著者は、私達にコルチ器官を単離するための方法を教えることへの努力は、DemêmesダニエルとダグラスCotancheに感謝します。とマシューチャナ、ジェイソンミーカー、とケンドラマーシャル（;ビデオアニメーションへの彼女の貢献のアートワークのシェリー林、さらに、我々は、エンジニアリングエレクトロ電極のためにイシュマエルステファノフ-ワーグナーに感謝の意を<a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a>ビデオを生成するため）。 NIDCDからこの作品は、助成金（; RO1DC007174最先端の研究を聴覚のためのP30DC05209 - MEEIのコアサポートR03DC010065 -パーカー）によって賄われていた。

1日目。ガラス製カバースリップの殺菌、コーティング。 <ol><li>オートクレーブにガラスの顕微鏡のカバーグラスを滅菌乾燥させます。 </li><li>あらかじめ滅菌四ウェル細胞培養皿の二つウェルに滅菌カバーグラスを置きます。 </li><li>午前1時01 ポリ- L -オルニチンとラミニンでカバースリップは、4℃で一晩20％ ウシ胎児血清（FBS）を添加したコート℃に<ol class="lalpha"><li> 400μLポリ- L -オルニチン（4で保存されている0.01％のソリューション° C） </li><li> 400μLラミニン（-20アリコートに保存されて50μg/ mlのストック溶液° C） </li><li> 200μLFBS（-20℃でアリコートに保存されている） </li></ol></li><li> 150℃インキュベーターで解剖ツールが一晩熱滅菌する。 </li><li> 10％の血清および10 mg / mLのアンピシリンを含む培地を加えます。 <ol class="lalpha"><li> 90mLのダルベッコ改変イーグル培地 </li><li> 5 mLのFBS（-20℃でアリコートに保存されている） </li><li> 5mLのウマ血清 （-20℃でアリコートに保存されている） </li><li> 10μL アンピシリン （4℃で保存されて10 mg / mlのストック溶液° C） </li></ol></li></ol> 2日目。コルチ器官の単離。 <ol><li> 正流の解剖のフードを滅菌する 。 <ol class="lalpha"><li> 20分間UVライトをオンにする</li><li> 70％エタノールですべての面をスプレーし、使用前に5分を待つ。 </li></ol></li><li> オペレーティングはさみを使用して大後頭孔の基部に子犬マウスを（P4）首を切る。 </li><li>簡単に言うと70％エタノールを含む10cmディッシュで頭を洗う。 </li><li> 手術用メスの刃を使用して表皮を削除します。 </li><li>手術用メスの刃を使用して矢状縫合に沿って頭蓋を開いて、前脳を二等分する。さらに解剖のための尾側前脳を維持する。 </li><li>鈍的切開を用いて前脳、小脳と脳幹を削除します。 </li><li>側頭骨（図2A）を削除し、70％エタノールで簡単にそれらを浸し、そして滅菌HBSSを含む3 mmディッシュに移す。 </li><li> 鉗子を使用して 、側頭骨錐体部から水疱と周囲の組織を削除します。 </li><li>巻き貝形の蝸牛（図2B）を見つけて、ピンセットを使用して前庭系から分離する。 </li><li>開発のこの段階では、骨迷路は完全に石灰化されていないと簡単に鉗子を用いて解剖される。基端から開始し、鉗子を使用してapically移動慎重に分離による蝸牛の骨迷路を削除します。 </li><li>らせん靱帯とコルチ器の接続された器官は蝸牛軸（図2C）のスパイラルに沿って巻かれている。慎重にピンセットを使用して、ベースのフックの領域でらせん靱帯を確保し、apically移動すると、それをほどくことによってコルチ器官を取り除く。 </li><li>ベースから始まる、 第55細かい鉗子 （図2D）を使用してコルチ器官かららせん靱帯を削除します。 コルティ感覚上皮（オプション）の臓器のマイクロ分離。 </li><li> 2つを使用して、ベースのコルティフック領域の臓器を取り除く½ ccのインスリン用注射筒を恒久的に接続されているU - 100 28G ½鉗子のような針で。 </li><li>頂点から開始し、内有毛細胞の行からスパイラル輪部を削除し、（図2E - F）basally進みます。 コルチ器外植片の器官をめっき </li><li>培養ウェルからpoly-L-ornithine/laminin/FBS溶液を除去し、培養液の130μlを加える。 </li><li>よくと東洋文化の中でコーティングされたガラスのカバースリップ有毛細胞の繊毛が上を向くように外植片にコルチ器の解剖臓器を転送する。 </li><li> 200μLピペットを用いて培養ウェルの培養液を除去。基底膜がコーティングされたガラスのカバースリップで固体接触することを確認してください。 </li><li>慎重に200 mLのピペットを用いてコルチ器官に培養液の130μLの。コルチ器官の表面に2滴を適用してから、ゆっくりとカバースリップの側に、残りのボリュームを追加します。コルチ器官が培地に浮遊するが、カバースリップに貼られたままにしていないことを確認してください。 </li><li> 37 5％CO 2存在下で° Cで一晩インキュベートする。 </li></ol> 3日目。コルチ器の培養臓器へのレポーター遺伝子のエレクトロポレーション。 <ol><li>コルチ器の文化の臓器から培養液を取り外します。 </li><li> 1分を130μLH 2 Oを追加してから、200μLピペットを使用して削除します。 </li><li>プラスミドDsRedをレポーター（-20℃で保存2mgを/ mLのH 2 O）の30μLを追加。 </li><li>ようにマイクロマニピュレーターを用いてエレクトロの電極を進めるアノードNDカソードは、文化のいずれかの側にあります。 </li><li>コルティの移植片培養の臓器にレポーター遺伝子をエレクトロにパルス（27V、30ミリ秒持続時間、10種類のパルストレイン）を生成する。 <ol class="lalpha"><li>オプション：modiolarと植のらせん靱帯の両側に、導入遺伝子のエレクトロポレーションを確保するためにパルスの極性を逆に。 </li></ol></li><li> 5分待ってください。 </li><li> DNA溶液 （2部DNAのトランスフェ3部）：のFugene 6 130μLを加える。このソリューションは、前の層流フードで3 mLの丸底ポリスチレン試験管を用いてエレクトロポレーションの手順（ステップ20）の開始に準備する必要があります。このソリューションを作成するには： <ol class="lalpha"><li>試験管にのOpti - MEM（4℃で保存）2.4μLを加える。 </li><li>試験管にのFugene 6試薬0.6μLを（4℃で保存）を追加します。のOpti - MEMに直接トランスフェを追加し、試験管の側面との直接接触を避けるようにしてください。 </li><li> 1秒間ボルテックスする。 </li><li>室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 2.0μLDsRedをレポータープラスミド二本鎖DNA（100μgのDNA / mLのH 2 Oのアリコートで-20℃で保存）を追加します。 </li><li> 1秒間ボルテックスする。 </li><li>室温で15分間インキュベートする。 </li><li>培養液200μLを加える。 </li><li> 1秒間ボルテックスする。 </li></ol></li><li> ° C、5％CO 2で37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ウェル培養に2mLの培養液を追加し、37℃で10日までインキュベートする。 </li></ol>代表的な結果我々は、周産期のマウスからのコルチ器官の単離のための方法を提示する。手順は、骨迷路が十分に解離が面倒なレンダリングに石灰化になる時点で、生後約最大16日胚のように若いマウス6で使用することができます。コルチ器官が解剖されると、それは全体（図3）やマイクロ分離された感覚上皮（図4）のいずれかで播種し、培養することができる。今後は、コルチ器の培養器官で外来遺伝子を表現する手法を提示している。