この作品は、健康グラントRO1DC002756とパデュー研究財団の国民の協会によって資金を供給された。我々は、実験と数値のヘルプについてはロドニーのマクフェイルとのアドバイスをドリス呉とWieseのチャンに感謝する。

レシピチックリンガー<table border="1"><tbody><tr><td> 7.2グラム</td><td> NaClを</td></tr><tr><td> 0.23グラム</td><td>のCaCl 2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0.37グラム</td><td>塩化カリウム</td></tr><tr><td> 0.115グラム</td><td>のNa 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900ミリリットル</td><td>水（組織培養グレード） </td></tr></tbody></table>注意：7.4にpHを調整する。水で1000mlに最終的なボリュームをもたらす。 10 × PBS <table border="1"><tbody><tr><td> 40グラム</td><td> NaClを</td></tr><tr><td> 1グラム</td><td>塩化カリウム</td></tr><tr><td> 7グラム</td><td>のNa 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1.2グラム</td><td> KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 450ミリリットル</td><td> DEPC水</td></tr></tbody></table>注意：7.4にpHを調整する。最終的にもたらす水500 mlにボリューム。ワーキング濃度（1X）は、このような18MΩ- cmの導電性と水を生成するためにミリポアのUV照射システムで得られるような組織培養グレードの水、9部で1部10X株式を希釈することによって行われます。 外植片保持培地のサグ<ul><li> L -グルタミン、10mMのHEPESをDMEM/F12 </li><li> 10％のインスリン、転送、セレン（ITS +1） </li><li> 1パーセントペン連鎖球菌</li></ul>移植片培養の培地<ul><li>外植片保持培地のサグ</li><li> 10 ng / mlのニューロトロフィン-3（NT - 3） </li><li> 10 ng / mlの毛様体神経栄養因子（CNTF） </li></ul>脊髄解剖と保持培地<ul><li> L - 15 </li><li> 10％ウシ胎児血清</li><li> 1パーセントペン連鎖球菌</li></ul> 37から38で卵をインキュベート℃を解剖のツールと​​70％エタノールでSylgard解剖皿を滅菌する。料理やツールを解剖してもUVは一晩滅菌することができる。 <ol><li>場所の1ミリリットル滅菌PBSでマイクロチューブ中のビーズ、ミックス、そしてチューブの底に沈降するビーズを待ちます。 </li><li>ビーズが定住し、PBSに再懸濁された後に上清を除去してビーズを数回洗浄する。 </li><li>室温で1時間タンパク質を精製ビーズ（PBSで希釈）またはPBSのみ（コントロール）をインキュベートする。 </li><li>コラーゲンに供されるまで1ミリリットルPBSで24ウェルプレートにPBSとストア内のビーズを洗い流す。 </li></ol> 2。 Statoacoustic神経節郭清術<ol><li> E4で卵から胚を削除し、胚膜を除去するためにヒヨコリンゲル溶液で皿に入れてください。 </li><li>冷HBSSと上向きに耳胞との側に位置胚をで満たされたSylgard ©並ぶペトリ皿の中で胚を置きます。解剖のピンを使用して皿に胚を固定。 </li><li>への2つの解剖のピンを使用して、皮膚を​​介して水平方向のカットを加えた直後腹それは蝸牛管を満たす約運河の袋、。 SAGの前部と後部垂直カットを行います。 