このビデオの目的は、成人型心筋細胞の分離、長期培養およびトランスフェクションのための標準化されたプロトコルを実証することです。マウスまたはラットから心筋細胞を単離し、培養することは、健康で疾患の心臓内の心筋細胞の細胞自律生物学を調べるのに不可欠な方法であり続ける。孤立した心筋細胞を使用して答えることができるいくつかの質問があります。
増殖ポテンシャルなど。傷害反応時に遺伝子発現変化または特異的サイトカイン発現がある。残念なことに、マウス心筋細胞は、通常の培養条件では過去1週間は生存しない。
したがって、このビデオでは、成体マウス心筋細胞を分離する最適化された方法を説明し、それらをトランスフォームして21日を超えて培養し、この技術は当初習得が困難である。しかし、練習では、分離後の心筋細胞で約80〜90%の生存を達成し、約100%のトランスフェクション効率を達成することができます。そして、正しい条件でこれらの心筋細胞のほとんどは、過去20日間生き残ることができます。
手術器具を70%アルコールに15分間浸し、その後二重蒸留水で洗浄して、手術器具を洗浄して殺菌します。水の後、次に乾燥する空気中のツールを残し、それぞれ5分間2回アルコール70%を実行して拡散装置を清掃する。流量を増やすと、アルコールが残りのアルコールを10分間二重蒸留水で洗い流した後、チューブをきれいにするのに役立ちます。
切除後に心臓をきれいにするために3つの料理を設定します。ミオサイトバッファーの 20 ミリリットルで各料理を充填します。.パスツールピペットで各料理に2〜3滴のヘパリンを加え、何度も上下にピペットを入れ、よく混ぜます。
10ミリリットルの注射器を取り、筋細胞バッファーでそれを埋めます.シリンジから気泡を取り出し、3番目の皿に斜めの位置に置き、テープで固定します。外科的縫合糸でゆるい結び目を準備し、針の周りに置きます。
麻酔の20分前にIP注入を通してヘパリンでマウスを注入する。1分間に3ミリリットルの流量で、拡散装置を通して筋細胞拡散バッファーを循環させる。5分後、拡散バッファーを酵素溶液に置き換え、プロセス中に酵素溶液を酸素で飽和させ、再度、酵素溶液を毎分3mLの流量に設定する。
つまみつまみで麻酔を確認し、外科用プラットフォームにマウスを置きます。70%アルコールで皮膚を殺菌する。胸を慎重に開き、心臓を運動し、最初の皿に心臓を入れます。
穏やかな絞りによって心臓から血液をクリアし、心臓から血液をさらに浄化し、非心臓組織を除去するために心臓を2番目の皿に移します。その後、心臓を3番目の皿に移します。大通りを見つけて、あなたの鉗子を使ってペイトンをもっとカニューラッティング針の周りに置きます。
あなたの前のタイトな結び目の締め付けを引き下げ、2番目の結び目を作ることによってそれを固定します。さらなる安定性のために順序を修正し、クリップの助けを借りて配置します。余分な縫合糸をトリミングし、最後に注射器の筋細胞バッファーを使用して心臓拡散を開始し、心臓に残っている血液のいずれかをクリアする。
慎重に注射器から計算針を取り出し、拡散装置に引っ掛けます。気泡が心臓に入るのを防ぐようにしてください。これは酵素溶液の流れと消化に影響を与える可能性があります。
水上ジャケットを上に移動し、拡散中に心臓に均質な環境を提供します。酵素溶液が毎分2〜3 mLの速度で心臓を流れるようにします。酵素溶液が心臓を2分間流れ込む。
2分間で、酵素溶液に100マイクロモル塩化カルシウム溶液の40マイクロリットルを混ぜます。酵素溶液はさらに10〜15分間心臓を通過させます。流れが滑らかになり、心臓が茶色で柔らかく見え始めると、コラゲナーゼ酵素の分布が均一になり、心臓の適切な消化を達成することができます。
消化が完了すると思ったら、ランゲンドルフ灌流システムから心臓を下ろし、5ミリリットルの酵素溶液で満たされた16ミリメートルのペトリ皿に入れ、バイオセーフティフットに持って行きます。慎重にアトリアと余分な脂肪組織を除去します。鉗子の助けを借りて定義された部分で心臓をミンチ。
滅菌パスツールピペットを取り、45度でその先端をカットします。パスツールピペットを使用して、上下に穏やかなピペットを使用して心臓組織を分割します。最適な消化は、消化を避けるために酵素活性を停止するために5ミリリットルの停止溶液を追加した後、単一細胞心筋細胞の懸濁液を提供し、最初の50ミリリットルの円錐管を取り、その上に無菌100ミクロンの細胞ストレーナーを置く。
細胞ストレーナーを通して心筋細胞の懸濁液を通過し、組織の大きな塊を取り除きます。最後に、ストレーナーを停止溶液で洗浄して、付属の心筋細胞を回収します。細胞懸濁液を20GSで3分間遠心し、上清を捨てる。
心筋細胞および10ミリリットルの停止溶液を、100ミリモルの塩化カルシウム溶液の10マイクロリットルで3分間隔で4回懸濁し、混合する。第4版遠心分離機後、心筋細胞懸濁液を20GSで3分間停止し、上清を捨てる。再培養培地に心筋細胞を再中断プレプレート細胞を60ミリメートル皿にプレートし、2〜3時間CO2インキュベーターに入れます。
2~3時間で。繊維ブラストのような主な汚染細胞タイプは、心筋細胞の純粋な分離を可能にする、皿のサービスに付着されます。その後、培養器から皿を取り出し、浮遊心筋細胞を円錐管に集め、ラミニンコーティングされた24ウェルカルチャープレートで心筋細胞を再生した。
心筋細胞が表面に付着するのに4〜6時間で十分である。したがって、トランスフェクションはめっき後6時間で行うことができました。RNA IMAXトランスフェクション試薬を使用して、siRNAを用いて心筋細胞を移植した。
培養培地には10%FBSを補った25マイクロモル血液スタテンが含まれており、長期心筋細胞培養を行い、増殖解析を誘導するのに適していることが分かりました。トランスフェクション後、マイクロインキュベーターを利用して細胞をタイムラプスイメージング用に顕微鏡で観察して心筋細胞を見ることができます。これらは、低および高倍率でトランスフェクトされた棒状心筋細胞の明視野画像である。
ここでは、成人マウス心筋細胞形態の変化を示す日ごとにイメージングを見ることができます。心筋細胞は、D分化と長期培養後だけでなく、早期の時点で健康で収縮性があることを確認します。以下は、トランスフェクションであるsiRNA後の培養における成体心筋細胞の誘発増殖を実証するKi67免疫蛍光染色の例です。
この技術を用いた結果からわかるように、マウスとラットから健康な成人心筋細胞を得て、長期的な研究のために培養することができます。結論として、この技術を習得すれば、現在の培養プロトコルをはるかに超えて心筋細胞を研究することができます。
