脳血管系は、動脈、毛細血管、および上昇する小胞を貫通する複雑なネットワークです。これらの血管は、アルファ平滑筋アクチンを発現する包皮周囲細胞のような壁画細胞に包まれ、動脈を貫通することから最初の4つの枝内に見られる。我々は、遺伝子組み換えカルシウム指標RCaMPの発現を通じて、これらの細胞におけるカルシウム過渡的な可視化を行う、Acta2-RCaMP 1.07トランスジェニックマウスを用いる。
カルシウムは、これらの細胞の収縮と血流制御に強い役割を果たしています。.毛細血管系のペリサイトは、血管ネットワークの下流に見られ、他のトランスジェニックモデルで標識することができます。しかし、我々はこの方法で包み込むペリシテに焦点を当てています。
私たちのマウスは、イメージングのための脳血管系へのアクセスを可能にする慢性頭蓋窓を外科的に移植されています。ここでは、麻酔動物の血液の流れに関する情報と、カルシウムの近菌データを取得するために必要な2つの光子イメージングおよび分析方法を用いて、必要な準備ステップと尾静脈注射について概説する。尾静脈カテーテル注射には、インスリン注射器、15センチメートルのPE10チューブ、30ゲージ針、ガーゼ、生理食い、鉗子、緑色蛍光ペン、およびはさみが必要です。
また、血の流量測定のためのイソフルランよりも優れているため、イメージングの前に注入するケタミンキシラジン麻酔を伴う針を持っています。ペンチを使用して、ハブから30ゲージの針を破ります。慎重に生理食糸で満たされた注射器に取り付けられたPE10チューブの端に針を挿入します。
これは注射のためのカテーテルである。イオブルランでマウスを麻酔し、I-潤滑ゲルを塗布します。尾にぬるま湯を入れたグローブフィールドを置き、横静脈を拡張します。
エタノールで尾部を洗浄した後、静脈に針を挿入し、針が正しく配置されていることを確認するためにカテーテルを通して生理食い物を静かに注入する。蛍光体デキストラン染料で満たされた注射器のカテーテルの注射器を切り替えます。ゆっくりと染料を注入して、泡がチューブに入らないようにします。
デキストランシリンジを生理食音シリンジに交換し、チューブに染料が残らなくなるまでチューブをすすいでください。針を外し、ガーゼで押します。イメージング用ケタミンキシラジン麻酔を注入します。
マウスヘッドを加熱パッドに固定して、歯のアプリケータで頭蓋の窓を清掃します。窓に超音波ゲルを適用し、2つの光子顕微鏡の目的を通して焦点を当てます。2つの光子イメージングでは、蛍光、励起、光増倍管にチューン可能なチタンサファイアレーザーを用いた顕微鏡を使用して発光検出を行います。
顕微鏡ソフトウェアでは、波長を990ナノメートルに設定して、RCaMPとフルオレセインデキストランの両方を励起します。次に、ポッケルセル電圧とPMT検出器感度を調整してレーザーパワーを設定します。これらのパラメータと高分解能を伴うライブスキャン、RCaMP陽性の壁画細胞および蛍光標識された血漿が見られる。
深度スタックの取得は、血管ネットワーク内のペリサイトを適切に配置することをお勧めします。PO容器の近くの組織の上部に焦点を当てる場合は、これをZedシリーズスタックのゼロポイントとトップに設定し、組織を所望の深さに下ろし、これをスタックの底として設定します。顕微鏡が積み重ねの奥深くに移動するにつれて、レーザーパワーを調整して増加させる必要があります。
画像処理ソフトウェアでZedシリーズを開き、色付き画像として2つのチャンネルをマージし、関心のあるpericytesと血管のためのスタックをスキャンします。ペリサイトを含む対象領域を選択し、将来のイメージングセッションでこれらのスポットを再び見つけるのに役立つ位置を保存します。ペリサイトカルシウムイベントを収集して移動するには、取得フレームレートを毎秒10フレーム以上に増やします。
イメージング時間を60秒に設定し、保存パスを一意のファイル名で更新します。低い解像度を考慮し、船舶の近くに見るために容器を光学的にズームします。Tシリーズを取得します。
血管径と赤血球速度を測定するには、ラインスキャンを選択して顕微鏡で1次元スキャンを開始します。最初に、スキャンの期間をミリ秒単位で設定します。その後、目的の容器を二分し、船に沿って平行に移動する線を描きます。
これは、左側の血管径の円グラフを生成し、右側の血管を通過する赤血球の筋を生成します。このプロトコルで使用されるプログラムとパッケージの完全なリストについては、資料表を参照してください。まず画像処理ソフトウェアで手で関心のある領域を選択します。
T シリーズ ファイルをロードし、スタックの平均を取得し、色付きのイメージを作成します。ポリゴンツールを選択し、ソーマやプロセスなどの可視の包色ペリサイト構造の輪郭を描きます。対象地域ごとに一意の名前を付け、後でプログラミング ソフトウェアで読み込むことができる zip フォルダとして保存します。
