The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.

The authors have declared that they have no competing financial interests.

現在のプロトコルが正常JEV、その機能的なcDNAを構築することが本質的に困難であることが証明されたとフラビウイルスの二つの異なる株（CNU / LP2 27、SA 14 -14-2 28）の全長の感染性cDNAクローンを生成するために使用されていますなぜなら、宿主細胞毒性およびクローニングされたcDNAの遺伝的不安定性の伝播8,74-76このプロトコルは、三つの主要なコンポーネントが含ま：。最初、高忠実度の逆転写酵素を用いてウイルスRNAの忠実なcDNAコピーの合成/増幅を最大化します/ DNAポリメラーゼ。第二に、最終的な完全長cDNAの組立工程にサブクローニング最初のcDNAからの非常に低コピー数ベクターのBACにおける毒性系列（未発表データ）74,77,78を含むウイルスPRM-Eコード領域をクローニングします。第三、明らかにより大きいDNA inseを許容120〜350キロバイトの平均サイズ、19-21で外来DNAを収容することができ、クローニングベクター、BACを利用他のクローニングベクターが行うよりも、RTS。このクローニングアプローチは、他の多くのプラス鎖RNAウイルス、〜10から32キロバイトの大RNAゲノムと特にに一般的に適用されます。そのゲノムが宿主細​​胞リボソームによるタンパク質に翻訳されるようなウイルスのmRNAを作用するための感染性cDNAクローンの発生は、特に、ポジティブ鎖RNAウイルスは、RNAウイルスの逆遺伝学系の開発における重要なステップです。従って、ウイルス複製は、感受性の宿主細胞へのcDNA由来のゲノム長RNA分子を導入することによって開始することができます。感染性JEV cDNAクローンの利用可能性は、組換えDNA技術と組み合わせると、このような遺伝子発現73,79およびゲノム複製として、分子レベルでウイルスのライフサイクルの様々な態様の理解を増加している。63,64にも、完全長のJEV cDNAクローンは、抗ウイルスワクチン28および遺伝子送達ベクターの開発のための貴重なツールであることが証明されました。&lt;SUP&gt; 80,81 すべてのプラス鎖RNAウイルスと同様に、高度に感染性RNAをin vitroで合成することが可能なJEV cDNAのための信頼できる機能を構築する際に、複数の重要なステップがあります。理想的には、全長cDNAのクローンから転写された合成RNAの配列は、ウイルスゲノムRNA、ウイルスRNA複製の開始のために必要とされ、特に5 &#39;および3&#39;末端配列と同一であるべきです。60-62現在のプロトコルでは、本物の5 &#39;末端および3&#39;末端は、最後の下流のウイルスゲノムの最初のアデニンヌクレオチドの上流にSP6プロモーター配列を配置し、ユニークな人工のXba I制限部位を配置することによって確保されましたそれぞれウイルスゲノムのチミンヌクレオチド、。 Xba I-直線化し、MBN処理されたcDNAをTEのランオフ転写によって生成された本物の5 &#39;末端および3&#39;末端を有する合成RNAを頂きましたmplateメートル7 G（5 &#39;）で下塗りし、SP6 RNAポリメラーゼのppp（5&#39;）キャップアナログを使用。このプロトコルは、いくつかの方法で変更することができます。 インビトロ転写のために、別のバクテリオファージRNAポリメラーゼ（例えば、T3またはT7）は、明確に定義されたプロモーター配列と組み合わせて使用することができる。27、それが中に存在しない場合、ランオフサイト、別の制限部位を利用することができるように直線化cDNAからのウイルスゲノムとするならば、合成RNAは、本物の3 &#39;末端で終わります。