この作品は、MMに健康補助金（R01 HL086699、HL086699 - 01A2S1、1S10RR027327 - 01）の国立研究所によってサポートされていました。私たちの記事は、部分的にカールツァイスマイクロイメージングLLCによってサポートされています。

活性酸素種が酸化感受性色素（1＆2）を使用するか、共焦点顕微鏡によるプラスミドセンサー（3＆4）を用いて生細胞で測定することができます。 1。 J774細胞における細胞質ROSの可視化<ol><li> 48時間、35 - mmディッシュ（ハーバード装置）ガラスの底にJ774.1マウス単球由来マクロファージを（10 6細胞/ ml）を成長する</li><li> 37℃6時間℃：TLRアゴニスト（1μg/ mlのLPS - TLR4アゴニスト; C）- TLR3アゴニスト10μg/ml、ポリ（I 2μg/ mlを、リポ - テイコ酸- TLR2アゴニスト）とチャレンジの細胞 注：同様の条件下で処理したマクロファージが共存培養モデルのCa 2 +動員のために使用された。 </li><li>追加染料H 2 DCF - DA（Invitrogen社）がECMで、10μMの最終濃度を（細胞外培地与えるために酸化感受性：121 mMのNaCl、5mMの飽和NaHCO 3、10mMののNa - HEPES、4.7 mMの塩化カリウム、1.2 mMのKH 2 PO 4、1.2 mMのMgSO 4を 、2mMのCaCl 2を 、10mMグルコース、2.0％デキストラン、pH7.4の、Sigma社から入手したすべての）共焦点顕微鏡下で可視化する前に20分間料理とインキュベート細胞に2％BSAを含む。 </li><li>染料ロード後に、適切なイメージングシステムの温度制御されたステージ上に置か細胞を可視化する。我々は40倍油浸対物13（図1AおよびD）を使用してDCF蛍光用488nmの励起にアルゴンイオンレーザ光 ​​源と組み合わせることカールツァイスLSM 510のメタ共焦点イメージングシステムを使用してください。 </li><li> ImageJのソフトウェア（1.44）、国立衛生研究所から自由に入手可能なソフトウェアを（Rasband、WS、ImageJは、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国、使用して画像を分析<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij /</a> 、1997〜2009）。 </li></ol> 2。 J774細胞におけるmROSの可視化<ol><li> 48時間、35 - mmディッシュ（ハーバード装置）ガラスの底にJ774.1マウス単球由来マクロファージを（10 6細胞/ ml）を成長する</li><li>mROSの生産誘導するTLRリガンドで細胞に挑戦（2μg/ mlを、リポ - テイコ酸- TLR2を、10μg/ml、ポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）37 6時間℃ですC. </li><li> ° CのMitoSOXレッドのロードを許可するために37℃で30分間料理とインキュベート細胞に2％BSAを含むECMの5μMの最終濃度を得たミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターMitoSOXレッド（Invitrogen社）を追加します。 </li><li>染料ロード後に、40倍油浸対物（図1BおよびE）を使用してMitoSOX赤蛍光のための561 nmの励起でのアルゴンイオンレーザー光源を持つカールツァイスLSM 510メタ共焦点イメージングシステムの夫婦の温度制御されたステージ上で細胞を可視化する。 </li><li>対照実験のため、色素ローディング追加PBSまたはDMSO（ネガティブコントロール）または2μmののアンチマイシン後（ミトコンドリアのスーパーオキシドのような発電機陽性対照）細胞への事前の画像サンプルを2.4（図1C）で説明したように。 </li><li> ImageJのソフトウェア（1.44）を使って画像を分析する。 </li></ol> 3。 Visualizati安定したハイパーCYTO MPMVECsにおける細胞質ROSの上<ol><li>我々はpHyPer - CYTO（Evrogen）哺乳動物発現ベクターのエンコーディング細胞質およびH 2 O 2 14の特に感覚マイクロモル以下の濃度に局在する蛍光センサーのハイパーを使用してください。 </li><li>エレクトロポレーションまたはトランスフェクション試薬のいずれかを使用してpHyPer - CYTOベクターでトランスフェマウス肺微小血管内皮細胞（MPMVECs）。我々は、バイオラッドジーンパルサーエレクトロ系（、500μF250V）を用いてエレクトロを経由してpHyPer - CYTOの10μgの10 × 10 6個の細胞とトランスフェを使用してください。 DMEM培地で培養MPMVECsは、10％FBS、非必須アミノ酸、内皮細胞増殖サプリメントと抗生物質を補充した。 注：以下のトランスフェクション、コロニーの成長を促進するために低密度でプレートの細胞。 </li><li> 500μg/ mlのG418、トランスフェクション後48時間を添加した完全培地で培地を交換してください。 Hの割合が最も高いを持つクローンの画面<html>ハイパー陽性細胞（図2）の数を増やすことyPer陽性細胞と継代ハイパー陽性クローン。 注：私たちは、非常にハイパーを発現する安定細胞の単一細胞とスクリーンのクローン選択のために細胞の希釈系列を使用する。 </li><li> 0.2パーセントゼラチンコートしたカバースリップ（80％コンフルエント）で安定したハイパーCYTO MPMVECsを成長する。 TLRのリガンドと翌日のチャレンジ細胞（2μg/ mlを、リポテイコ酸- TLR2、10μg/ml、ポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）6時間37℃未処理の細胞は、対照として役立つ。 </li><li>治療後、Attofluorセル室（Invitrogen社）にカバースリップをマウントします。チャンバーへのハンクス平衡塩溶液（HBSS）を暖め、事前の1mlを追加し、カールツァイスLSM 510メタ共焦点イメージングシステムの温度制御されたステージ上のチャンバーを配置。視覚化し、40倍油浸対物（図3AおよびD）を用いて488nmの励起での画像の蛍光の変化。 </li><li> ImageJのソフトウェアを（1.44）（セクション6を参照）を使用して画像を分析する。 </li></ol>安定したハイパーdMito MPMVECsにおけるミトコンドリアROSのitle&quot;&gt; 4。可視化<ol><li>我々はpHyPer - dMito（Evrogen）H 2 O 2の、特にミトコンドリアと感覚マイクロモル以下の濃度に局在する哺乳動物発現ベクターのエンコーディングミトコンドリアを標的としたハイパーを使用してください。 </li><li>トランスフェクションのpHyPer - dMitoとMPMVECsとは、セクション3.2から3.3で説明されている手順に従って、安定したハイパーdMitoのMPMVECsを生成します。 </li><li> 0.2パーセントゼラチンコートしたカバースリップ（80％コンフルエント）で安定したハイパーdMito MPMVECsを成長する。 </li><li> TLRのリガンドと翌日のチャレンジ細胞（2μg/ mlを、リポテイコ酸- TLR2、10μg/ml、ポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）6時間37℃未処理の細胞は、ネガティブコントロールとして機能します。 2μmのアンチマイシン（ミトコンドリアスーパーオキシド誘導物質陽性対照は）前に視覚化するためにサンプルを追加。 </li><li>治療後、Attofluorセル室（Invitrogen社）にカバースリップをマウントします。チャンバーに予め温めておいたハンクス平衡塩溶液（HBSS）1mlのを追加します。とカールツァイスLSM 510メタ共焦点イメージングシステムの温度制御ステージにチャンバーを配置。視覚化し、40倍油浸対物（図3B、CとE）を用いて488nmの励起での画像の蛍光の変化。 </li><li> ImageJのソフトウェアを（1.44）（セクション6を参照）を使用して画像を分析する。 </li></ol> 5。のCa 2をトリガパラクリン由来ROSの可視化のための共培養モデル+内皮細胞のシグナル伝達我々は、Ca 2を使用する [Ca 2 +] iの変化+感受性蛍光色素フルオレセイン- 4 AM（Invitrogen社）の可視化と計測のための。 <ol><li> 0.2パーセントゼラチンコートした25ミリメートルのガラスのカバースリップ（80％コンフルエント）にMPMVECsを成長する。 </li><li> ECMの30分が2％BSAと5μMであるFluo - 4 AM（Invitrogen）を蛍光- 4 AMをロードできるように、最終濃度0.003％のプルロニック酸を含むため、室温でカバースリップ上で培養した細胞をインキュベートする。ロード後に、実験的なイメージングソリューション（ECM、0を含むで細胞を洗浄する。色素の損失を最小限に抑えるためにスルフィンピラゾンを含む25％BSA）。 </li><li> Attofluorセル室（Invitrogen社）にみたFluo - 4、マウントカバースリップをロードした後。チャンバーに予め温めておいた実験的なイメージングソリューションの800μlを追加し、カールツァイスLSM 510メタ共焦点イメージングシステムの温度制御されたステージの上に置きます。 </li><li> 2％BSAを含むECMでセルトラッカー赤CMTPX（500ng/ml）（Invitrogen社）を有するマウス（6時間LPSで処理） -別々のチューブのラベルに非活性化または活性化マクロファージは、野生型またはgp91 phoxの- /のどちらかから分離と0.003％プルロニック酸。実験的なイメージングソリューションの200μlので細胞を洗浄し、懸濁します。 </li><li>チャンバー内のアセンブリの蛍光- 4がロード午前MPMVECsへのラベル付けマクロファージを追加。 </li><li>蛍光- 4 AMと細胞トラッカー赤色蛍光respectivelのための488および561 nmで励起によるアルゴンイオンレーザーを光源とカールツァイスLSM510メタ共焦点イメージングシステムを用いて10〜20分間、緑色と赤色の蛍光ごとに3秒を記録Y（図4 AC）。 注：別の方法として、J774.1細胞株がMPMVECsのCa 2 +動員を誘発するために使用することができる。 </li><li> ImageJのソフトウェアを（1.44）（セクション6を参照）を用いて蛍光- 4蛍光強度の変化を分析。 </li></ol> 6。 ImageJのソフトウェアを使用してデータ分析データ分析のため。LSMのフォーマットのファイルとして共焦点システムから取得した画像を転送。 ZEN 2009年とLSM 510メタ共焦点顕微鏡またはLSM 710多光子共焦点顕微鏡に付属のZEN 2010ソフトウェアは、それぞれ。LSMの形式でファイルを保存します。我々は、このネイティブを使用することをお勧めします。LSMファイルを画像解析のために元の品質が保持される。このファイル形式は、直接J.以下の手順では、単一のイメージの例定量分析を提供する画像解析プログラムのイメージで開くことができます。追加のプラグインは、このデータ解析は必要ありません。 <ol><li> FILE&gt; OPENを使用して画像Jのプログラムで開いている。LSMまたは。TIFFファイル</li><li>タブの画像をクリック&gt; COLOR&gt; SPLITチャンネルと緑とDICのチャンネルを分割。