threeカットによって接される皮膚のフラップを持ち上げて取り外す作業にピンセットや解剖ピンを使用してください。 注：SAGは、明視野、ベース照明とすぐに表示されている背袋、そしてventromedially投射と咽頭のアーチによって隠されて腹側蝸牛管とのほぼ中間、耳胞の前腹側縁に位置している。蝸牛管伸長し、その背腹寸法が徐々にハンバーガー - ハミルトンのステージ23から25 9の間にE4に増加します。 </li><li> SAGと区別するために後方に耳胞を引き出します。解剖ピンとSAGを周囲の組織を置換し、慎重に第55ピンセットを用いて胚からSAGを削除します。 SAGからの間葉組織と突出神経束の大きなチャンクを削除します。 </li><li>広口ピペットチップを使用して、ために外植片を移す24ウェル培地を保持している0.5 mlのSAGの外植片とプレート。最大4時間まで氷上または室温で植してください。 </li></ol> 3。脊髄の解剖<ol><li>卵からE6胚を取り出して、ヒヨコリンゲル液を含む皿に入れてください。頭部および胚膜を取り外します。 </li><li> Sylgardの身体©冷たい脊髄の解剖の培地を含む解剖皿を置きます。位置と実験者が直面している胚&quot;腹ダウン&quot;と尾をピン。各肢を通じて、前端を通して解剖ピンを置きます。 </li><li>ピン鉗子および/または解剖を使用して、慎重に脊髄の背側表面が見えるまで、腹側方向に移動し、皮膚や組織を取り除く。 </li><li>脊髄の全長に沿って、前方方向の後方に、解剖ピンと脊髄の背側正中線をカット。これは、別々の脊髄の左右の側面として&quot;オープンブック&quot;を作成します。 </li><li&gt;脊髄を分離し、後根神経節（DRG）を公開する、横方向に、組織を取り巻く削除。脊髄とDRGの間に解剖ピンまたは鉗子をこすることによりDRGと髄膜を取り外します。 </li><li>ピンセットで脊髄の尾最端を保持し、実験者から持ち上げ、持ち上げて本体から脊髄を削除します。残りのDRGと髄膜を取り外します。 </li><li>鉗子（または皿にそれを固定）と脊髄の一端を保持し、脊髄を二分する、腹側正中線に沿ってカットするVannasのはさみを使用してください。 </li><li>組織を固定化し、組織の長さに沿って小さな外植片（100〜500ええと長さで）をカットするVannasのはさみを使用してピンセットで植の一端を保持する。フロアプレート一つ植エッジに沿って組織の明確な肥厚として認識することができます。 </li><li> 0.5ミリリットル冷清培地で24ウェルプレートに植片を転送するために広口ピペットチップを使用してください。 fは、組織の生存能力を維持するために氷上で外植片を保持するまたは、最大4時間まで。 </li></ol> 4。神経突起の応答性をテストするために精製されたタンパク質と文化を外植片<ol><li>製造元の指示に従って、氷上で、15 mlコニカルチューブに1.5 mg / mlのコラーゲン溶液を調製します。 </li><li>コラーゲン溶液は、pH指示薬の紙を使用して、7から7.4のpHを有することを確認します。 1μlのボリュームにNaOHを加えてpHを調整します。 </li><li>広口ピペットチップと余分な液を吸引を用いて24ウェルプレートに植片を移す。複数の外植片はよくかで培養することができますが、互いに間隔を少なくとも500μmを配置する必要があります。 </li><li>外植片を含むウェルにコラーゲンの0.5 mlを追加します。ウェルの底面上に外植片を置きます。コラーゲンは、室温で重合を開始するので、次もに進む前に、完全にそれぞれの文化を設定してください。 </li><li>コラーゲンを重合するために30-45分のための暖かく、37℃のスライド上で培養プレートを置きます。コラーゲンはpolymeを持っている場合それはゲルに似ているでしょうrized。 </li><li>精製タンパク質（PBSで希釈）またはPBS（コントロール）のいずれかを添加した0.5ミリリットル暖かい移植片培養培地を追加し、37℃、5％CO 2。神経突起伸長への影響は、24時間で表示する必要があります。 