我々はpSil-GFPコンストラクト、 図1の説明のために博士アルパーウズン、共焦点顕微鏡のためのルダックバイオイメージング機能を提供するための博士シリンBonniに感謝します。 EMMは、バロウズ·ウェルカム財団、NARSAD若手研究者賞、およびNIH NCRR COBRE P20 RR018728-01から医学のためのキャリア賞でサポートされています。 SBLは、NIH NCRR COBRE P20 RR018728-01でサポートされており、PHS NRSA 5T32MH019118-20からの支援を受けています。

1。 （ないビデオで）培養液とメディアの準備<ol><li> 1X HBSS、2.5 mMのHepes緩衝液（pH7.4）、30mMのD-グルコース、1mMのCaCl 2、1mMのMgSO 4をおよび4mM NaHCO 3を含む完全ハンクス平衡塩溶液（HBSS）の1リットルを準備します。蒸留水（DDH 2 O）を追加します。 4で0.2μmフィルターや店舗℃で滅菌するフィルタリング</li><li>基礎培地イーグル培地の35mLの、完全なHBSSの12.9 mLを、20mMのD-グルコース（1 M溶液1.35 mL）を、1mMのグルタミン（200 mM溶液0.25 mL）を、ペニシリンの0.5ミリリットルを使用して、スライス培養培地を準備します。 - ストレプトマイシン100×ストック。 0.2μmのフィルターで滅菌ろ過し、次いで、5％の最終濃度に血清熱不活馬を追加します。 </li><li>滅菌蒸留脱イオン水で1 mg / mLとラミニンのストック溶液を作ることによってラミニンワーキング溶液を調製します。 -80℃で0.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに100μLのアリコートを準備し、凍結℃の</li><li>ので、作業ポリ-L-リジンの準備1 mg / mLのストック溶液を作るためにポリ-L-リジンの5mgに滅菌H 2 O 5mLを追加することにより、lution。 -20℃で1 mLを分注し、凍結を準備します。 </li><li>滅菌水で12 mLの最終的なボリュームにポリ-L-リジンの1 mLおよびラミニンの100μLに希釈してコーティング溶液を調製します。毎回新鮮なこのソリューションを作成します。 </li></ol> 2。器官スライスを挿入します（ないビデオ）の準備<ol><li>よく滅菌ピンセットを使って1つのカルチャーインサートを持つ2つの6ウェルプレートを準備します。カルチャーインサート下に無菌のddH 2 O 2 mLを追加します。 </li><li>穿刺に膜を気にしないながら膜の上にコーティング溶液の1 mLを加える。 37℃および5％CO 2の加湿インキュベーターで一晩インキュベートします。 </li><li>コーティングメディアを取り出し、滅菌H 2 0 3回膜を洗浄する。使用前に乾燥を挿入してみましょう。 37スライス培養培地と場所の1.8 mLを°Cインキュベーターを追加します。パラフィルムで使用されていないプレートをラップと4週間まで4℃で保存。 </li></ol> 3。 （ないビデオ）エレクトロポレーションの準備<ol><li>エレクトロポレーションのためにRNAiコンストラクトを準備します。二重鎖RNAヘアピンインサートはpSilencerベクターにクローニングした。プラスミド含まれています：1）二本鎖RNAの生成を駆動するU6プロモーターおよび2）GFP発現カセットは、CMVプロモーター8,9によって駆動される。このプラスミドは、以前小西ら9と他の7,8で説明されている。プラスミドはキアゲンマキシプレップキットを用いて精製し、1 mg / mLの濃度で使用されています。 </li><li>それを注入しながらDNAを可視化するために、0.5％ファストグリーン染料溶液を調製し、（通常は速いグリーンの1μLのDNAの20μL）を注入するDNAで1:20でそれを使用しています。 DNA-ファストグリーン染料の混合物を介して左週間までは-20℃で保存することができます。 </li><li>きれいな解剖領域dissectingのツールと​​70％エタノールでビブラトーム容器。それは氷冷になるように、完全なHBSSを冷やす。急速な冷却のためのいくつかの水でビブラトーム内側にその周りに氷を詰めることによってビブラトーム容器を冷やす。完全なHBSSを用いて3％低融点アガロースを準備します。 1分間電子レンジ。沸騰する上で避ける。使用するまで42℃水浴中で保管してください。 </li><li>エレクトロポレーションパラメータは次のように設定されています。 E15胚を使用する35 V、5パルス、100 msの長さ、パルス間の900ミリ秒間隔の。古い動物については、エレクトロポレーションを確保するため、50 Vに高い電圧を使用するか、または最大8パルスにパルス数を増やします。若い動物では組織の損傷を防ぐために、25のいずれかに少ないパルスまたは最大2つのパルスと低い電圧を使用V.これらのパラメータは変化し、動物の年齢に応じて経験的に決定することができる。 </li></ol> 4。解離およびエレクトロポレーション（ビデオで） <ol><li>妊娠中の女性の安楽死した後、氷冷HBSSを完全に胚を解剖する。 KE個々の胎盤気嚢内の各胚をEP。 </li><li>胚を解剖し、最初の椎骨の後に頭を切り落とした。氷冷HBSSを完全にしてください。 </li><li>注射のために、ペトリ皿の上にパラフィルムの一部に頭を置きます。皮質の小胞の両方の側脳室を埋めるために第三脳室を介して高速の緑染料·ミックス（ 表Iを参照）ハミルトンシリンジたカスタムを使用すると、DNAの約6〜8μLを注入します。また、注射は、それぞれの側脳室に直接行うことができます。 </li><li> ex vivoでのエレクトロポレーションでは、BTX-ピンセット白金電極を使用しています。あなたは背側皮質のヘッドすなわち上部をエレクトロポたい大脳皮質の側に向かって正極を配置します。 </li><li>エレクトロポレーションした後、解剖前に、少なくとも5分間氷上に頭をインキュベートします。 </li><li>氷冷HBSSby頭部の側面に小さな切開を作り、頭の両側から皮膚を剥離の脳を解剖する。と、次のそっと皮離れて細かい鉗子脳からPIA。皮質に損傷を与えないように注意しながら、頭蓋骨から無傷の脳を削除します。 </li></ol> 5。 （ビデオで）を埋め込むとエレクトロポ野のセクショニング<ol><li>氷上に置いた大規模な金型に3％低融点アガロースを転送します。モールドの底部はモールドの底に沈んでダウンから脳を防ぐことができますどの速く固化し始めることになります。穏やかに、微細な鉗子キムワイプまたは濾紙で余分なバッファーを除去した後、一つずつで脳を転送します。アガロースと脳組織間の最大インタフェースを確保するために金型内の渦の脳を、10μLピペットチップを使用しています。 </li><li>すべての頭脳を確保するために東洋の脳は同じ向きに、アガロースでほぼ同じレベルである。アガロースは、約5分間固化しましょう​​。嗅球が立っされるようにアガロースブ​​ロックを接続する接着剤（クレイジー接着剤）を使用します。ブロックが接続されたら、すぐに私を追加CE冷HBSSと個々のスライスは、各脳に対して得られていることを確認するアガロースをトリミングします。 </li><li>ブロックをスライスするには、低速（約半分の最大値）にビブラトームの速度を設定し、最高設定でブレードの振動周​​波数を設定します。 250μmの厚さの冠状スライスを生成します。曲がった細かいへらを使用してスライスを取得し、微細なブラシや鉗子で組織のウェルに移す。 </li><li>組織培養フードには、コーティングされたインサートにスライスを転送します。転送を容易にするために、各インサートにスライス培養培地の500μLを追加します。最大5つのスライスには、挿入ごとに配置することができます。スライスの上から余分なメディアを削除し、37℃で加湿インキュベーター中でインキュベートする。 </li></ol> 6。文化や器官スライスの解析（ビデオで） <ol><li>健全なスライスを維持するために、新鮮なメディアは、メディアごとに時間の半分を置き換えることにより、膜の下に少なくとも一日おきに追加する必要があります。 </li><li> Dの後にスライスを分析するために、文化のesired日、膜のスライスを修正します。 10分間°Cを3回、毎回37℃で1×リン酸食塩緩衝液（PBS）で洗浄する。次に、4℃または室温で1時間、一晩、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定します。 </li><li>スライスは、異なる細胞のマーカーで分析またはエレクトロポレーションと非エレクトロポレーションした細胞を可視化するだけではヘキストで染色することができます。透過性、10％ヤギ血清、穏やかに振盪しながら1×PBS中0.1％のトリトン、室温で2時間のスライスをブロックします。 </li><li>室温で1時間ヘキストで染色し、それぞれの時間が穏やかに振盪しながら1×PBSで10分間で3回洗浄します。 </li><li>マウントするにはスライスがメスで膜を切り取り、水チャンバ内の曇りガラスのスライドにスライスを含む膜を転送するために微細な鉗子を使用しています。最大5つのスライスは、スライドガラスごとに配置することができます。余分な水分を除去し、各脳切片へFlourmount溶液の液滴を追加します。穏やかに脳スライスの上にカバースリップを配置し、削除するyの気泡。共焦点顕微鏡を使用してスライスを分析します。 </li></ol> 7。器官スライスの代わりにパラフィン包埋（いないビデオ） <ol><li>器官のスライスはまた、上述したようにこの目的のために器官のスライスを含む膜を4％PFAで固定することができ、より細かい形態素解析のためにパラフィンのために埋め込むことができます。 </li><li>固定のスライスは、1％アガロース（37℃にあらかじめ温め）に埋め込まれ、30分間氷中で固化されています。アガロースブ​​ロックは、その後30分間、4℃で4％PFAで後固定することができます。 </li><li>器官スライスを含有するアガロースブロックはその後パラフィンに埋め込 ​​まれており、前述の10のように免疫のために処理されます。 </li></ol> 8。代表的な結果器官のスライスのマウス皮質と文化のエレクトロポレーションの概略を図1に示されています。このメソッドは、RAPIのために有用な戦略である神経発達11に関与する遺伝子の機能のD評価。 DNAエレクトロポレーションの量とエレクトロポレーションでは胚の段階に応じて、トランスフェクション効率は異なる場合があります。スライスは、少なくとも8時間後にエレクトロポレーションと細胞は培養中の神経のイベント（増殖、遊走、初期の神経分化）の正常シーケンスを受けることになるGFPを発現するが開始されます。 図2は、pSilencer-GFPコントロールを発現しているエレクトロポレーションの脳スライスを示しています。ベクトルと1つの神経前駆細胞、移行するニューロンとスライスに分化したニューロンを観察することができます。彼らは膜上の優れたメディアのエア·インタフェースで維持され、培養中に少なくとも5日まで使用することができるように器官のスライスがあれば、その形態を維持します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig1.jpg" /> 図1。 ex vivoでのエレクトロポレーションおよび器官スライスのイラスト培養アッセイ。E14.5胚を切り出し、個別に注射部位を可視化するために、速いグリーン染料を混合したDNAを注入されています。図や第三脳室に示すようにDNAは、側脳室を埋めるために、両方の側脳室に注入することができます。注入後、脳は、脳の所望の側に正極を配置し、方形波のエレクトロとエレクトロポレーションされています。脳は3％低融点アガロースとビブラトームを用いて切片に埋め込まれています。 250μmの脳スライスは、0.4μmのインサート上に配置され、週にまで培養されています。 GFPは、8時間後にトランスフェクション後に観察することができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig2.jpg" /> 図2。エレクトロ脳スライスの分析。エレクトロポ脳スライスはHoescht染色した。背側皮質脳室帯（VZ）でエレクトロポレーション神経前駆細胞を示しています。コルティ内のニューロンCALプレート（CP）は辺縁帯（MZ）で区切られています。白い矢印は移行ニューロンを示しています。このケースでは、脳はE15.5で注入したとpSilencer GFPコントロールベクターでエレクトロポレーション。のセクションでは、4日、エレクトロポレーション後、皮質外植片を表しています。スケールバーは100μm。 トラブルシューティング： <ol><li> トランスフェクション効率が低い：少なくとも1μg/μLのに使用されるDNAの濃度を調整します。必要なDNAを精製するためにエンド - フリーQuiagen社のキットを使用する場合は、常に最大の準備から、非常にクリーンなDNAを使用しています。 </li><li> 細胞が所望のものとは異なる脳領域でトランスフェ：電極をエレクトロポレーションする脳の側に向かって正極の位置に正しく配置されていることを確認します。 </li><li>毎日の変更、メディアやスライスがメディアに浮動小数点ではありませんを確認してください。器官のスライスは、形態を失う </li><li> 彼らはviでカットされているようにスライスがアガロースから来るbratome：低融点アガロースで脳を埋め込 ​​むときに良好な界面が行われていることを確認します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Angevine, J. B., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+cell+migration+during+histogenesis+of+cerebral+cortex+in+the+mouse.">Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse.</a> Nature. 192, 766-766 (1961).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).</li><li>Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+for+analysis+of+proliferation,+cell+death,+and+migration+in+the+embryonic+neocortex.">Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).</li><li>Guerrier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-BAR+domain+of+srGAP2+induces+membrane+protrusions+required+for+neuronal+migration+and+morphogenesis.">The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis.</a> Cell. 138, 990-990 (2009).</li><li>Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-389 (2006).</li><li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi.">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li><li>Konishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain.">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain.</a> Science. 303, 1026-1026 (2004).</li><li>Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+paraffin-embedding+of+mouse+tissues+for+GFP+visualization.">Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).</li><li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders:+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors.">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