合成RNAは、その3 &#39;末端に3つまたは4つのウイルス関連のないヌクレオチドが含まれている場合、3&#39;末端のヌクレオチド配列の重要性は、RNAの感染力で約10倍の減少によって実証されている。in vitro転写反応において27、両方M 7 G（5 &#39;）pppの（5&#39;）Aおよびm 7 G（5 &#39;）pppの（5&#39;）Gキャップ類似体は、後者の場所ウイルス5の上流に無関係な余分なGヌクレオチドが、等しく良好に使用することができ&#39;末端が、そのさらには、合成RNAの感染性または複製を変更しません。27 cDNAテンプレート自体は感染性ではないのでまた、DNアーゼI消化によるRNA転写物からcDNA鋳型の除去は、RNAの感染性試験の必要はありません。27 BAC技術は現在、プラス鎖RNAウイルス、すなわち二つJEVs、CNU / LP2 27、SA 14 -14-2 28（ゲノムサイズ、〜11 KB）の一握りのための感染性cDNAクローンの構築に適用されています。 2デング熱ウイルス、BR / 90 26とNGC 29（〜11キロバイト）牛ウイルス性下痢ウイルス、SD1（〜12キロバイト）; 25 2古典的ブタ熱ウイルス、Cとパーダーボルン（〜12キロバイト）; 24ボーダー病ウイルス、ギフホルン（〜12キロバイト）; 24豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、PL97-1 / LP1（〜15キロバイト）; 30伝染性胃腸炎ウイルス、PUR46-MAD（〜29キロバイト）; 16ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、DF-2（〜29キロバイト）; 32重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、ウルバーニ（〜30キロバイト）; 9中東呼吸器症候群コロナウイルス、EMC / 2012（〜30キロバイト）; 17およびヒトコロナ、OC43（〜 31 KB）31のcDNAの構築のためのBACを使用することの主な利点は、大規模な、1または2コピーのBACプラスミドの高い遺伝的安定性です。しかし、その非常に低コピー数の固有の性質があるため、BAC DNAと染色体DNAを、ホストとのBAC DNAの純度の結果としての削減の非常に低い収率で、また大きな欠点です。現在のプロトコルでは、BAC DNAの収量は 、E を成長させることによって最大化されます大腸菌 DH10B栄養豊富な培地の2×YTで感染性BACてpBAC / SA 14 -14-2で形質転換しました。この努力にもかかわらず、平均利回りはわずか〜15μgのの2×YTブロスの500ミリリットルからBAC DNAのです。また、BAC DNAの純度が最高の精製のためのCsCl-EtBrを密度勾配遠心分離を使用することによって達成されますむしろ、一般的に使用される列ベースのプラスミド分離より。しかし、それは心に留めておくことは重要であるBAC- 形質転換したE.それがクローニングされたcDNAの遺伝的安定性を危うくする可能性があるため、 大腸菌が過剰成長べきではない、と高い成長が必ずしも大きい利回り以上純度BAC DNAにはつながりません。 ここで説明するプロトコルは、JEVのためのBACとして遺伝的に安定、全長感染性cDNAクローンの構築および増殖のための最適化、効率的、かつ合理化法である、手順をもう一度事実上不可能と思いました。この同じクローニング戦略は、多くの他のプラス鎖RNAウイルスに適用することができます。一般的に、感染性cDNAクローンは、ウイルスの複製および病因にその生物学的機能を研究するために、ウイルスRNAゲノムに変異（例えば、欠失、挿入、および点変異）の様々なを紹介することが可能となります。このcDNAベースの逆遺伝学系を開発することを可能にし、TESTワクチンと目的の特定のプラス鎖RNAウイルスの病原性因子を標的とする治療候補。また、この感染性cDNA技術は、生物医学研究の多くの用途のために、目的の外来遺伝子を発現することができるウイルスベクターとして利用することができます。