注：私達は42時間に文化のSAGの外植片に同じプロトコルを使用している。 </li></ol> 5。外植体タンパク質でコーティングされたビーズと共培養方向の神経突起伸長をテストする<ol><li>外植片培養工程4.1から4.4で始まります。 </li><li>ピペットを用いて、PBSからもコラーゲン溶液と外植片を含む1〜5ビーズを移す。 </li><li>外植片の端からビーズ50から500μmの位置にピンセットを使用しています。 </li><li>コラーゲンを重合するために30-45分のための暖かく、37℃のスライド上にプレートを置きます。組織やビーズは、コラーゲンが重合として避難になることがあります。最初の5分間の組織やビーズの文化と再位置を確認してください。 </li><li> 0.5メートルを追加l各ウェルにメディアをSAGと24時間インキュベートする。 </li></ol> 6。免疫組織化学による神経突起伸長の可視化<ol><li> PBSの文化をリンスし、PBS中4％パラホルムアルデヒド中で室温で1時間固定してください。 </li><li>テフロンマイクロヘラの丸い側でゲルの端の周りにトレースすることにより、井戸の壁からゲルを離します。ウェルのゲルで免疫染色を行います。 PBSで数回すすいでください。 </li><li>一晩4 0.5ミリリットルブロッキング溶液（10％仔ウシ血清、0.1％トリトンX - 100、PBSに0.1％アジ化ナトリウム）℃でインキュベート</li><li>一晩4 0.5ミリリットル一次抗体（ブロッキング溶液で1:500に希釈した抗β-チューブリン抗体）でインキュベート℃を</li><li> PBSで数回すすいでください。一晩4（1:500に希釈のAlexa Fluor ® 488ヤギの抗マウスIgG 2bの抗体）0.5ミリリットル二 ​​次抗体でインキュベート℃にの光感受性のため、これ以降のステップから、箔に暗いまたはラップでプレートを保持する二次抗体。 </li><li> ℃のPBSで最大1週間までは4でPBSと店で数回すすいでください。 </li></ol> 7。代表的な結果<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig1.jpg" /> 図1。精製NT - 3とE4ひよこのSAGの外植片上でNT - 3でコーティングされたビーズの神経突起促進効果の代表的な結果。 ニューロンの細胞体および神経突起β-チューブリンで免疫染色し、共焦点顕微鏡で10倍目的で撮像されたのサグ。 in vitroで 24時間後、SAGの外植片は、100の存在下でより大きな神経突起伸長を表示ng / mlの精製ヒトNT - 3は、コントロール（1A）と比較して、細胞培養培地（1B）に追加。 SAGのニューロンは、NT - 3の点源が局所的に神経突起伸長を促進できることを実証するIN100 ng / mlのNT - 3を浸したビーズと共培養した。外植片は長く表示され、側面の密度が高い神経突起の伸長反対側（1D）と比較してPBS（1C）に浸したビーズと文化をコントロールと比較してビーズが直面している植。スケールバー= 200μmの。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig2.jpg" /> 図2。 E6ひよこ脊髄上で精製したWnt5aやWnt5aコートビーズの神経突起促進効果の代表的な結果。 脊髄の外植片は、β-チューブリンを用いて免疫染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。精製マウスWnt5a（400ng/ml）の存在下で成長の24時間後、ニワトリ脊髄の外植片からの神経突起伸長はWnt5a（2A）なしで培養した対照と比較して（2B）に増加した。 500 ng / mlのWnt5aに浸したビーズは、また文化（2C）を制御するために比較して神経突起伸長（2D）を推進し、脊髄の外植片の端から300から500ミクロンを置いた。類似の共培養の結果は、以前はWnt5a発現細胞8で発表された。スケールバー= 200μmの。