プログラミング ソフトウェアを開き、イメージ処理パッケージのフォルダーがパス上に表示されていることを確認します。カルシウムTシリーズをプログラミングソフトウェアにインポートし、各チャンネルの内容を定義します。この場合、チャネル1とチャンネル2の血漿上の細胞信号である。
ビジュアル化を容易にするために、データをプログラミング ソフトウェア内でムービーとしてプロットします。赤いRCaMPチャネルに出血するフルオレセインデキストランから緑色の蛍光を除去するには、画像処理パッケージのチャンネルをアンミックスします。まず、この場合、フルオロフォア1、RCaMPのみを含む領域を選択します。
第二に、フッ素2、血漿中のフルオレセインのみを含む領域を選択する。最後に、蛍光素を持たない背景領域を選択します。これにより、スペクトル寄与行列が生成され、各チャンネルの各ピクセルに適用されます。
RCaMPシグナルの局在化が著しく改善され、これらの構造におけるカルシウム事象の検出が強化されます。画像処理パッケージ内でカルシウムイメージングデータを分析する方法は複数あります。まず、混合されていないカルシウムムービーで細胞信号解析を実行し、先ほど手でペリサイトから選択したzipフォルダから関心のある領域をロードします。
領域のサイズを変更する必要がないため、スケール係数を 1 に設定します。処理後、各ROYのプロットと正規化されたカルシウムトレースを異なる色で生成します。コードが個々のトレースでカルシウムイベントの大部分を検出しない場合は、ショートパスフィルターデータのしきい値をベースライン期間の標準偏差の3倍に下げることなど、最適化ボックス内の組み込みパラメーターを変更します。
信号を検出して分類するために、正規化されたカルシウムトレースはロングパスとバンドパスがフィルタリングされ、振幅や推定値のデータを平滑化するのに役立ちますが、信号が単一のピーク、マルチピーク、またはプラトーであるかどうかを判断するのにも役立ちます。さらに統計分析を行うため、データを CSV ファイルとして出力します。細胞シグナル伝達解析を混合されていないカルシウムムービーで 2 回目に実行し、X、Y、時間の 3 次元の蛍光の活性と変化に基づいて、関心のある対象領域を選択します。
対象の特定された領域が異なる色を表示するプロセス結果をプロットします。ムービー内で目ではっきりと見える ROY が検出されない場合は、データを時間内に平滑化するガウスフィルタを増やし、ROY を求める閾値をベースラインの標準偏差の 3 倍に下げるなど、組み込みパラメータを変更します。さらに視覚化するために、ROYをムービーとしてプロットします。
さらに統計分析を行うため、データを CSV ファイルとして出力します。ラインスキャンのキモグラフデータファイルをプログラミングソフトウェアにインポートし、各チャンネルの内容を定義します。ラインスキャンで直径解析機能を実行すると、ボックスが開き、キモグラフの直径に対応する領域を選択できます。
血管径に対応する、キモグラフ蛍光の境界の外側にボックスを描きます。このデータクラスを処理して、容器径の半分の最大で全幅を測定し、プロットを生成します。次に、変換解析の速度速度を実行し、キモグラフ蛍光の境界内にボックスを描画します。
赤血球の速度、流束、および線形密度を計算するために、このデータクラスを処理します。さらに分析するために、血流結果をCSVファイルとして出力します。細胞構造を手作業で選択すると、正規化されたカルシウムトレースがローパスおよびバンドパスがフィルタリングされた後、単一のピークやマルチピークなどの異なるタイプの信号ピークを含む、これらの領域内のカルシウム変動を検出することができます。
さらに、対象領域は、画像処理アルゴリズムを使用して蛍光強度が時間の経過とともに変化するアクティブピクセルをグループ化することによって識別されます。これは、信号の予想サイズと形状を包含する時間、閾値、および空間的パラメータを調整することによって、任意の動的なセルラー信号に適用することができます。シグナル識別のしきい値を小さくすると、関心のある領域が増えます。
明確な血行力学的な動調を分析し、血管の血管の直径と赤血球速度を測定します。直径は、蛍光の半分の最大で全幅から計算されます。赤血球速度は、ラベルなしの赤血球から作られた筋から近似され、角度はラドン変換に入力され、速度を計算する。
低品質のキモグラフは、蛍光飽和、信号対雑音比の悪さ、または画像化場の動きが存在し、データが決定できない赤い十字として示されるエラーポイントを持つ信頼性の低いプロットを作成します。取得したデータの品質は、良い結果を得る上で重要であり、このプロトコルで説明されている手順に従うことで、良好な結果が得られます。このビデオでは、脳を包み込むpericytesのカルシウムイメージングと2つの光子顕微鏡による血流測定を組み合わせた手順を概説する。
これらの技術は、脳血管ネットワーク内の壁画細胞生理学および局在化に関する質問に対処するのに有用であるが、それらは脳または他の器官系の任意の細胞型におけるカルシウム過渡症を研究するために適応することができる。