その後の分析のための緑のチャンネルから画像を使用してください。 </li><li>ダブルクリックすると&quot;楕円形ブラシの選択&quot;タブを選択して、20ピクセルの値を設定します。 </li><li>ハイパーCYTO画像では、測定の円形の領域を定義する単一のセルをクリックしてください。その後、選択した領域の強度を測定する&quot;M&quot;キーを押してください。値は、新しい結果ウィンドウに保持されます。 </li><li> &quot;M&quot;キーを押すことによって、続いて別の領域を、選択するために別のセルには&quot;Shift&quot;キークリックを保持することによって、次の。強度は、結果ウィンドウに記録されます。 50種類のセル4-5の手順を繰り返します。 </li><li>ハイパーD -水戸の画像では、楕円ブラシの選択の10のピクセル値を設定します。関心領域（ROI）は、手動で特定の細胞のミトコンドリアを含むトレースする必要があります。 </li><li>フリーハンドを使用して、&quot;M&quot;を押してミトコンドリアの周りの領域をトレースして。 50種類のセル上で6から7の手順を繰り返します。 </li><li>私をコピーします。<html> Excelシートや結果をプロットするために、任意のソフトウェアで結果ウィンドウと貼り付けの値。我々は、グラフなどのデータをプロットするSigmaPlotのかグラフパッドPRISMのいずれかを使用。 </li></ol> 7。代表的な結果図1は、TLRのリガンドとの挑戦に応じて細胞質とミトコンドリアROS産生を示しています。代表的な共焦点画像は、DCF（細胞質）とMitoSOX赤（ミトコンドリア）刺激の6時間後の蛍光の増加を示す。蛍光の変化は、倍の変化として正規化し、発現させた。 図2は、安定したハイパーCYTOおよびHyper - dMito内皮細胞の生成を示しています。マウス内皮細胞をエレクトロポレーションを介したpHyPer - CYTOまたはpHyPer - dMitoプラスミド構築物でトランスフェクションした。安定してプラスミドを発現する細胞は、2週間のG418で選択した。選択後、希釈した細胞を96ウェルプレートに播種した。個々のコロニーを単離し、均一な発現のために画像化した。 e_content&quot;&gt;図3は、内皮細胞質とミトコンドリアのH 2 O 2レベルの測定を示しています。代表的な共焦点画像は、Hyper - CYTO（細胞質）およびHyper - dMito（ミトコンドリア）刺激の6時間後の蛍光の増加を示す。蛍光強度の変化が正規化されたと倍の変化として表現。 図4は、マクロファージ由来ROS誘発内皮細胞質ゾルのCa 2 +動員の評価を示しています。 LPS刺激マクロファージは、以前は+（[Ca 2 +] iの）インジケーター色素であるFluo - 4細胞内Ca 2でロードされていた肺微小血管内皮細胞（PMVEC）に追加されました。野生型のアプリケーションがLPS活性化マクロファージは、〔Ca 2 +] iは機能的なNADPHオキシダーゼ（gp91 phoxの- / - ）のノックアウトによって減衰したPMVECsに上昇誘発。 <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 Visualizatiマクロファージのに携帯ROSとミトコンドリアのスーパーオキシドを生成する。 J774.1細胞はTLR2、3と4配位でチャレンジした。（2μg/ mlを、リポテイコ酸- TLR2、10μg/ml、ポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）を6時間で37℃または（B）ミトコンドリアスーパーオキシドインジケーター（MitoSOXレッド、赤色蛍光）、治療の細胞は、（A）携帯ROSインジケータ（緑色蛍光H 2 DCF - DA）を充填した後。 （C）アンチマイシンAは、ミトコンドリアROS産生のためのポジティブコントロールとして使用した。蛍光強度の変化は、共焦点顕微鏡を用いて評価した。 （D）および平均蛍光変化の（E）定量。 <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。内皮細胞の細胞質とミトコンドリアROSの指標の安定した発現を生成するの模式図。 <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。 V。内皮細胞質とミトコンドリアのH 2 O 2レベルのisualization安定ハイパーCYTO（）を発現または（B）のHyper - dMitoがTLR2とチャレンジしたMPMVECs、3と4配位子（2μg/ mlを、リポテイコ酸- TLR2、10μgの/ mlのポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）6時間37℃ （C）アンチマイシンAは、ミトコンドリアROS産生のためのポジティブコントロールとして使用した。治療後、蛍光強度の変化は、共焦点顕微鏡を用いて評価した。 （D）および平均蛍光変化の（E）定量。 <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 ROSは、障害内皮細胞のCa 2 +動員を誘導するマクロファージ由来。 （A）内皮細胞/マクロファージの共培養モデルの研究の模式図。WTとgp91phox欠損マウス（ジャクソン研究所）の両方から（B）新しく単離したマウスマクロファージは6時間に1μg/ mlのLPSによって活性化したMacrophagesが細胞トラッカーレッド（赤）で標識し、パラクリンO 2•評価するためであるFluo - 4ロードPMVECs（緑）の上に追加された- 。シグナリング（C）WTマウスから単離したLPS活性化マクロファージは、大規模で急速なCa 2 +の動員を誘発したPMVECsでgp91phox欠損マウス由来のマクロファージと比較。マクロファージ活性化の検証は、以前は実証されています。