器官のスライスの二本鎖RNAヘアピン8と文化をコードするプラスミド4のex vivoでのエレクトロポレーションを含むこれらのメソッドは、いくつかの明確な利点を提供しています。最初に、これらのメソッドは、RNAiから派生した表現型の迅速な評価を可能にします。二本鎖RNAのヘアピンを駆動するU6プロモーターを含む同じpSilencerベクター中の発現カセットのエンコーディ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ</td><td> HAMILTON </td><td> 80008 </td><td> 31ゲージ、長さ0.5インチ、PT-4（ポイントベベルのレベル）、10μlの体積</td></tr><tr><td>プラチナtweezertrodes </td><td> BTX </td><td> 45から0489 </td><td> 5ミリメートルサイズ</td></tr><tr><td> ECM830エレクトロ</td><td> BTX </td><td> 45から0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTXフットスイッチ</td><td> BTX </td><td> 45から0208 </td><td> ECM830エレクトロで使用するために</td></tr><tr><td>振動刃ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td> VT1000 S </td><td></td></tr><tr><td> 6 - インサートで使用するだけでなく料理</td><td> FALCON </td><td> 353502 </td><td>インサートに適合するようにノッチが含まれています</td></tr><tr><td>組織培養インサート</td><td> FALCON </td><td> 353090 </td><td> 0.4マイクロメートル</TD&gt; </tr><tr><td>速いグリーン</td><td> SIGMA </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td> FISHER </td><td> BP165-25 </td><td> DNAグレード</td></tr><tr><td>ラミニン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td>ポリエルリジン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td>基礎培地イーグル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B-1522 </td><td></td></tr><tr><td> CaとMgせずに10倍のHBSS </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-遊離酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex

