私たちは、プロトコルを実証するために、図1とアンナRatliffを準備支援のためメリッサ作者：klockeに感謝します。この作品は、科学振興のための研究·コーポレーションがサポートされていました。

1。微小管グライディングアッセイストックソリューション前方に滑空アッセイの準備をします。 <ol><li>まばらに明るい有機蛍光色素で標識された22 0.5mgの微小管を重合する。目標ラベル濃度は1マイクロメートルの微小管あたりフルオロフォア、または1500チューブリン二量体あたり約1フルオロフォアの標識密度である。室温、アルミで保護光、最大2週間のために箔で保存してください。 </li><li>約1μMでビオチンキネシン21を精製する 。 -80℃で保存、個々の実験で使用するための5μlをインチ</li><li> 50mMのimidiazole、50mMの塩化カリウム（KCl）、4 mMの塩化マグネシウム（MgCl 2）、2mMのエチレングリコール四酢酸（EGTA）、pH値6.7のアッセイバッファー（AB）を準備します。 4で滅菌フィルターと℃で保存</li><li> ABの2 mg / mlに（ビオチン-BSA）をビオチン化ウシ血清アルブミンを溶解。 0.2μmのシリンジフィルターでフィルタリングします。-80℃で保存4℃で長期間100μlアリコート中のC、°1月までのC。 </li><li> ABの10 mg / mlにストレプトアビジン（SA）を溶かす。 0.2μmのシリンジフィルターでフィルタリングします。 -80℃で保存4℃で長期間20μlのアリコート、°2週間までのCのC。 </li><li> ABの5 mg / mlにα-カゼインを溶解。 0.2μmのシリンジフィルターでフィルタリングします。 -80℃で保存4℃で長期間100μlアリコート中のC、°2週間までのC。 </li><li> 200 mMの脱イオン水にジチオスレイトール（DTT）を溶かす。 100μlアリコートで-20℃で保存し、凍結融解の8時間内でご使用ください。再凍結することができます。 </li><li> 4 mMでHPLCグレードのジメチルスルホキシド（DMSO）にパクリタキセル（PT）を溶かす。 -8010μlアリコートで保管℃の長期、-20℃の短期。解凍の8時間以内に使用してください。再凍結することができます。 </li><li> 120 mg / mlの脱イオン水にグルコースを溶かす。 -20℃で100μlアリコートで保管再凍結することができます。 </li><li> DIS150ミリメートル、pH7.0で脱イオン水にアデノシン三リン酸（ATP）を解く。 -805μlのアリコートで保管℃、融解の8時間内での使用。 </li><li> 100xの600μlの全アッセイバッファーにカタラーゼ万単位のグルコースオキシダーゼと156000単位を溶解することにより株式25脱酸素を準備します。ペレットを固体にマイクロ遠心機に軽く遠心する。0.2μmのシリンジフィルターとフィルター上澄み。 -80℃で保存4℃で長期間10μlアリコート、℃で1週間までのCのC。 </li></ol> 2。微小管グライディングアッセイ、同日溶液の調製実験の日に2.1から2.6でのソリューションを用意してください。練習すれば、解決策は、2.2から2.6フローセルの洗浄時に調製することができる。特に断りのない限り、氷の上に原液を保つ。 <ol><li> DTTの株式の10μl（2mMのDTTとAB）がAB、アッセイ緩​​衝液1mlを準備します。室温で保管してください。 </li><li>バイオBSA緩衝液、40＆ムーを準備;ビオチン-BSAを株式とABとの1:1混合物リットル。室温で保管してください。 </li><li> 5.5μlのBSA（ABの1 mg / mlのBSA）でABの645μlを混合して、BSA緩衝液を準備します。室温で保管してください。 </li><li> 3μlのストレプトアビジンストック（ABの0.5 mg / mlのストレプトアビジン）とABの57μlを混合して、SAのバッファを準備します。室温で保管してください。 </li><li> BSA緩衝液200μl、50μlのカゼイン株式、及び15μMのATP（1 mg / mlのα-カゼイン、0.8 mg / mlのBSA、50 nMのABのATP）の0.8μlを混合して、α-カゼインのバッファを準備します。室温で保管してください。 </li><li> 95μlのα-カゼイン酸緩衝液、2.5μlのグルコースストック、1μlの100倍酸素消去ミックス、1μlのパクリタキセル株式、1μlの2 - メルカプトエタノール（βME）を混合し、蛍光抗漂白バッファを準備します。ヒュームフードの下βMEを追加します。準備の1時間以内に蛍光抗漂白バッファを使用注意 ：βMEは非常に有毒であり、臭いはひどい。唯一のヒュームフードの下に開くようにしてください。にボトルを保管して光の不在、光がβMEと退色を軽減する能力を低下させます。 </li></ol> 3。