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	<li>Madesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+role+for+superoxide+in+InsP3+receptor-mediated+mitochondrial+dysfunction+and+endothelial+apoptosis.">Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis.</a> J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).</li><li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function.">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).</li><li>Hamanaka, R. B., Chandel, N. 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利害の衝突は宣言されません。

方法は、細胞を生きたどちら酸化感受性色素やプラスミドセンサーを使用して活性酸素種の迅速かつ定量的な測定を可能にするここで説明する。 TLRのアゴニスト（Toll様受容体）は細胞表面上に存在するTLRを介して細胞を刺激し、下流のシグナル伝達経路15を引き起こす化合物である。我々のプロトコルでは、我々は、3つの異なるTLRアゴニストのVIZを使用し、リポ - テイコ酸- TLR2アゴ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> Attofluor細胞室</td><td>インビトロジェン</td><td> A7816 </td></tr><tr><td>アンチマイシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A8674 </td></tr><tr><td> DMEM低グルコース培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 10567-014 </td></tr><tr><td>内皮細胞増殖因子のサプリメント（心電図） </td><td>州の北部</td><td> 02から102 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 12662011 </td></tr><tr><td> G418 </td><td>インビトロジェン</td><td> 10131-027 </td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G1393 </td></tr><tr><td> H 2 DCFDA </td><td>インビトロジェン</td><td> D - 399 </td></tr><tr><td> LPS </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> L4516 </td></tr><tr><td> LTA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> L2515 </td></tr><tr><td> MitoSOXレッド</td><td>インビトロジェン</td><td> M36008 </td></tr><tr><td>のOpti - MEM Iには、血清培地を削減</td><td>インビトロジェン</td><td> 51985091 </td></tr><tr><td>ペン/咽頭（10倍） </td><td>インビトロジェン</td><td> 15140163 </td></tr><tr><td> pHyPer - CYTO </td><td> Evrogen </td><td> FP941 </td></tr><tr><td> pHyPer - dMito </td><td> Evrogen </td><td> FP942 </td></tr><tr><td>ポリ（I：C） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P0913 </td></tr><tr><td>プリズムソフトウェア5.0 </td><td>グラフパッドソフトウェア社</td><td></td></tr><tr><td> SigmaPlotの11.0 </td><td> SYSTATソフトウェア株式会社</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン- EDTA（10倍） </td><td>インビトロジェン</td><td> 15400054 </td></tr><tr><td> T - 25フラスコ</td><td>コー​​ニング</td><td> 430639 </td></tr><tr><td> T - 75フラスコ</td><td> BDファルコン</td><td> 353136 </td></tr><tr><td> 96ウェルTCマイクロウェルプレート</td><td> BDファルコン</td><td> 353072 </td></tr><tr><td>禅2009ソフトウェア</td><td>カールツァイス510メタ共焦点顕微鏡</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of vascular ca2+ signaling triggered by paracrine derived ros