RNAのウイルス学者は、1970年代後半における組換えDNA技術の出現は、その後、RNAウイルスの遺伝子操作のための細菌中でのプラスミドとして増殖することができたcDNAクローンの中にウイルスRNAゲノムを変換することができた。1最初のRNAウイルスであることがクローン化された分子は、バクテリオファージQβ、 大腸菌に感染するプラス鎖RNAウイルスでした。 大腸菌に導入された場合QβゲノムRNAの完全なcDNAコピーを含むプラスミドは、感染Qβファージを生じましたコリ 2その後すぐに、この技術は、ポリオウイルス、ヒトおよび動物のプラス鎖RNAウイルスに適用しました。ポリオウイルスのゲノムRNAの完全長cDNAを有するプラスミドは、感染哺乳動物細胞にトランスフェクトし、感染性ビリオンを産生することができたときに3を 、クローン化したcDNAを、ウイルスRNA複製を開始するために細胞内で転写されるべきこの「DNA発射」アプローチでは。しかし、それは、転写が開始される方法および転写産物が正しいウイルス配列にどのように処理されるかは不明です。この懸念は、代替「RNA-立ち上げ」の開発につながっているのアプローチ、ウイルスRNAゲノムの完全なcDNAコピーは 、Eによって認識されるプロモーター下にクローニングされます宿主細胞に導入された場合、完全なウイルス複製サイクルを受ける定義の5 &#39;および3&#39;末端を有する、インビトロでの合成RNAの産生のための大腸菌やファージRNAポリメラーゼ。このアプローチの最初の成功は、ブロムモザイクウイルスについて報告された4,5 、6,7植物のプラス鎖RNAウイルス。それ以来、RNA-打ち上げのアプローチは、カリシウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、アルテ、およびコロナウイルスなどのプラス鎖RNAウイルス、広範囲のために開発されました。1,4,5,8- DNA-との両方で、FULの建設を逆遺伝学システムをRNA発射、〜10の大RNAゲノムリットル長cDNAクローンは、ポジティブ鎖RNAウイルスの感染性DNAまたはRNAを生成するための鍵であるが、ウイルスゲノムのサイズが大きくなるように、かなりの技術的な課題となる。具体的には9-17 -32キロバイトは、完全長cDNAのクローニング機能には3つの大きな障害を提示している。18 RT-PCRの忠実度は、ウイルスRNAの長さに反比例するので、最初の難しさは、忠実なのcDNAコピーの合成です。長いRNA分子がE.で不安定なプラスミド中のcDNA断片を作製することが可能な、予期しない配列を含有する可能性が高いので、第二のハードルは、潜在的に毒性の配列の存在であります大腸菌 。それは&gt; 10 kbのウイルスのcDNAインサートを収容することができるクローニングベクターを見つけることは困難であるため、第三の、最も重要な問題は、適切なベクターが利用可能です。過去30年間にわたり、これらの障壁は、酵素学、方法論、ANにはいくつかの進歩によって克服されていますDのvectorology。これらのうち1,4,5,8は 、最も有望で革新的な開発は、大きなプラス鎖RNAウイルスなどの感染細菌人工染色体（BACの）のクローニングです。 BACベクターは 、Eに基づいて、低コピープラスミドクローニング（1-2コピー/細胞）であります〜120〜350キロバイトの平均DNAインサートサイズの大腸菌出生率、19-21 DNA断片は、一般的なクローニングベクターへのクローニングと同様にBACベクター中に挿入されます。結果としてBACクローンは 、Eの多くの世代にわたって安定しています大腸菌。現在までに22,23、BAC技術は、3つの正鎖RNAウイルスファミリーの&gt; 10のメンバー、 すなわち 、 フラビウイルス科 、24-29 アルテ 、30とコロナのための感染性cDNAクローンを作成するために使用されています。9,16,17 、31,32 例として、日本脳炎ウイルス（JEV）を使用して、本研究は、することができ、詳細な手順を報告プラス鎖RNAウイルスの様々な遺伝的に安定、全長感染性BACを構築するために使用されます。で発生JEVは、JEV感染が深刻なしばしば致命的な神経疾患日本脳炎を引き起こす可能性がヒトでは人獣共通感染蚊ベクトルによって鳥、豚、および他の脊椎動物のホスト間の自然の中で伝送されるフラビウイルス33。34,35です（JE）、36 〜50,000-175,000臨床例推定年間発生率とアジアと西太平洋、37,38の一部。39,40 JEVのゲノムは、〜11-kbの、一本鎖、正センスRNA分子であり、で構成されてい5における2つの非コード領域（のNCR） &#39;および3&#39;末端により隣接する単一のオープンリーディングフレーム（ORF）41,42 ORFは、指定された、10の個々のタンパク質を生成する宿主およびウイルスのプロテアーゼによって切断されるポリタンパク質をコードC、のprM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5また、N末端 ​​からC末端への方向インチ34,43,44、電子NS1（NS1 &#39;）のXtendedでは、フォームがコドンNS2Aの8-9でのことで-1リボソームフレームシフト表現されている。これら11タンパク質のうち45,46、3つの構造タンパク質（C、のprM、およびE）は、感染の形成のために不可欠ですビリオン、47,48と残りの8非構造タンパク質（NS5にNS1、およびNS1 &#39;）はウイルスRNA複製、49-51粒子アセンブリ、52-56と自然免疫の回避のために非常に重要である。57〜59の両方の5&#39;および3 「のNCRは、保存された一次配列を含み、ウイルスRNA複製を調節するために重要であるRNA二次/三次構造、60〜62を形成する 。63,64 このプロトコルは、SA 14 -14-2全長のJEVの感染性BACを生成するためのツール、方法、および戦略について説明します。28この機能BACクローンは、プロモーターに含まれるJEVゲノムRNAの完全なcDNAコピー、65が含まれています SP6 RNAポリメラーゼのための上流ウイルス5 &#39;末端およびin vitroでのランオフ転写のためのウイルスの3&#39;末端の下流の独特のXba I制限部位の。このBAC技術は、プラス鎖RNAウイルスの配列に完全に機能するcDNA分子クローンの構築に適用可能です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1054">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">1. Molecular Cloning</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2xYT Broth</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">Y2377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">[3H]UTP</td>
			<td style="width:275px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:243px;">NET380250UC</td>
			<td>Radioactive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">50-mL Tube</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific (Nalgene)</td>
			<td style="width:243px;">3114-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">250-mL Bottle</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose</td>
			<td style="width:275px;">Lonza</td>
			<td style="width:243px;">50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose (Low Melting Point)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvaI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0152S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvrII</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0174S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BamHI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsiWI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsrGI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Butanol</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">A399-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cap Analog [m7G(5&#697;)ppp(5&#697;)A]</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">S1405S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">BP1595-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloroform</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C2432</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">DE-81 Filter Paper</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">3658-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18427-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">E. coli DH10B&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18297-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">EDTA</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7637</td>