<ol>
	<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+inner+ear.">Axon guidance in the inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).</li><li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inner+ear+afferent+connections:+forming+primary+neurons+and+connecting+them+to+the+developing+sensory+epithelia.">Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.</a> Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).</li><li>Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+conveys+semaphorin+and+VEGF+signaling+during+neural+and+cardiovascular+development.">Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development.</a> Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).</li><li>Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NT-3+replacement+with+brain-derived+neurotrophic+factor+redirects+vestibular+nerve+fibers+to+the+cochlea.">NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea.</a> J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).</li><li>Avila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+support+the+survival+and+neuritogenesis+response+of+developing+cochleovestibular+ganglion+neurons.">Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons.</a> Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).</li><li>Bianchi, L. M., Cohan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+neurotrophins+and+CNTF+on+developing+statoacoustic+neurons:+comparison+with+an+otocyst-derived+factor.">Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor.</a> Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).</li><li>Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Spinal+Somatic+Motoneurons+in+Culture.">Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture.</a> Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).</li><li>Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnts+and+Wnt+inhibitors+do+not+influence+axon+outgrowth+from+chicken+statoacoustic+ganglion+neurons.">Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons.</a> Hear. Res. , (2011).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).</li><li>Bourikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+guides+commissural+axons+along+the+longitudinal+axis+of+the+spinal+cord.">Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord.</a> Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).</li><li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens:+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance.">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).</li><li>Augsburger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).</li><li>Lyuksyutova, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior-posterior+guidance+of+commissural+axons+by+Wnt-frizzled+signaling.">Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling.</a> Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、無血清の条件下で、ひよこから、E4のSAGとE6脊髄の外植片を細かく分析し、文化に方法を提示する。このプロシージャは、現在SAGのニューロンの生存と神経突起伸長に対する様々な分泌配位子の効果を研究する私たちのラボで使用されています。このプロトコルの小説の側面は、培養の外植片とSAGの神経突起伸長への影響を研究する成長因子を染み込ませたビーズの使用のための無血...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 機器の </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td>我々は、明視野、ベース照明とライカM80実体顕微鏡を使用してください</td></tr><tr><td>ウォーマーをスライドさせ</td><td> CS＆E. </td><td></td><td>コラーゲン重合</td></tr><tr><td>鶏の卵のインキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37℃/ 5％CO 2の加湿インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 解剖の材料 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard＆コピー、コーティングされたペトリ皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 24ウェル細胞培養プレート</td><td>コー​​ニング</td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> ＃5デュモン鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11252〜30 </td><td></td></tr><tr><td> ＃55デュモン鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11295〜51 </td><td></td></tr><tr><td>ステンレス製解剖用ピン</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 26002〜10 </td><td>胚ピニング、細かい解剖</td></tr><tr><td>モリア穴あきスプーン</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10370〜17 </td><td>胚の収穫/転送</td></tr><tr><td> 200μlの広口ピペットチップ</td><td>ドットサイエンティフィック株式会社</td><td> 118 - 96R </td><td>外植片の転送</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4とE6の鶏の卵</td><td></td><td></td><td> ＆nbのSP; </td></tr><tr><td>チックリンゲル液</td><td></td><td></td><td>胚の収穫</td></tr><tr><td> HBSS </td><td>シグマ</td><td> H8264 </td><td>解剖のサグ</td></tr><tr><td> L15培地</td><td>シグマ</td><td> L5520 </td><td>脊髄解剖媒体</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S11150 </td><td>脊髄解剖媒体</td></tr><tr><td> Vannasはさみ</td><td>世界の精密機器</td><td> 501778 </td><td>脊髄の解剖</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> コラーゲン製剤 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲンタイプI </td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 354249 </td><td>移植片培養</td></tr><tr><td> 10 × PBS（滅菌） </td><td></td><td></td><td>ノイへコラーゲンをtralize </td></tr><tr><td> 1NのNaOH（滅菌） </td><td></td><td></td><td>コラーゲンを中和する</td></tr><tr><td>蒸留水（滅菌） </td><td></td><td></td><td>コラーゲンを中和する</td></tr><tr><td> pH指示薬の論文（6.0〜8.1） </td><td>ワットマン紙</td><td> 2629-990 </td><td>コラーゲンのpHを確認するには</td></tr><tr><td> 15 mlコニカルチューブ</td><td>ドットサイエンティフィック株式会社</td><td> 818 - PG </td><td></td></tr><tr><td> 500μlの広口ピペットチップ</td><td>ドットサイエンティフィック株式会社</td><td> 119 - R100 </td><td>ピペットのコラーゲンへ</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 移植片培養 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12培地</td><td>シグマ</td><td> D8437 </td><td>移植片培養の培地</td></tr><tr><td>その1 </td><td>シグマ</td><td> I2521 </td><td>培地サプリメント</tD&gt; </tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122 </td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td> CNTF（ラット） </td><td>シグマ</td><td> C3835 </td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td> NT - 3（ヒト） </td><td>シグマ</td><td> N1905 </td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td>精製マウスWnt5a </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 645 - WN - 010 </td><td></td></tr><tr><td>アッフィ - ゲルブルーゲルビーズ</td><td> Bio - Rad社</td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 免疫組織化学 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td> P6148 </td><td>固定</td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td>リンス</td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td>シグマ</td><td> T9284 </td><td>ブロッキング溶液</td></tr><tr><td>ナトリウムアジド</td><td>シグマ</td><td> S8032 </td><td>ブロッキング溶液</td></tr><tr><td>子牛血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16170-078 </td><td>ブロッキング溶液</td></tr><tr><td>マウスモノクローナルIgG2b抗βチューブリン1 + II抗体</td><td>シグマ</td><td> T8535 </td><td>ラベルの細胞体および神経突起</td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗マウスIgG2のBの抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> A21141 </td><td> βチューブリン抗体を検出</td></tr><tr><td>テフロンマイクロスパチュラ</td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td>ウェルからリリースコラーゲンゲル</td></tr></tbody></table>

dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays

鶏内耳の感覚器官はstatoacoustic神経節（SAG）ニューロンの末梢プロセスによって神経支配されています。感覚器官の神経支配は成長している軸索および/ ​​またはそれらの感覚器官のターゲット内での軌道に沿って位置する軸索ガイダンスの手がかり1と生存因子2の組み合わせによって異なります。例えば、古典的な軸索 ​​ガイダンスシグナル伝達経路、セマフォリン-ニューロピリン、との機能的な干渉が耳軸索の3の経路変更を生成。また、ニューロトロフィン-3（NT - 3）と脳由来神経栄養因子（BDNF）を含む、内耳の感覚目標で表現されるいくつかの増殖因子は、、再びSAGの軸索4の経路変更につながる、トランスジェニック動物で操作されている。これらの同じ分子は 、in vitro 5,6 でひよこのSAGの神経細胞の生存と神経突起伸長の両方を促進する。 ここで、我々は現在、Uなのin vitroの方法を説明し、実証既知のようなWntsなどのモルフォゲンだけでなく、SAGの神経突起伸長と神経細胞の生存を促進するための重要な成長因子を含む可溶性タンパク質、にひよこのSAGの神経突起の応答性をテストするために歌う。このモデルシステムを使用して、我々は、分泌配位子は、SAGのニューロンの生存と神経突起伸長に及ぼすことができる効果について結論を出すと思っています。 SAGの外植片は、胎生4（E4）で解剖し、24時間無血清条件下での三次元コラーゲンゲル内で培養されています。最初に、神経突起の応答性は、タンパク質含有培地で培養外植片によってテストされます。その後、分泌される配位子の点源が神経突起伸長に対する指向性の影響を持つことができるかどうか尋ねるために、外植片は、タンパク質でコーティングされたビーズと共培養し、局所的に伸長を促進または抑制するためにビーズの能力についてアッセイされています。我々はまた、E6脊髄の外植片の解剖のデモ（プロトコル7を変更）し、文化が含まれています。我々は日常的にタンパク質とタンパク質に浸したビーズの生物活性を確認するために、脊髄の外植片を使用し、SAGの外植片と同一の培養条件下で、ニワトリ組織で種の交差反応性を確認する。 in vitroアッセイこれらは、特にin vivoでの研究を実行する前に、迅速にSAGの神経細胞に栄養（生存）または熱帯（方向性）効果を発揮する分子をスクリーニングするのに便利です。また、この方法は高いニューロンの生存8で、無血清条件下での個々の分子のテストが可能。

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Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

我々はニワトリE4 statoacoustic神経節とE6脊髄の外植片を細かく分析し、文化に方法を示しています。外植片は、24時間3Dコラーゲンゲル中での無血清条件下で培養される。神経突起の応答性は、成長因子添加培地および蛋白質でコーティングされたビーズを使用してテストされています。

神経突起伸長アッセイのためのコラーゲンゲルのチックStatoacousticガングリオンと脊髄の外植片の解剖と文化

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

dissection-culture-chick-statoacoustic-ganglion-spinal-cord-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K ビュー.  Purdue University. 我々はニワトリE4 statoacoustic神経節とE6脊髄の外植片を細かく分析し、文化に方法を示しています。外植片は、24時間3Dコラーゲンゲル中での無血清条件下で培養される。神経突起の応答性は、成長因子添加培地および蛋白質でコーティングされたビーズを使用してテストされています。

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

神経科学

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

培養皿内の機能モーターユニット：脊髄外植片と筋細胞の共培養

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

三次元コラーゲンマトリックスアッセイにおけるマウスのドーパミンと線条体片の解剖と文化

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

ニワトリ胚脊髄スライス培養プロトコル

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコル<em&gt;その場で</em&gt;幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

エレクトロポひよこ胚脊髄における遺伝子発現差のRNA-配列解析

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

新生児マウスからの脊髄ニューロンの単離と培養

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

マウスにおける完全なトランセクション型脊髄損傷の誘導

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...