液（10〜30μL）と心を染色。 </li><li>プルロニックF - 127（Invitrogen社、1:1混合物）とrhodo -の異形2AM（0.2mlの）ストック溶液を混ぜる。水浴のソニケーターで1分間超音波洗浄します。バブルトラッパーのポートを介して混合物を注入する。 rhodo -の異形2の脱エステル化は、マッピングの開始前に回答できるように、約20分間待ちます。 </li><li>つの録音の場合は、液の表面で動きを避けるために、灌流ポンプをオフにして、励起光源（ハロゲンランプ）の電源を入れてからデータ収集システム（ウルティマ- L、SciMedia）に接続されている両方のカメラを用いた光記録を取る、励起光をオフにし、そして灌流ポンプをオンにします。光信号の品質を確認してください。必要に応じて組織を再染色。 </li><li>研究用に設計された実験プロトコルの残りを完了します。 </li><li>部屋のライトをオンにし、ビューのフィールドを含む心臓の写真を撮る。チャンバーの外心を取る。すべてのソリューションをドレインします。 DI水、70％試薬のアルコール（フィッシャーサイエンティフィック）、および純水の順序で灌流システムを洗う。 </li><li>データ解析は、APD、CV、カルシウムトランジェント時間（CaTD）、APのアップストロークと猫の上昇、一過性カルシウムの立ち上がり時間、およびCATの崩壊のmonoexponentialフィットの時定数の間の遅延の測定値が含まれています。 </li></ol>代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig1.jpg" alt="図1"/> 図1代表的なパノラマの光学マッピングシステムを使用してランゲンドルフ灌流ウサギの実験の結果を。 （A）ウサギの心臓と三次元のメッシュグリッドの表面の形で再構成されたウサギの心臓の形状の前面像を。 （B）T彼は、心外膜面をラップ解除色分けされて頻脈性不整脈のエピソードの中で赤で示されて波面を示す位相（位相平面解析18から得られる）で。 （C）安定したリエントラント不整脈のサイクル中に活性化の波面（赤色）の伝播のパネルB.（D）エイトのスナップショットで1から5でマークされた位相特異点の周りの5つの場所からの光の活動電位の記録。波面円は心臓の前面で表示されている位相特異点、周りに時計回り。再分極の色（青）は後部波面が（例えば、80ミリ秒、100ミリ秒、および120msで）表示されるように部分的に透明になるように設定されています。このリエントラント不整脈の映画は、補足ビデオ1で提供されています。幾何学の復興、信号の登録、位相マップの計算、及び表面のラップを解除するための方法は他の6詳細に記述されています。 <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。デュアルマッピングシステム（一時的な活動電位およびカルシウムの同時マッピング）を使用してランゲンドルフ灌流ウサギの心臓の実験から代表的な結果。 （A）黒いドットで覆われ、ビューのマッピングのフィールドを持つ心臓の前面を。あるサイトからの録音の（B）クローズアップビュー。 （C）ではないすべてのピクセルの記録が示され、空間分解能が200μmの場合されていることをパネルAに黒い点でマークされた等間隔の位置の配列から活動電位（青）とカルシウムトランジェント（赤）のサンプルのトレースを。