			<td>Toxic and highly mutagenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">A6283</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">G5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glycogen&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Roche</td>
			<td style="width:243px;">10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">I9392</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0918</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">LB Broth</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lithium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Mung Bean Nuclease</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0250S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Needle (18G, 20G)</td>
			<td style="width:275px;">BD</td>
			<td style="width:243px;">305196, 305175</td>
			<td>Biohazardous (Sharps waste)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">NotI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Oligonucleotide</td>
			<td style="width:275px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:243px;">Custom Oligonucleotide Synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">PacI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">pBeloBAC11</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol (Buffer-Saturated)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15513-039</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15593-031</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Guanidine Isothiocyanate</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Ambion)</td>
			<td style="width:243px;">10296-010</td>
			<td>Toxic, corrosive, and irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Pme I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">rNTP Set</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">27-2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sealable Polypropylene Tube (16 &#215; 76 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">342413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SfiI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0123S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sma I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0141S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SP6 RNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0207S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Spin Column (Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Syringe</td>
			<td style="width:275px;">HSW NORM-JECT</td>
			<td style="width:243px;">4200.000V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tris</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">tRNA (yeast)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">XbaI&#160;</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2. Cell Culture</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Alpha Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">12561-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Conical Tube (50 mL)</td>
			<td style="width:275px;">VWR</td>
			<td style="width:243px;">21008-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Crystal Violet&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Culture Dish (150 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">93150&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cuvette (2-mm Gap)</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">450125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">F1635</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glutamine</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">61100-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Six-Well Plate</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vitamins</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:275px;">Mupid</td>
			<td style="width:243px;">MPDEXU-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">Heracell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Desktop Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Electroporator</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld)</td>
			<td style="width:275px;">UVP</td>
			<td style="width:243px;">UVGL-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">368826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:243px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vortexer</td>
			<td style="width:275px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:243px;">G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Water Bath</td>
			<td style="width:275px;">Jeio Tech</td>
			<td style="width:243px;">WB-10E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