大脳皮質は、より高い認知機能を指示します。この6層構造は、最後に生まれたニューロンは脳1の表面に向かって最初の生まれのニューロンを越えて移行する際、最初の生まれたニューロンは脳室に近いままでいる内に、最初に、外から最後の方法で生成されます。ニューロン移動2に加えて、正常な皮質機能のキープロセスでは、ニューロンの形態3の規制です。神経細胞の形態形成は初代培養の in vitro で検討することができますが、これらのプロセスは、組織の環境では規制されている方法から学ぶべき多くがあります。 我々は大脳皮質4,6の器官スライスの神経細胞移動および/ ​​または形態を分析する手法について説明します。 pSilencer変更されたベクトルは、二本鎖ヘアピンRNAを駆動するU6プロモーターとbを駆動するGFP蛋白質をコードする別の発現カセットの両方が含まれている使用されている屋CMVプロモーター7-9我々のアプローチは、候補遺伝子の特定のノックダウンによって神経突起伸長の欠陥を迅速に評価することができ、正常に神経突起伸長の8レギュレータの画面で使用されています。細胞のサブセットのみがRNAiコンストラクトを表現されるため、器官のスライスは、潜在的な表現型のモザイク解析を可能にします。この分析は、 生体内環境に近い近似値で行われるため、また、それは未知の皮質機能の遺伝子のための低コストおよびトランスジェニックやノックアウト動物の世代への迅速な代替手段を提供します。最後に、in vivoでのエレクトロポレーション技術と比較して、ex vivoでのエレクトロポレーション実験の成功は、熟練した外科手術のスキル開発に依存しないで、短いトレーニング時間とスキルで行うことができます。

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Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

大脳皮質の発達における遺伝子の機能の迅速な評価を行うために、我々は関与する方法を説明<em&gt; ex vivoで</emプラスミドをマウス胚性皮質に阻害RNA（RNAi）をとGFPを共発現の&gt;エレクトロポレーション。このプロトコルは、神経新生、神経細胞の移動と樹状突起と軸索伸長を含むニューロンの形態として、神経発達のさまざまな側面の研究に適している。

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

11.7K ビュー.  Brown University. 大脳皮質の発達における遺伝子の機能の迅速な評価を行うために、我々は関与する方法を説明 ex vivoでエレクトロポレーション。このプロトコルは、神経新生、神経細胞の移動と樹状突起と軸索伸長を含むニューロンの形態として、神経発達のさまざまな側面の研究に適している?...

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

神経科学

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...