酸化ストレスは、虚血/再灌流損傷、敗血症を含む病理学的条件の数に関与している。 、H 2 O 2、及びヒドロキシルラジカル-酸化ストレスの概念は、O 2•を含むROSの異常形成（活性酸素種）を指します。活性酸素種は、シグナル伝達、細胞増殖と細胞死1から6を含む細胞プロセスの多数に影響を与えます。 ROSは直接、血管や臓器の細胞を損傷する可能性を持って、そして最終的に最初のROSを介する組織損傷の増幅につながる二次化学反応と遺伝的変化を開始することができます。不可逆的な組織損傷を悪化させる増幅カスケードの主要なコンポーネントは、炎症細胞を循環の動員および活性化です。炎症時に、炎症性細胞は、腫瘍壊死因子-α（TNFα）とIL - 1そのようなサイトカインを産内皮細胞（EC）および上皮細胞を活性化し、さらに炎症反応7を増大させる。血管内皮機能障害は、急性炎症の確立された機能です。マクロファージは不明のままメカニズムによって炎症時に血管内皮機能障害に寄与する。 O 2の細胞外放出におけるマクロファージの結果のアクティベーション• -隣接セル内の病理学的シグナル8をトリガすると、様々な炎症性サイトカイン、。 NADPHオキシダーゼは、細胞型のほとんどにROSのメジャーと主な情報源です。最近では、NADPHオキシダーゼによって生成されたROSは、多くの病態生理学的状態の間にミトコンドリアROS産生を誘導することを私達と他の9,10によって示されています。したがって、ミトコンドリアROS産生を測定することは細胞質ROSの測定に加えて、同様に重要です。マクロファージは、炎症の主要な役割を果たしているフラビン酵素のNADPHオキシダーゼによるROSを生成する。一度活性化、宿主の防御機構11,12で重要である-食細胞NADPHオキシダーゼは、O 2大量の•を生成します。 •パラクリン由来のO 2がは- +動員はまだ仮説であるCa 2を含むパラクリンROS誘発性細胞内シグナルの可視化、血管疾患の病因に重要な役割を果たしている。隣接する内皮細胞へシグナルを伝達するために-私たちは、活性化マクロファージがO 2•のソースとして使用されているモデルを開発した。隣接する内皮細胞のシグナル伝達カルシウムにつながる-このモデルを使用して我々は、O 2•はマクロファージ由来を示しています。

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Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