すべてのプラス鎖RNAウイルスの場合は、逆遺伝学システムの信頼性と効率がシーケンスウイルスゲノムRNAのコンセンサス配列と等価であるクローン化された完全長cDNAの遺伝的安定性に依存しています。27 図1は、五員環を示し、 JEV SAのBACとして、全長感染性cDNAを構築するためのステップ戦略14 -14-2 28：ステップ1、JEV感染BHK-21細胞（ 図1A）の細胞培養上清からのウイルスRNAの精製;ステップ2、全ウイルスゲノム（ 図1B）に及ぶ4重複するcDNAアンプリコン（F4にF1）の合成;ステップ3、BACベクターに4つの連続cDNA断片のそれぞれのサブクローニング、てpBAC / F4（ 図1C）にてpBAC / F1を作成します。 すなわちステップ4、SP6 ​​RNAポリメラーゼを用いたインビトロランオフ転写のためのクローン化cDNAの変更、SP6を置きますサイレント点突然変異、9134→T（てpBAC / F3 KO）を導入し、挿入することによって、ヌクレオチド9131で、既存の内部のXba I部位を排除し、すぐにウイルス5 &#39;末端（てpBAC / F1 SP6）の上流のプロモーター配列、ウイルス3 &#39;末端（てpBAC / F4 RO）（ 図1D）のすぐ下流に新たな人工のXbaIランオフサイト。ステップ5、フルレングスのSA 14 -14-2のcDNA BAC、てpBAC / SA 14 -14-2（ 図1E）。 表1に、このクローニング手順で使用されるオリゴヌクレオチドのアセンブリ。28 機能性JEV cDNAの構築のために、最初の重要なステップは、RT-PCRのための鋳型として精製されたウイルスRNAを使用して、4つの重複するcDNAフラグメントの合成である。 図2は 4であったRT-PCR産物のための代表的な結果を提供します0.8％で電気泳動アガロースゲル。このゲルは、全長のJEV cDNAは4オーバーラップするcDNA断片に増幅されていることを明確に示しています。時折、RT-PCR反応が原因cDNA合成/増幅中のプライマーの非特異的アニーリングを、予想される生成物より大部分が小さい1つ以上の追加のウイルス特異的または非特異的な生成物を生じる可能性があります。一方、ほとんど又は全く予期されるRT-PCR産物は、ウイルスRNAの単離または不適切なRT-PCRのパフォーマンス中に偶発ためのRNaseの混入の増幅されたことになります。 次の重要なステップは、partial-または全長標準的な組換えDNA技術を使用して、比較的簡単な手順であるBACにおけるJEVのcDNAのクローニングおよび変形例である。69 図3は含むBACクローンを精製するための代表的な結果を提示します塩化セシウム-EtBrを勾配にバンディングによってJEV SA 14 -14-2の完全長cDNA。この実験では、401700×gで16時間遠心分離した後、二つの異なるバンド、 すなわち 、E。上記の大腸菌の染色体DNAおよび以下のスーパーコイルBACプラスミドDNAは、長波長紫外線の下でチューブの中央に表示されます。下のBAC DNAバンドの最小量（〜400μl）を慎重にチューブの側のシリンジで穴を突っついによって回収しました。その後、EtBrをブタノール抽出によりBAC DNAから抽出し、EtBrを無BAC DNAをエタノール沈殿により濃縮しました。 最後のステップは、許容細胞へのRNAトランスフェクション（ 図4）の後に、全長SA 14 -14-2 BAC（てpBAC / SA 14 -14-2）からインビトロで転写合成RNAの特異的感染の決意です。ステップ1、3 &#39;末端に、全長SA 14 -14-2 cDNAの線形化：このステップは、3つの連続ステップが含まウイルスゲノム（ 図4A）の末端;ステップ2、ランオフ転写（ 図4B）により線形化cDNAからの合成RNAの産生;ステップ3、合成RNA（ 図4C）でトランスフェクトしたBHK-21細胞における組換えウイルスの救出。実験的に、てpBAC / SA 14 -14-2の2つの独立したクローンをのXba I消化で線状化および Xba I消化によって生成された4塩基の5 &#39;オーバーハングを除去するために、MBNで処理しました。線形化のBACは、エタノール沈殿を行い、フェノール - クロロホルム抽出によってクリーンアップされました。 2つの精製の​​BACの線形化を、0.8％アガロースゲル（ 図5A）で実証されました。フェノール - クロロホルム抽出は、線形化のBACは、RNaseフリーであることを確認するために慎重に行う必要があります。 2線形化のBACのそれぞれがm 7 G（5 &#39;）pppの（5の存在下で、SP6 RNAポリメラーゼを使用してランオフ転写のためのcDNAテンプレートを務め&#39;）キャップアナログ。合成RNAの完全性は、基準1kbのDNAラダー（ 図5B）と一緒に、0.6％アガロースゲル上で2つの転写反応混合物のアリコートを実行することによって示された。この単純なアッセイでは、主要な顕著なRNAバンドが常にちょうど移行しました3キロバイトの下にDNAバンドを参照し、シャープであるように思われました。しかし、分解したRNAは、同じゲルに塗抹外観を持っているでしょう。 感染中心アッセイは、合成RNAの特異的感染を決定するためのゴールドスタンダードです。このアッセイは、（3×10 5細胞/ウェル）、ナイーブBHK-21細胞を含む6ウェルプレート中で10倍段階希釈したエレクトロポレーションした細胞の同等のアリコートを播種し、RNA試料とBHK-21細胞を電気穿孔し、アガロースオーバーレイすることによって行いました細胞単層の上に。 4日間のインキュベーションの後、生存細胞をホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色したの細胞（ 図6A）に送達感染性RNA分子の数に対応する感染性センター（プラーク）の数を、定量化するolution。 インビトロ転写のために用いたcDNAテンプレートは非感染性であることが証明されているため、転写反応混合物の27アリコートを直接エレクトロポレーションに使用しました。