<ol>
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利害の衝突は宣言されません。

我々の経験に基づいて、成功したランゲンドルフ灌流ウサギの心臓の実験のためのキーは、十分に準備Tyrodes&quot;ソリューション、心の迅速な収穫、手入れの行き届いた灌流圧、および灌流系における酸素化ソリューションの適切なpHを含める。最高の信号対雑音比を持つ信号を記録するために、我々は、光源、光学フィルター、光学系を中心に、光検出器、など19を含む要因を考慮する必要があります。これらの側面の詳細は別の場所で19説明されています。若いウサギ（年齢：4〜5ヶ月、体重：7〜9ポンド）が光信号の信号対雑音比を低下させる心外膜脂肪を、避けるために使用することができる。 各ピクセルで記録された信号は、組織の体積から放射される光の重み付け統合です。この組織容積の深さは、使用する色素の励起および発光波長に依存します。ジ-4 - ANEPPSの場合は、例として、推定侵入深さは、ウサギの心臓20の300μmのである。電気的機能の局所的不均一性は、洞房結節、房室結節、および心室の間に不整脈1,21,22に存在する場合このように、光信号の解釈は慎重に行う必要があります。 電極の記録と比較して光学的マッピング技術の一つの制限は、光学的活動電位の再分極相はしばしば心収縮によって生じるモーションアーチファクトによってdistoredされていることです。機械的な制約は、アーティファクトを減らすために使用することができるが、それを完全に排除することはできません。比較では、薬理学的興奮収縮uncouplersは、モーションアーチファクトの除去に有効です。しかし、これらのuncouplers（例えば2,3 - ブタンジオンMonoxime）重要な電気生理学的な副作用を持つことができます。 Blebbistatinは、正常な心臓23の心臓電気生理学上の有害な副作用を持たないことが実証され、したがって、光学マッピングのための有望な脱共役剤であるれました。それは、収縮の廃止による浮腫の加速がまた電気生理学に影響を及ぼすことに留意すべきである。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> NaClの</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> S271 - 1 </td></tr><tr><td>のCaCl 2（2H 2 O） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> C79 - 500 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> S217 - 500 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（6H 2 O） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> M33 - 500 </td></tr><tr><td>のNaH 2 PO 4（H 2 O） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> S369 - 500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3の </td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> S233 - 3 </td></tr><tr><td> D -グルコース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> D16 - 1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td>バイオサイエンスTocris、エリスヴィル、ミズーリ</td><td> 1760 </td></tr><tr><td>ジ-4 ANEPPS </td><td>インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州</td><td> D1199 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td>インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州</td><td> S1109 </td></tr><tr><td> rhodo -の異形2AM </td><td>インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州</td><td> R1244 </td></tr><tr><td>プルロニックF127 </td><td>インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州</td><td> P3000MP </td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td>シグマ、セントルイス、MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

multiparametric optical mapping of the langendorff-perfused rabbit heart

光イメージングと蛍光プローブは、他の1に近づくことによって達成されていることができなかった方法で、心臓電気生理学の分野で著しく先進的な研究の方法論を持っている。カルシウムや電位感受性色素を使用することで、光学マッピングは、組織の物理的な接触なしに高い空間分解能を持つ膜貫通活動電位とカルシウムトランジェントを測定することができます。これは、電極の使用が不便または1不可能な多くの条件の下で心臓の電気活動の測定が可能になります。従来の電極技術は、電極の分極1による刺激中および後の刺激によって誘発されるアーティファクトに苦しむ間、例えば、光学録音は、刺激と除細動中や直後に膜電位の正確な形態学的変化を提供しています。 ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓は、人間の心臓の生理学と病態生理学の最も研究されているモデルの一つです。臨床的に観察された不整脈の多くの種類は、ウサギの心臓のモデルにrecapitulatedすることができます。それは、心臓や再入国の波長の効果的なサイズによって決定される心室性不整脈時のウサギの心臓の波のパターンは、、人間の心臓2のように非常に類似していることが示された。それはまた、筋小胞体（SR）の相対的な寄与として、ウサギ心筋でカップリング興奮収縮の重要な側面（EC）は、ヒトECカップリング3と非常に似ていることが示された。ここでは、ランゲンドルフ灌流システムのセットアップ、光学マッピングシステムのセットアップ、心臓、血流と心、興奮収縮の色素染色の分離とカニュレーションを含むランゲンドルフ灌流ウサギの心、の光学マッピング実験の基本的な手順を説明脱共役、および光信号のコレクション。これらのメソッドは、流量の調整、光学、ソリューション、などとウサギ以外の種から心臓に適用される可能性が二つの光学マッピングシステムが説明されています。パノラママッピングシステムは、ウサギの心臓4-7の全体心外膜をマップするために使用されます。このシステムは、不整脈原性および除細動時のリエントラント回路の進化のグローバルビューを提供し、不整脈とantiarrhythmia治療8,9のメカニズムを研究するために使用されています。デュアルマッピングシステムは、ビュー10-13の同じフィールドから同時に（CAT）一時的な活動電位（AP）とカルシウムをマップするために使用されます。このアプローチでは、電気的交互脈と不整脈14から16の誘導におけるカルシウムの重要な役割についての理解を強化しています。