器官培養は、らせん神経節細胞またはマイクロ分離を用いた外因性幹細胞とコルチ器官共培養、そのようなRT - PCRを用いてコルチ器の遺伝子発現の臓器の分析として、またはin situハイブリダイゼーション研究の他の多くの種類、のに便利です。 3、または有毛細胞の死と再生のインビトロ分析インチ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="図1" border="0" /></a> 図1。コルチ器のP4マウス臓器の断面。 （A）P4マウスから得られたcryosectioned蝸牛の基底回転からのクロスセクションでは、このプロトコルで説明されているマウス蝸牛の一般的な構造を示しています。中央階は、下方スパイラル靭帯と横方向に血管条、ライスナーの上方に膜、内側螺旋縁、および基底膜に接しています。ボックスには、Bに拡大領域が（B）コルチ器官が基底膜の優れた側に位置し、内有毛細胞、外有毛細胞の3つの行、および、それぞれの支持細胞の一つの行が含まれています示した。破線1は、コルチ器の解剖のこの臓器中に削除される基底膜に沿って位置を示します。破線2は、マイクロ分離手順の間に除去される基底膜に沿って位置を示します。グリーンはスパイラル輪部の歯間細胞、蝸牛有毛細胞、らせん神経節の神経細胞だけでなく、らせん靱帯と血管条7の細胞を標識するカルビンジンの免疫組織化学的標識を、示している。核のDAPI標識は青色になります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="図2" border="0" /></a> 図2。コルチ器の解剖の臓器。コルティ郭清のハイライトの器官の付属のビデオからの画像）は蝸牛と分離された側頭骨（赤）、B内にある前庭系）蝸牛の骨迷路、C）らせん靱帯と接続されている骨迷路、Dの除去後のコルチ器官）コルティ、Eの臓器かららせん靱帯と血管条（赤）の除去）スパイラル角膜輪部（赤）からの感覚上皮のミクロ分離、およびF）分離されたスパイラル角膜輪部（左）と感覚上皮（右）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="図3" border="0" /></a> 図3。の臓器を示すコルチ植の培養臓器。DIC画像分離されたP4 ATOH1 - nGFPマウスのコルティ、メッキ、と説明したとして、5日間培養した。プロ毛細胞の遺伝子無調相同体1（ATOH1別名Math1を）発現する細胞は、核8にローカライズされている緑色蛍光タンパク質を示すように、このマウスは遺伝的に設計されています。これらのマウスからのコルチ器官は、すべての有毛細胞の核で核GFPのラベルを示すため、落射蛍光顕微鏡を用いて感覚上皮の簡単な可視化を可能にする。比較的大きな渦状角膜輪部は、感覚上皮の外側を見ることができます。コルチ器官から発生した間葉系細胞は、外植片から移行しています。青い核のラベルはDAPIです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="図4" border="0" /></a> 図4。マイクロ分離された感覚上皮に説明し、一晩培養したとしてコルチP4マウス臓器から単離された感覚上皮から得られる。落射蛍光画像。マイクロ分離は、その後4％パラホルムアルデヒドで固定し、蝸牛の有毛細胞を標識するミオシン7aの免疫標識のために処理した。図3から比較的大きな螺旋縁がないことに注意してください。青い核のラベルはDAPIです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="図5" border="0" /></a> 図5。コルチ器の培養臓器にDsRedをレポーター遺伝子のエレクトロポレーション。コルティの全器官がP4 ATOH1 - nGFPの仔マウスから、メッキ、分離して、DsRedをレポーター遺伝子でエレクトロ説明するようにして、落射蛍光顕微鏡下で観察した。トランスジェニックDsRedをレポータータンパク質を発現するコルチ植の臓器の細胞は感覚上皮の赤色蛍光と内因性の細胞を示す緑色の核の蛍光を示す。トランスジェニック細胞は螺旋輪部と感覚上皮を通して見ることができます。