エレクトロポレーションは、RNAトランスフェクションのために好ましい方法です。あるいは、RNAは、DEAEデキストラン、およびカチオン性リポソームを用いて、他の方法によってトランスフェクトすることができます。 RNAのエレクトロポレーションは、非常に有効であるが、塩がエレクトロポレーション反応やエレクトロポレーションキュベットが再利用されているか存在している場合は、電気パルスの「アーク放電」は、まれにしか発生しません。 RNAトランスフェクト細胞におけるウイルスタンパク質の発現を、抗NS1ウサギ抗血清（ 図6B）を用いて、免疫蛍光アッセイによって試験しました。 RNAトランスフェクト細胞の上清中に蓄積されたウイルス粒子の産生でしたプラークアッセイ（ 図6C）によってalyzed。これらの実験の結果は、cDNA由来の合成RNA、組換えウイルスの高力価を生成し、許容BHK-21細胞に感染性であることを明確に示します。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> オリゴヌクレオチド </td><td> 配列（5 &#39;から3&#39;） </td><td> 位置 b </td><td> 極性 </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1-22 </td><td>センス</td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td>蟻ISENSE </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td>センス</td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td>センス</td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10952から10977 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td>センス</td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10956から10977 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac TA </td><td></td><td>センス</td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 1-14 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td>センス</td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638から662 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td>センス</td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td>センス</td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10670から10694 </td><td>センス</td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10954から10977 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td colspan="4"> JEV配列は大文字で示されており、BAC配列は小文字で示されています。 Bのヌクレオチド位置は、JEV SA 14 -14-2（Genbank受託番号JN604986）の完全なゲノム配列を意味します。 </td></tr></tbody></table> 表1：cDNA 合成、PCR増幅、およびBAC突然変異誘発に使用したオリゴヌクレオチド。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> 図1。0; BACとして JEV SA 14 -14-2の完全長cDNAの構築のための戦略JEV粒子からのウイルスRNAの（A）の単離。 JEV SA 14 -14-2のゲノムRNAの概略図が示されています。全ウイルスゲノムをカバー（B）は、4つの重複するcDNAフラグメントの合成（F4のF1）。 （C）BACベクターに4重複するcDNA断片のサブクローニング、てpBAC / F4にてpBAC / F1を作成します。 （D）in vitroでのランオフ転写のためのクローン化cDNAの変更。 pBAC / F1 SP6は、ウイルス 5 &#39;末端の上流にSP6プロモーター配列を含むてpBAC / F1の誘導体です。 pBAC / F3 KOはサイレント点突然変異（T→9134、アスタリスク）が含まれてpBAC / F3の誘導体です。 pBAC / F4 ROはウイルス3 &#39;末端の下流の人工のXbaIランオフサイトが含まれていてpBAC / F4の誘導体です。 （E </<html>強い&gt;）、全長SA 14 -14-2 BACのアセンブリ（てpBAC / SA 14 -14-2）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> JEV SA 14 -14-2 の完全長ゲノムRNAをまたがる4重複cDNA断片（F1〜F4は）図2.合成 。 4 RT-PCR産物は0.8％アガロースゲルでの電気泳動により評価されます。 M、1kbのDNAラダー。 4 cDNA断片の予想サイズは、ゲル画像の下部に表示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; JEV SA 14 -14-2 の完全長cDNAを含むBAC図3. 精製 BACプラスミドを大腸菌から単離されますSDS-アルカリ溶解法によって大腸菌 DH10Bをさらに塩化セシウム、EtBrを勾配にバンディングによって精製しました。