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

この記事では、パノラマのイメージングシステムを用いてランゲンドルフ灌流ウサギの心臓、およびデュアル（電圧とカルシウム）画像診断法で光学マッピング実験を実施するための基本的な手順について説明します。

ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓のMultiparametric光学マッピング

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

multiparametric-optical-mapping-langendorff-perfused-rabbit

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.4K ビュー.  Washington University in St. Louis. この記事では、パノラマのイメージングシステムを用いてランゲンドルフ灌流ウサギの心臓、およびデュアル（電圧とカルシウム）画像診断法で光学マッピング実験を実施するための基本的な手順について説明します。

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

生物工学

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

細胞融合の検出のためのCre - LOX Pの組換えのアプローチインビボでの</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

ネイティブ、繊維状の長い間隔と分節ロング間隔コラーゲンのin vitro合成

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Patient-specific simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered by the absence of in vivo imaging technology for clinically acquiring myocardial fiber orientations. The objective of this project was to develop a methodology to estimate cardiac fiber orientations from in vivo images of patient heart geometries. An accurate representation of ventricular geometry and fiber orientations was reconstructed, respectively, from high-resolution ex vivo structural magnetic resonance (MR) and diffusion tensor (DT) MR images of a normal human heart, referred to as the atlas. Ventricular geometry of a patient heart was extracted, via semiautomatic segmentation, from an in vivo computed tomography (CT) image. Using image transformation algorithms, the atlas ventricular geometry was deformed to match that of the patient. Finally, the deformation field was applied to the atlas fiber orientations to obtain an estimate of patient fiber orientations. The accuracy of the fiber estimates was assessed using six normal and three failing canine hearts. The mean absolute difference between inclination angles of acquired and estimated fiber orientations was 15.4 &deg;. Computational simulations of ventricular activation maps and pseudo-ECGs in sinus rhythm and ventricular tachycardia indicated that there are no significant differences between estimated and acquired fiber orientations at a clinically observable level.The new insights obtained from the project will pave the way for the development of patient-specific models of the heart that can aid physicians in personalized diagnosis and decisions regarding electrophysiological interventions.

A methodology to estimate ventricular fiber orientations from in vivo images of patient heart geometries for personalized modeling is described. Validation of the methodology performed using normal and failing canine hearts demonstrate that that there are no significant differences between estimated and acquired fiber orientations at a clinically observable level.

ハートの患者固有のモデリング：心室繊維配向の推定

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

を光学的に検出<em&gt; E.大腸菌の</emメソポーラスケイ素バイオセンサーによる&gt;バクテリア

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

光ピンセットによる単一のRNA分子のナノマニピュレーション

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and adverse effects1,2,3,4,5,6,7. However, several challenges remain before these treatments can be applied more widely. The development and validation of intraductal therapeutics in an appropriate animal model facilitate the development of intraductal therapeutic strategies for patients. While the mouse mammary gland has been widely used as a model system of mammary development and tumorigenesis, the anatomy is distinct from the human gland. A larger animal model, such as the rabbit, may serve as a better model for mammary gland structure and intraductal therapeutic development. In contrast to mice, in which ten ductal trees are spatially distributed along the body axis, each terminating in a separate teat, the rabbit mammary gland more closely resembles the human gland, with multiple overlapping ductal systems that exit through separate openings in one teat. Here, we present minimally invasive methods for the delivery of reagents directly into the rabbit mammary duct and for visualization of the delivery itself with high-resolution ultrasound imaging.

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

ウサギの乳腺への管内配達

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

マウス心臓の研究のための光シート蛍光顕微鏡

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

房室弁の二軸の機械特性

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...