微小管グライディングアッセイ<ol><li>スペーサーとしてピペットチップを通してシリンジから押し出した真空グリースを使用して、24×60 mmのカバーガラスと22×22mmのカバーガラスの間に4つのフローレーン、約構築します。各フローレーンは、ボリューム内の約10μlの（スケール以降のボリュームに応じて）でなければなりません。 </li><li>各レーンにバイオ - BSA緩衝液10μlを洗います。コー​​トガラス表面にBSAを可能にするために5分間インキュベートします。 </li><li>スライド表面をブロックし続けながら、フリーのビオチン-BSAを除去するために15μlのBSA緩衝液を各レーンに3回洗浄する。 気泡がフローチャンバーを通過できるようにしないように注意しながら 、フローチャンバーの反対側からバッファを削除するには、キムワイプまたはろ紙を使用しています。 </li><li>各レーンに15μlのSA-bufferを洗う。 10分、または最大2時間待ちます。ストレプトアビジンは、表面に結合したビオチン-BSAに結合するであろう。 </li><li>スライド表面をブロックしつつ、自由なSAを削除するには、15μlのBSA緩衝液を各レーンに3回洗浄する。 </li><li> 15μlのα-カゼイン緩衝液を用いて、各レーンを洗ってください。 α-カゼインはさらにキネシンと微小ガラスへの非特異的結合を阻止するのに役立ちます。 </li><li> α-カゼインバッファ内の10nmにキネシンを希釈し、このキネシンの15μlで、各レーンを洗う - α - カゼイン溶液。表面に結合したストレプトアビジンと特異的に結合するビオチン化キネシン15分間（または時間まで）待ちます。キネシンモータードメインは、微小管を結合する自由のままになります。 </li><li> 室温で40μMのα-カゼインバッファにパクリタキセルを希釈し、無料キネシンを洗い流すと脱重合から微小管を防ぐために、パクリタキセル溶液を用いて、各フローチャンバーを事前にロードするには、この溶液15μlを各レーンを洗う。風邪もそう部屋temperatuと室温でこれらの手順が発生していることを確認し、微小管を解重合ソリューションを再度。 </li><li>蛍光1mMのATPの蛍光抗漂白バッファに微小1:100-1:1,000というラベルが付いて希釈します。 1レーンに15μlを洗って30分以内に観察する。 </li></ol> 4。データ収集<ol><li>蛍光顕微鏡を用いて微小管滑空を守って、そのような商業目的または家庭築くTIRFのセットアップのような単一の蛍光団を解決することができる顕微鏡は26（ 図2）が必要です。 微小管は温度に応じて、約0.5μm/ sの速度で基板上にキネシンモーターによって推進されるべきである。顕微鏡の視野が50μmである場合、個々の微小管は、約100秒間表示されるはずです。単一の蛍光団はより迅速に100秒よりも退色しないように照度を設定します。レーザー励起を使用している場合は、約3〜5 mWの電力設定は適切である。 </li><li>分析のために画像のシーケンスを収集します。 600の画像で5 Hzの（2分の合計）がうまく動作します。十分な長さの微小管が全体の視野を横断するのシーケンスを使用します。 </li></ol> 5。データ解析 IDLのルーチン、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.proは</a> 、装着されている。このルーチンは、与えられた画像シーケンス内のすべての微小管滑走に基づく持続長の値を返します。いずれかの特定の顕微鏡のセットアップに応じて強度パラメータを変更し、各イメージシーケンスで、このルーチンを実行するか、次の操作を行います。 <ol><li>蛍光団の軌跡を作成するための微小管に接続された各蛍光体を追跡する。 </li><li>画像シーケンス内の各微小管（ 図3）を繰り返し、全体的な微小管軌道に与えられた微小管上のフルオロフォアの全軌跡を兼ね備えています。 </li><li>軌道に沿った各点の接線角度（ 図4）を計算します、と&lt;cosを計算θS&gt; EQインチパスの長さS（ 図5）で区切られたポイントのペアごとに角度差の余弦を平均化することにより1。 θs&gt;の式にフィッティング&lt;cosにより微小管の単一微小管またはグループの持続長を検索します。 1、加重平均を計算するために使用されるCoSθsの独立した値の数でフィット感で、個々のデータポイント。 </li></ol>

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著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

持続長の測定は、個々の生体高分子の機械的特性の優れた特性があります。この記事では、我々は、微小管の持続長を測定する方法を説明してきました。ように、ステップ1.1、3.9、、この方法は容易に単に滑空アッセイの最終工程で試薬、温度、粘度を変えることにより様々な条件で微小管の機械的性質を調べることに拡張される導入部で述べたように、または重合微小管によって、さまざ?...