内皮のCa2 +シグナリングのパラクリン由来ROSの誘導を可視化についての洞察を得るために効率的な方法が記載されている。このメソッドは、共培養モデルにおける血管内皮細胞におけるCa 2 +の動員を引き起こしたパラクリン由来ROSを測定を利用しています。

血管のCaの可視化 2 +パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

visualization-vascular-ca2-signaling-triggered-paracrine-derived

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Biology

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

15.4K ビュー.  Temple University. 内皮のCa2 +シグナリングのパラクリン由来ROSの誘導を可視化についての洞察を得るために効率的な方法が記載されている。このメソッドは、共培養モデルにおける血管内皮細胞におけるCa 2 +の動員を引き起こしたパラクリン由来ROSを測定を利用しています。

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

イメージングカルシウムのためのテクニック 2 +人間の精子でシグナリング

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

生物学

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

糞便グルココルチコイド分析：ウマにおける非侵襲性副腎モニタリング

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

血管視覚化のためのDiI灌流<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&amp;#946; Signaling

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

網膜の低温電子顕微鏡セクション全体-マウント、および微小血管の免疫組織化学的可視化の低張性分離血管準備

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Paracrine or juxtacrine signaling mediates such interactions. The use of a conditioned medium and coculture studies are the most common methods to discriminate between these two types of interactions. However, the effect of localized high concentrations of secreted factors in the microenvironment during the paracrine interactions is not accurately recapitulated by conditioned medium and, thus, may lead to imprecise conclusions. To overcome this problem, we have devised a proximal culture method to study paracrine signaling. The two cell types are grown on either surface of a 10 &#181;m-thick polycarbonate membrane with 0.4 &#181;m pores. The pores allow the exchange of secreted factors and, at the same time, inhibit juxtacrine signaling. The cells can be collected and lysed at the endpoint to determine the effects of the paracrine signaling. In addition to allowing for localized concentration gradients of secreted factors, this method is amenable to experiments involving prolonged periods of culture, as well as the use of inhibitors. While we use this method to study the interactions between ovarian cancer cells and the mesothelial cells they encounter at the site of metastasis, it can be adapted to any two adherent cell types for researchers to study paracrine signaling in various fields, including tumor microenvironment, immunology, and development.

Paracrine and juxtacrine cellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Here, a proximal culture method is used to study paracrine signaling where the localized concentrations of the secreted factors are maintained while preventing direct cellular contact.

パラ分泌細胞間シグナル研究に近位の培養法

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells downstream of pattern recognition receptors. Best studied are the Dectin-1 and Dectin-2 members of the C-type lectin-like receptor family that induce a SYK- and CARD9-dependent signaling cascade leading to NF-&#954;B activation, in a MALT1-dependent manner. By contrast, Toll-like receptors (TLR), such as TLR-4, propagate NF-&#954;B activation but signal via an MYD88/IRAK-dependent cascade. Nonetheless, whether MALT1 might contribute to TLR-4 signaling has remained unclear. Recent evidence with MLT-827, a potent and selective inhibitor of MALT1 paracaspase activity, indicates that TNF- production downstream of TLR-4 in human myeloid cells is independent of MALT1, as opposed to TNF- production downstream of Dectin-1, which is MALT1 dependent. Here, we addressed the selective involvement of MALT1 in pattern recognition sensing further, using a variety of human and mouse cellular preparations, and stimulation of Dectin-1, MINCLE or TLR-4 pathways. We also provided additional insights by exploring cytokines beyond TNF-, and by comparing MLT-827 to a SYK inhibitor (Cpd11) and to an IKK inhibitor (AFN700). Collectively, the data provided further evidence for the MALT1-dependency of C-type lectin-like receptor &#8212;signaling by contrast to TLR-signaling.

MALT1 regulates innate immunity but how this occurs remains ill-defined. We used the selective MALT1 paracaspase inhibitor MLT-827 to unravel the contribution of MALT1 to innate signaling downstream of Toll-like or C-type lectin-like receptors, demonstrating that MALT1 regulates the production of myeloid cytokines, and downstream of C-type lectin-like receptors, selectively.

MALT1 Paracaspase 活動による骨髄性生得的なシグナル伝達経路制御

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

その場で細胞内 Ca2 +シグナル伝達を定量化する時空マッピングと粒子分析技術の応用

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...