<ol>
	<li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Development+of+the+Organ+of+Corti+in+Culture.">Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture.</a> Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).</li><li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears.">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).</li><li>Martinez-Monedero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+POTENTIAL+ROLE+OF+ENDOGENOUS+STEM+CELLS+IN+REGENERATION+OF+THE+INNER+EAR.">THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR.</a> J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).</li><li>Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RT-PCR+analysis+of+mRNA+for+growth+factor+receptors+in+damaged+and+control+sensory+epithelia+of+rat+utricles.">An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles.</a> Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge.">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).</li><li>Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Differentiation+and+DNA+Binding+(Ids)+Regulate+Math1+and+Hair+Cell+Formation+during+the+Development+of+the+Organ+of+Corti.">Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti.</a> J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).</li><li>Daniela, B., Josef, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calbindin+and+S100+protein+expression+in+the+developing+inner+ear+in+mice.">Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).</li><li>Helms, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).</li><li>Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Damage+to+Auditory+Neurons+and+Hair+Cells+by+Ototoxins+and+Neuroprotection+by+Specific+Neurotrophins+in+Rat+Cochlear+Organotypic+Cultures.">Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).</li></ol>

この手順を成功させるために重要ないくつかの詳細があります。側頭骨の分離からのコルチ器のインキュベーションの臓器に短い時間、器官は実行可能な器官培養におけるカバースリップし、その結果に添付される可能性が高くなります。したがって、解剖やインキュベーターの器官を置くとの間で時間の量を制限することが重要です。多くのアミノグリコシド系抗生物質が耳に毒性のあるものと有毛細胞の死につながるので、抗生物質の選択は、また非常に重要です。それは完全に抗生物質の使用を見合わせることが望ましいですが、これは汚染の可能性を開いたまま。したがって、我々は潜在的な汚染の問題を克服するための一般的なルールとして10μg/ mLのアンピシリンを使用することを示唆している。 この中で最も厄介な側面、およびコルチ器官の初代培養のための他の手順は、インキュベーションの間にプレートをオフフロートする器官の傾向です。フローティング器官培養は5-7日間実行可能なままことができますが、培養浮遊臓器の欠点があります。例えば、問題のある顕微鏡をレンダリング4-5日後に自分自身の上に頻繁にフォールド器官培養をフローティング。カバースリップに貼付されている器官と比較して、その後、オルガンの構造的完全性が損なわになることができます。