細胞骨格は、ほとんどの真核生物の細胞に見出される生体高分子のネットワークは、細胞組織、細胞内輸送、細胞力学の役割を果たしている。細胞骨格（主にアクチンと微小管）の生体高分子の機械的特性は、全体の12として、セルの機械的特性を決定する上で重要な役割を果たしている。細胞全体のメカニックが13,14の健康と病気の細胞を特徴付けることができると細胞運動性15に関与しているので、基礎となる細胞骨格成分の機械的特性は、過去二十年の1のための研究の活発な領域となっている。 生体高分子の柔軟性（または剛性）の周囲温度における熱揺らぎの下で約1ラジアンによる持続長、曲がるポリマーの長さによって特徴付けられる。多くの技術がexampための持続長16を測定するために開発されてきた流体力学的流れ、光トラップ、または電界4,17,18、および溶液中の遊離ポリマー5,6の変動を測定する受動的手法を用いてポリマーを曲げ伴うルアクティブ技術。アクティブな測定値は、しかし、専門的なセットアップは、マイクロメートルスケールで知られている力を実装するために必要とし、自由変動の測定は、使用される顕微鏡の焦点面の拡散切れによる挑戦することができます。 この記事では、我々は、微小管、細胞骨格ポリマーの持続長を測定するための補完的な、受動的な、テクニックを説明します。技術は、ポリマーが常に焦点面19に残っていることを確認し滑空アッセイを伴う。また、ポリマーに沿った特定の場所が十分に特徴付けられるように、興味のあるポリマーに永久的に取り付け追跡単一フルオロフォアを伴う。 メソッドの漫画はFigurに示されているE 1。キネシンは微小管の+端に向けて具体的に移動するので、滑空アッセイにおける微小管は一方向に推進される。微小管の先端は、接続された最後のキネシンを越え、周囲の溶液の熱力の下で変動して自由である。微小管を前方に推進されるように、終わりはスライドガラスに沿ってさらに新しいキネシン分子に結合するまで、与えられた変動でフリーズ変動します。キネシンは非常に強く、微小管を添付しているため、微小管は先端の道を歩むように制約されます。したがって、微小管軌道に凍結統計的変動は微小管11の自由端の統計的変動と同じであるので、20によると持続長を計算するために使用することができます<img alt="式（1）" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" srC = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; L Pは微小管の持続長であり、θsは輪郭長で区切ら軌道への接線間の角度であり、&lt;&gt;輪郭長で区切ら位置のすべてのペアの平均を表している。 滑空アッセイ自体は、特にストレプトアビジン-ビオチン結合を介してスライドガラスに結合したコイルドコイル21でキネシンビオチン化が使用されます。このアタッチメントは、モータードメインはに結合し、微小管を推進して自由であることを保証します。微小管の軌跡をたどるためには、微小管はまばらに有機フルオロフォアで標識されている22,23 -ラベルは単一フルオロフォアが単一分子蛍光顕微鏡を用いて解決可能であることを十分に疎である必要があります。単一フルオロフォアはIDLで書かれた画像解析ルーチンを使用して追跡されます。各蛍光体の軌道が与えられたマイクにバインドrotubuleは自動的に24複合微小管軌道に結合されます。軌道に沿った各点からθ接線の角度が計算され、これらの接線の角度から&lt;cosθをs&gt;の値は、各輪郭長 sのために計算される。最後に、これらのデータは、式に合わされます。 1与えられた微小管のために持続長を抽出するために、または同じ滑走アッセイにおける多くの微小管のため。 この方法は、さまざまな条件（異なる安定化剤または微小管に結合した他の小分子と、結合した微小管関連タンパク質（MAP）を使って、または粘性溶液の様々）で作製した微小管で動作するように十分に堅牢です。私たちの研究室では、この技術は、異なる安定剤と微小管と微小管に沿って長さの関数として、微小管の持続長を特徴付けるために使用されています。主な制限は、微小管がまだの必要があるということですupportコマンドキネシンの運動。キネシンは、堅牢なモーター酵素であるので、これはかなり緩い制限です。ミオシンファミリーの酵素を用いてアクチンとキネシンと微小管を交換することによって、アクチンの持続長は、同じ手法を用いて測定することができる。