発表16×76ミリメートルシール性ポリプロピレンチューブを使用してのCsCl-EtBrを勾配の一例である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> BACで組み立て た全長のJEV SA 14 -14-2 cDNAからの 感染性ウイルスの回収の図4.概要 。cDNAテンプレートの（A）線形化。 JEV BACがで切断されたフルレングスMBNで処理をXba Iと。 （B）RNA転写物の合成。線形化されたcDNAをM 7 G（5 &#39;）pppの（5&#39;）のキャップ類似体の存在下でSP6 RNAポリメラーゼによって転写されます。 （C）の合成JEVsの回収。 in vitroで転写されたRNAは、合成ウイルスの高力価を生成し、エレクトロポレーションにより、BHK-21細胞にトランスフェクトされている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> cDNAをテンプレートとして、全長のJEV BACを用いたin vitro 転写により RNAの図5の合成 。線形化、全長のJEV BACの（A）の生成、てpBAC / SA 14 -14-2。 pBACの二つの独立したクローン/ SA 14 -14-2（Cl.1とCl.2）はMBNとXbaIで消化し ​​、その後の処理により直線化されています。線形化されたBACは、0.8％アガロースゲルでの電気泳動によって検査されます。ランオフ転写によって合成RNAの（B）の製造。 2線形化のBACのそれぞれは、SP6 RNAポリメラーゼランオフ転写のための鋳型として使用します。 2つの転写反応物のアリコートを、0.6％アガロースゲル上で実行されています。 Mは、1キロバイトのDNAラダー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> 全長のJEVのBACおよび合成ウイルスの回収から転写された合成RNAの図6.特定の感染。BHK-21細胞はモックエレクトロポレーション（モック）であるか、又はFRに由来するRNA転写産物を電気穿孔全長のJEV BAC（Cl.1とCl.2）の二つの独立したクローンのそれぞれをOM。 （A）RNAの感染力。細胞は、アガロースを重層し、トランスフェクション後4日目にクリスタルバイオレットで染色します。 RNAの感染性細胞（左パネル）にエレクトロポレーション、感染性RNAの量を推定するために、感染中心アッセイにより決定されます。また、感染性センターの代表画像（​​右パネル）が示されています。 （B）タンパク質発現。細胞を4ウェルチャンバースライド中で培養します。 20時間後、トランスフェクション（HPT）において、RNAエレクトロポレーションした細胞におけるウイルスタンパク質の発現は一次抗NS1ウサギ抗血清および二次Cy3結合ヤギ抗ウサギIgG（赤色）を用​​いて免疫蛍光アッセイにより分析されます。核を4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（青）で対比されています。免疫蛍光画像は、対応する微分干渉コントラスト画像にオーバーレイされます。 （C）ウイルス収量。細胞は1で培養します50 mmの培養皿。 22と40 HPTで、RNAエレクトロポレーションした細胞の培養上清中に蓄積された感染性ビリオンの生産をプラークアッセイにより検討されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

細菌人工染色体：プラス鎖RNAウイルスの研究のための機能ゲノミクスツール

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

bacterial-artificial-chromosomes-functional-genomics-tool-for-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.2K ビュー.  Utah State University. Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

ウイルスの変異頻度のRNAウイルスと特性の忠実性の変異の分離

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

免疫・感染学

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分離

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using &#039;Single Virus Genomics&#039;

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;シングルウイルスゲノミクス&#39;を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

呼吸器病原体に対する宿主細胞応答を研究するために偏ヒト気道上皮Calu-3細胞の液体に覆われた文化の確立<em&gt;インビトロ</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

生物発光細菌を使用してリアルタイムに急性肺炎のマウスモデルにおける肺炎球菌の毒性因子の影響を以下の

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNAウイルスの広域スペクトルの化学抑制剤のためのハイスループットスクリーニング

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

哺乳動物細胞への機能性細菌エフェクターのエレクトロポレーション

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...