私たちは、次のテクニックは、コルチ器官が培地中に浮遊していないことを保証するために役立つことを発見したが、カバースリップに貼付されたままになります。最初に、1:1ポリオルニチン/ラミニンでコートカバーガラスは、前述のように20％FBSを補充した。このプロトコルのために呼ばれる一晩のインキュベーションでは、プレートをコーティングすることを最小の時間です。一週間のための私たちの研究室では、私たちはしばしばコート我々が必要とするプレートのすべてを、それら4℃保管° Cを一日まで、使用前に我々は一晩のインキュベーションのためにインキュベーターに移動​​したとき。有毛細胞の繊毛が表向きになるように第二に、臓器の後に東洋は、コーティングされたカバーガラスに外植片を輸送される。このオリエンテーションでは、培養皿に基底膜の付着を容易にするでしょう。第三に、外植片は、コートしたディッシュに付するようにうまく内のメディアを削除します。これは、培養皿と基底膜との間の接触を確保し、ガラスに付着する外植片の能力を強化します。これはまた、有毛細胞の行の構造的な整合性を維持する上で支援します。最後に、慎重に200μLの容量のピペットを用いてコルチ器官の表面に培地を2滴を滴下し、その後徐々にカバースリップの側に、残りのボリュームを（合計130μLの）滴下してもして埋める。コー​​ティングされたカバースリップにコルチ器官の添付ファイルを確実に素早く作業することが重要です。外植片のインキュベーションに解剖の開始から、それは通常、コルチ器の分離手順のこの器官を完了するために実践し、オペレータのために10分かかります。 このプロトコルでは、我々はまた、コルチ器官のスパイラル輪部からの感覚上皮の微細分離するための方法を提示する。この手順では、螺旋状角膜輪部は解剖ツールとして28G ½インスリンの注射針を用いて感覚上皮から離れて解剖される。マイクロ分離結果は、有毛細胞とそれらに対応する支持細胞（図3）の行で構成されています。このプロトコルで説明されているように単離した感覚上皮を培養することができます。このマイクロアイソレーション手順は、組織4を周囲からの感覚上皮の酵素の分離と比較する必要があります。哺乳類では、だけでなく、地下間葉系細胞からの鶏、感覚上皮の分離で分離された前庭器官の結果のサーモリシン消化4などの非哺乳類種。ラット蝸牛における、より上皮尾根の分離、低い上皮尾根と基底膜5から付属の感覚上皮におけるサーモリシン消化の結果。しかし、それは蝸牛感覚上皮が付随する間葉系細胞を含まない被覆されたプレートに接続できるかどうかは不明である。機械的なマイクロ分離法とスパイラル角膜輪部からの感覚上皮の分離における酵素消化法の結果、サーモリシン消化上のマイクロ分離解剖の利点の両方が比較的短く、プロトコル、安価な試薬、および潜在的にあまりストレスを含んでいる間消化の酵素の影響による植。また、基底膜は培養プレートへの感覚上皮の付着性を高める可能性がある、このアプローチではそのまま残されます。この方法の欠点は、この繊細な解剖とミクロ解剖から生じる感覚上皮の潜在的な機械的な損傷のためのスキルを開発する必要があります。 この手順のユーティリティの例として、我々はまた、臓器の使用の一例を提示コルティ文化、移植片培養への外来遺伝子のエレクトロポレーション。上記エレクトロポレーション手順は、コルチ器のエレクトロポレーションの臓器の従来の方法に基づいています。特に、鄭と高（2000）植はアガロースの成形溝による電気穿孔のための場所で開催し、無血清培地2のコラーゲンコートした8ウェルLabTekスライド上にしてメッキされているコルチ器の絶縁されたラットの臓器のエレクトロポレーションについて説明します。彼らのアプローチの利点は、臓器が外植片の上面は、理論的には外植片全体でエレクトロポレーションした細胞を均等に分散されるはずカソードを、向くように配向しているということです。コルチ器官、それによりエレクトロポレーション後の外植片の操作を軽減手順を通じてカバーに貼付されて残っているため私たちの手ではしかし、我々が記述するメソッドは、この手順で改善された。さらに、コルチ器官の高い割合は、この提示方法を用いてカバースリップに接続されたままであった。我々の方法は、ジョーンズら （2006）エレクトロポレーション後の遺伝子発現の効率を高めるためのFugene 6試薬の添加を使用してから取得されます。 Jones ら （2006）プロトコルでは、臓器は、エレクトロポレーションされる100 FuGENE 6トランスフェクション試薬のμL、および6メッキで5分間インキュベートした。我々の手法は我々が経験的に最小の臓器毒性との最適なトランスジェニック発現を提供することが見出されたプラスミドDNA、へのFugene 6試薬の3時02分比の使用が異なります。我々は、文化に対する毒性の可能性がある為、原液のFugene 6試薬を使用しないでください。我々のプロトコルにおける電極の構成だけでなく、Jones ら （2006）、螺旋縁または陰極の位置に応じて、感覚上皮のどちらかの主要な遺伝子発現の結果。陰極への遠い文化の側面のDsRedタンパク質陽性細胞があるが、近いカソードへの遺伝子導入細胞の高濃度があります。コルチ植の器官の両側における導入遺伝子の完全な表現を確保するため、現在は単に反転リードして、2番目のパルス列のために逆にすることができます。コルチ器官（ 図 5）を通じて導入遺伝子の強い発現に提示プロトコルの結果。