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt;試薬</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;イミダゾール</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;塩化カリウム</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;塩化マグネシウム</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt;カルビオケム</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ビオチン化BSA</td&gt;<td&gt;サーモサイエンティフィック</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;α-カゼイン</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ストレプトアビジン</td&gt;<td&gt;サーモサイエンティフィック</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ジチオスレイトール</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;パクリタキセル</td&gt;<td&gt; LC研究所</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;グルコースオキシダーゼ</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;カタラーゼ</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ブドウ糖</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2 - メルカプトエタノール</td&gt;<td&gt;シグマアルドリッチ</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt;有毒。少量を購入する。</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24X60ミリメートルナンバー1 1/2のカバーガラス</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x22のミリメートル1号のカバーガラス</td&gt;<td&gt;ゴールドシール</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;高真空用グリース</td&gt;<td&gt;ダウコーニング</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt;設備</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;全反射顕微鏡</td&gt;<td&gt;多くの</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt;この方法で使用される全反射顕微鏡は自家製だった。</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL（ソフトウェア）</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt;は、MATLAB、ImageJの、または他の画像解析ソフトウェアを置き換えることができます。</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

flexural rigidity measurements of biopolymers using gliding assays

微小管は細胞分裂、細胞力学、および細胞内輸送の役割を果たす細胞骨格のポリマーである。これらの各関数は、硬いとセル径のかなりの部分にまたがるようにまっすぐに十分である微小管を必要とします。その結果、微小管の持続長、剛性の尺度は、積極的に過去二十年の1のために研究されました。それにもかかわらず、オープンな疑問が残る：短い微小管が長い微小管2月4日より10〜50倍未満で硬直している、とさえ長い微小管はマグニチュード5-9の順序によって異なり永続の長さを測定した。 ここでは、微小管の持続性の長さを測定する方法を提案する。方法はキネシン駆動型微小管滑走アッセイ10に基づいています。微小管に接続されている個々の蛍光体の単粒子追跡による個々の微小管のまばらな蛍光標識を組み合わせることにより、glidin単一微小管のG軌道はナノメートルレベルの精度で追跡されます。軌道の持続長は11を使用した条件下で微小管の持続長と同じです。自動追跡ルーチンは、個々の微小管に取り付けられた蛍光団から微小管の軌跡を作成するために使用され、この軌道の持続長はIDLで書かれたルーチンを使用して計算されます。 この技術は急速に実現可能、と実験の一日で100微小管の持続長を測定することが可能である。方法は微小管に沿って長さの関数としての持続長を含め、さまざまな条件の下で持続長を測定するために拡張することができます。さらに、使用される解析ルーチンは、同様にアクチンフィラメントの持続長を測定するために、ミオシンベース演技滑走アッセイに拡張することができます。

滑空アッセイからのスナップショットを図2に示します。良い微小管密度は視野当たり1から10まで微小であり、微小管が互いに交差するように実質的に多くのmistrackingになります。 図2の滑空アッセイからの11微小管軌道のプロットを図3に示します。典型的な軌道は10〜30μmで長さは、いくつかの軌跡が1微小管が別のものを交差ギャップを持っている。これ...

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Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

持続長や生体高分子の曲げ剛性を測定するための方法が記載されている。この方法は、実験的に個々の微小管の持続長を決定するキネシン駆動型微小管滑走アッセイを使用しており、アクチンベース滑空アッセイに適応可能です。

グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K ビュー.  Lawrence University. 持続長や生体高分子の曲げ剛性を測定するための方法が記載されている。この方法は、実験的に個々の微小管の持続長を決定するキネシン駆動型微小管滑走アッセイを使用しており、アクチンベース滑空アッセイに適応可能です。

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Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

アコースティック膜の微粒子技術を使用してカスタムチャイニーズハムスター卵巣-宿主細胞タンパク質のアッセイを開発する

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

生物工学

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

マイクロ血流の速度プロファイル測定用マイクロ粒子画像流速

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

粒子追跡マイクロレオロジーを用いて3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

生体高分子の分子エンタングルメントとElectrospinnability

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

乾燥風-LCインターフェイス上Megamolecular生体高分子の自己統合するための方法

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

実験室規模で撹拌したバイオリアクターでのパワー入力測定

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

海綿骨の機械的性質を測定するためミリ スケール曲げテスト システム

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.