このプロトコルは、染色体遺伝子を不活性化して、遺伝子機能研究および細菌用の変異体を単離するために使用できます。これにより、相同組換えプロセスがシンプル、高速、かつ高効率になります。この技術を用いて、病原体の病原性関連遺伝子を欠失させて、弱毒化ワクチンの候補として使用することができる弱毒変異体を得ることができる。
micC遺伝子の血液学的断片を含むクロラムフェニコールカセットを増幅することから始めます。プラスミドPKD3由来のクロラムフェニコールカセットを増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計し、micC遺伝子の5つの素末端および3つの素数末端からの50塩基対の相同性拡張を含む。PKD3プラスミドを鋳型として用いて本文原稿に記載のPCRを行い、クロラムフェニコールカセットを増幅する。
PCR産物のサイズをアガロースゲル電気泳動で決定します。次に、DNAゲル回収キットで生成物を精製し、分光光度法によってDNAの濃度を測定します。PKD3プラスミドによるさらなる組換えの干渉を排除するために2回目のPCR反応を実施する。
最初のPCR産物を1対200の比率で希釈し、二次PCRのテンプレートとして使用します。最初の組換え株50336デルタマイクドットキャットを構築するには、100マイクロリットルのSE 50336コンピテントセルを5マイクロリットルのPKD 46プラスミドと混合し、氷上で30分間インキュベートします。混合物を摂氏42度で90秒間ヒートショックし、2分間氷上にすばやく戻してプラスミドを細胞に形質転換します。
アンピシリン耐性プレート上で細胞を摂氏30度で一晩培養することにより、陽性コロニーをスクリーニングします。翌日、SE 50336 PKD 46液体培養液にさらに30ミリのLアラビノースを加え、振とうしながら摂氏30度で1時間インキュベートしてリコンビナーゼ発現を誘導します。100ナノグラムの精製PCR産物と40マイクロリットルのSE 50336 PKD 46コンピテントセルを感電カップに入れて混合します。
次に、感電変換を実行します。電気変換後、混合物を1ミリリットルのSOC培地と150RPMおよび摂氏30度で1時間振とう培養インキュベーターに移します。混合物をクロラムフェニコール耐性LBプレートに広げ、摂氏37度で一晩培養して、陽性コロニーをスクリーニングします。
陽性コロニーを摂氏42度で2時間培養します。次に、アンピシリンに対する感受性およびクロラムフェニコールに対する耐性についてコロニーを摂氏37度で一晩スクリーニングし、PKD46を含まない最初の組換え株を得る。PCRおよびゲル電気泳動を用いて50336デルタマイクドットネコゲノムDNAを抽出した後、100ナノグラムのプラスミドPCP 20を40マイクロリットルの50336デルタマイクドットネココンコンピテントセルに電気めっきした。
陽性形質転換体をアンピシリン耐性プレートとクロラムフェニコール耐性プレートの両方で摂氏30度でスクリーニングします。陽性形質転換体を非耐性LB液体培地に移し、摂氏42度で一晩培養します。次に、摂氏37度のLBプレート上の単一のコロニーを分離します。
アンピシリンとクロラムフェニコールの両方に敏感なコロニーを選択します。この変異体は、micC欠失変異体SE 50336 Delta micCである。50336デルタmicCを確認するには、テキスト原稿に記載されているようにPCRを実行します。
このプロトコルは、補完された変異体50336デルタmicC、pmicCにおける欠失変異体50336デルタmicCを構築するために使用された。最初の組換え50336デルタマイクドットキャットは、野生型株の279塩基対と比較して、クロラムフェニコール挿入を伴うPCR産物の約1200塩基対の予想されるバンドサイズでPCRによって検証されました。2回目の組み換えでは、クロラムフェニコールカセットがPCP20によって除去された。
PCR結果とシーケンシングを組み合わせることで、同質遺伝子micC変異体が正常に構築されたことが確認されました。株50336、50336デルタmicC、および50336デルタmicC pmicCにおけるompA、ompC、およびompD遺伝子の発現をリアルタイム定量PCRによって分析した。ompAおよびompCならびに50336デルタmicCの転写は、野生型株と比較して約2.2倍および3倍に増加した。
ompDの転写はわずかに増加しただけですが。LD 50アッセイは、6〜8週齢のBALB / cマウスに3つの株のそれぞれを感染させた後、50336デルタマイクCに感染したほとんどのマウスが感染後48時間で倦怠感、食欲不振、または下痢を示し、96時間後に死亡したことを示しました。野生型株と50336デルタmicC pmicCに感染したマウスは、感染後72時間で同じ症状を示し、120時間後に死亡しました。
3株のLD50sは、変異型50336 Delta micCの病原性が野生型と比較して2.5倍増強したことを示した。この技術は、研究者が細菌遺伝子の機能を研究し、標的遺伝子を削除することによって所望の操作された株を得るのに役立ちます。