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass microscope coverslips</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DYNALAB Corporation (Rochester, NY)</td>
			<td>2010</td>
			<td>10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ringed cell culture dish</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>627170</td>
			<td>Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4957</td>
			<td>0.01% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) </td>
			<td>354232</td>
			<td>made in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>26140-095</td>
			<td>Qualified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>RS-6806</td>
			<td>Straight, sharp-blunt length 5"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blade</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>372611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#4 Dumoxel forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Dumostar fine forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>10564-011</td>
			<td>High Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>2605088</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>11593-027</td>
			<td>Irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&frac12; cc Lo-Dose Insulin Syringe </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>329465</td>
			<td>U-100 28G&frac12;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roche (Mannheim, Germany)</td>
			<td>11-815-091-001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene test tube</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>14-956-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>The Baker Company (Stanford, ME)</td>
			<td>Model SG603a</td>
			<td>SterileGARD III 
				Advanced Class II 
				Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>31985</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter plasmid</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Clontech (Mountain View, CA)</td>
			<td>632539</td>
			<td>pCMV DsRed-Express 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BioRad (Hercules, CA)</td>
			<td>165&#x2013;2662</td>
			<td>BioRad Gene Pulser Xcell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. 

すべての哺乳類では、オーディションのための感覚上皮は、内耳の巻き貝の形をした蝸牛（図1）内に存在するコルチ器のスパイラル器官に沿って位置しています。聴覚系のmechanosensory細胞である発展途上蝸牛、、の有毛細胞は、1つの内側の有毛細胞の行で、3（ベースと半ばターンで）〜4（頂回転で）外有毛細胞の行に整列されていますそのスパンコルチ器官の長さを。有毛細胞は、脳が解釈できる神経インパルスに基底膜の音誘発性機械的振動を伝達する。感音難聴の症例の大部分は蝸牛有毛細胞の死や機能異常によって引き起こされます。 聴覚の研究にますます不可欠なツールでは、臓器の外植片1,2,9のin vitro培養における分離となります。一旦単離さ、外植片は、規範的、異常、または治療生理に関する情報を提供するために、いくつかの方法で利用することができる。遺伝子発現、不動の運動性、細胞および分子生物学だけでなく、有毛細胞の再生のための生物学的なアプローチは、コルチ器の外植片の器官の実験的なアプリケーションの例です。 このプロトコルは、新生児マウスからのコルチ器官の単離と培養のための方法を説明します。付属のビデオでは、仔マウス、および蝸牛のその後の分離、らせん靱帯、およびコルチ器官から側頭骨の分離のための段階的な指示が含まれています。一旦単離さ、感覚上皮が播種し、培養し、全体としてin vitroで 、または、さらに解剖スパイラル角膜輪部とらせん神経節の神経細胞を欠いているマイクロは、隔離とすることができます。この方法を使用して、一次外植片は7〜10日のために維持することができます。この手順のユーティリティの例として、コルチの外植片の器官は、外因性DsRedをレポーター遺伝子を電気穿孔される。それは分離、顕微解剖、およびコルチ器官の初代培養のための、再現性の明白な、と段階的な方向性を提供するため、このメソッドは、他の公開方法に比べて改善されています。

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Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

この手順では、スパイラル輪部とらせん神経節ニューロンの有無にかかわらず、コルチ器のマウス器官の単離および培養のための方法を説明します。我々はまた、エレクトロポレーションにより、コルチ植の器官における外因性レポーター遺伝子の発現のための方法を示しています。

初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

25.8K ビュー.  Harvard Medical School. この手順では、スパイラル輪部とらせん神経節ニューロンの有無にかかわらず、コルチ器のマウス器官の単離および培養のための方法を説明します。我々はまた、エレクトロポレーションにより、コルチ植の器官における外因性レポーター遺伝子の発現のための方法を示しています。

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Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

抗酸菌のエレクトロポレーション

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

生物学

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

成体ラットの心筋細胞の初代培養

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

ラット肝細胞の単離及び初代培養

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

電気穿孔法によるマウス膀胱尿路上皮にプラスミド DNA 配信法

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

初代培養ラット副腎皮質細胞とステロイド ホルモン産生機能の試金

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

要約

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抗酸菌のエレクトロポレーション

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

成体ラットの心筋細胞の初代培養

ラット肝細胞の単離及び初代培養

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

電気穿孔法によるマウス膀胱尿路上皮にプラスミド DNA 配信法

初代培養ラット副腎皮質細胞とステロイドホルモン産生機能の試金

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

マウス骨格筋へのプラスミドDNAのエレクトロポレーション

初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

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エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

成体ラットの心筋細胞の初代培養

ラット肝細胞の単離及び初代培養

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

電気穿孔法によるマウス膀胱尿路上皮にプラスミド DNA 配信法

初代培養ラット副腎皮質細胞とステロイド ホルモン産生機能の試金

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

マウス骨格筋へのプラスミドDNAのエレクトロポレーション

初代培養ラット副腎皮質細胞とステロイドホルモン産生機能の試金