我々は、USFのフローサイトメトリーコアファシリティを認める。我々は、リソースを共有するためにドクターデニス·クーパーに感謝します。また、設定とこのビデオの撮影に、その支援のためのMayaコーエン、ローラペンドルトンとダイアナラトゥールに感謝します。 NNは博士号フェローシップHRD＃0929435にNSF FG-LSAMPブリッジによってサポートされています。この仕事はTGに授与米国癌学会機関研究助成＃93-032-13/Moffittがんセンターによって資金を供給された。

開始する前に、次の解決策を準備します。 3％の染色メディア（SM）： 1Xリン酸緩衝生理食塩水で3％ウシ胎児血清（FBS）（PBS） MACSバッファー（MB）： - 1XPBSでウシ血清（BSA）から0.5％アルブミン 1。マウスから収穫脾臓<ol><li>皮下に100μlの1X PBS（; TB担癌）に懸濁し、1.5×10 5マウスPanc02細胞と年齢C57BL / 6マウス（Harlan）の6-8週間を注入します。コントロールマウス（ナイーブ）100μlの1XPBSを受信します。 </li><li>約4週間ポスト噴射、二酸化炭素窒息によりマウスを安楽死させる。 </li><li>鉗子とハサミを用いて鈍的切開によるマウスから収穫の脾臓は、バランスを使用して重量を量る。別の場所の脾臓では、1×PBSを含む50 mlのコニカルチューブにラベルを付けました。 </li></ol> 2。シングルセルサスペンシオを生成します。脾臓から白血球のn すべての手順は、生物学的安全フードや氷上で保存細胞および抗体の下で無菌環境で実行する必要があります。 <ol><li>底に向かってカップの開口部にメッシュスクリーンを挿入することにより、細胞解離ふるいを組み立てます。次に、このような場所に画面を保持し、マイナス側でスレッドの領域に保持リングを挿入し、固定リングを締めリングキーを使用します。 10ミリリットル1×PBSを含むペトリ皿の中で組み立てられたふるいを置きます。 </li><li>プールの脾臓および細胞解離ふるいのメッシュスクリーンに対しても、ペトリ皿に脾臓を挽くためにガラスの乳棒を使用しています。マウスの各治療群に対して、この手順を繰り返します。 </li><li> 70μmのセルストレイナーと5ミリリットル血清ピペットを用いて50 mlコニカルチューブにフィルターを細胞懸濁液。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）で遠心します。 </li><li>脾臓あたり5ミリリットル×1 RBC溶解緩衝液上清とペレットを再懸濁しを削除します。。精力的に上下にピペッティング。室温で5分間インキュベートします。 1×PBS 20 mlを加えて反応を停止します。精力的に上下にピペッティング。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）で遠心します。 </li><li> 20ミリリットル滅菌1×PBSで上清とペレットを再懸濁しを削除します。精力的に上下にピペッティング。 </li><li> 50μlのは5×5×10 6個の細胞（ - 2×10 7細胞/ mlの1×10 7細胞/ ml）と等価になるようにトリパンブルーと3％のSMの所望の濃度で再懸濁し血球を用いて細胞をカウントします。 </li></ol> 3。フローサイトメトリーを用いてMDSCの細胞表面染色/免疫表現型<ol><li> （; MAC-1-FITC、GR-1-APCとDAPIはありませんステイン、NS）制御と補償コントロールの実験試料と単一の汚れのために96ウェルVボトムプレートのウェルにラベルを付けます。 </li><li> 96ウェルV底プレートのそれぞれのウェルに脾細胞を50μl/ウェルに相当する5×5×10 6個の細胞を追加します。遠心分離5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）でプレート。 </li><li>氷上で1.5 mlのマイクロ遠心チューブに、3％のSMで希釈したマウスのBDのFcブロック（ラット抗マウスCD16/32モノクローナル抗体）の &quot;マスターミックス&quot;（MM）を準備します。出発点として、1ウェルあたり50μlの最終容量に対して3％のSMで1μgのFcのブロックを使用しています。 </li><li>慎重に細胞ペレットを中断することなく廃棄物の容器やシンクの上に、プレート上にバックをすばやく反転させ、96ウェルV底プレートの各ウェルから上清を除去します。 </li><li> Vortexは、簡単に5秒間のFcブロックMMを遠心分離し、96ウェルV底プレート内のすべてのペレットに50μlを加える。静かに彼らのウェルにサンプルを残して、上下にピペッティングでよく混ぜる。氷上、暗所で15分間プレートをインキュベートします。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）でプレートを遠心分離します。 </li><li>サンプルは、Fcブロックでインキュベートしながら、氷の上で1.5ml微量遠心チューブに3％のSMで希釈した蛍光標識抗体の &quot;マスターミックス&quot;（MM）を準備します。抗体は、滴定されるべき染色手順のための最適な希釈を決定します。出発点として、よくサンプルあたり、50μlの最終容量に対して3％のSMで1時25 MAC-1-FITCの希釈およびGr-1-APCの1:20希釈を兼ね備​​えています。 </li><li>前述のように慎重に、96ウェルV底の各ウェルから上清を除去します。 </li><li> Vortexは、簡単に5秒間蛍光標識染色抗体のMMを遠心分離や制御、実験ペレットに50μlを加える。優しく上下にピペッティングでよく混ぜる。単染色補正のために、ウェルあたり50μlの最終容量の3％のSMは、Mac-1-FITC、GR-1-APCの1:20希釈およびDAPIの75 ng / mlで、1:25希釈を追加するそれぞれのウェルに。 （ステインはありません）も無染色に50μlの3％のSMを追加します。よく混ぜ、氷上、暗所で30分間、96ウェルV底プレートで細胞をインキュベートします。 </li><li> 96ウェルV底プレートの各ウェルに対応するラベルのFACSチューブ（5ミリリットル、12ミリメートル×75 mmのポリスチレン丸底チューブ）。各FACSに200μlの3％のSMを追加します。チューブ。 </li><li> 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）でプレートを遠心し、上清を除去します。各ペレットに100μlの3％のSMを追加することによってペレットを洗浄し、優しく上下にピペッティングでよく混ぜる。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）でプレートを遠心分離します。もう一度手順洗浄を繰り返します。 </li><li>前述のように慎重に、96ウェルV底の各ウェルから上清を除去します。 100μlの3％のSMの各ペレットを再懸濁し、よく混ぜる。 </li><li> 96ウェルV底プレートの各ウェルからのそれぞれ標識したFACSチューブにペレットを再懸濁し、100μlを転送します。 </li><li>前のフローサイトメトリー分析には、制御と実験試料とDAPI染色、単一の補償制御を75 ng / mlのDAPIを追加します。 </li><li> MDSC割合のフローサイトメトリーのデータ収集を実行します。負（無染色コントロール）と単一の陽性コントロールを使用して補正を行います。そのように、ログスケールの前方（FSC）対側方散乱（SSC）が表示され、ドットプロットを設定するの白​​血球集団興味を識別することができます。破片と最低前方と側方散乱の塊を除く、全ての白血球に大きなゲートを描画します。この親ゲートから、DAPI-（ライブ）細胞上でSSC対DAPIとゲートを表示する新しいドットプロットを作成します。この新たにゲート人口を選択し、ダブルポジティブ上のMac-1とGR-1とゲートが表示されます。ドットプロットを作成する（Mac-1 + GR-1 +）MDSC。 </li></ol> 4。 GR-1 +白血球の磁気濃縮<ol><li> 5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）で適切に標識されたFACSチューブと遠心分離機にアリコート1×10 7残りの染色白血球。 </li><li> 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内でのGr-1-PE抗体のMMを準備します。 10 7個の細胞までについては、サンプルあたり50μlのMB、にのGr-1-PE抗体の1:10希釈を使用しています。大きなセル番号については、それに応じてボリュームをスケールアップ。簡単に言うと、5秒間遠心FACSチューブ内の白血球に加え、4℃、15分暗所でインキュベートします。 </LI&gt; <li> 、FACSチューブにMBの2ミリリットルを追加し、5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）で遠心し、上清を捨てる。 </li><li> 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに抗PE MicroBeadsはMMの準備をします。 10 7個の細胞までは、サンプルごとに、200μlのMBでの抗PE MicroBeadsでの1:4希釈を使用しています。大きなセル番号については、それに応じてボリュームをスケールアップ。簡単に言うと、5秒間遠心FACSチューブ内の白血球に加え、4℃、15分暗所でインキュベートします。 </li><li> 、FACSチューブにMBの2ミリリットルを追加し、5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）で遠心し、上清を捨てる。 SBの3 mlのペレットを再懸濁します。新しい、標識された50 mlコニカルチューブに70μmのストレーナーを介してフィルタリングします。 </li><li>作成し、内閣総理オートMACSプロセパレータ。適切なソリューションと空の廃液ボトルと詰め替えはすべてのボトルは、必要に応じて。楽器の電源を入れ、初期化後に液体容器や列（s）の状態を調べる。すべてのシンボルは緑色でなければなりません。メニューには、上部から &quot;分離&quot;を選択してくださいメニューバーには、下のメニューバーから &quot;今すぐ洗い&quot;が続く。プライミング処理を開始するために &quot;実行&quot;に続いてポップアップオプションから &quot;すすぎ&quot;を選択します。プライミング処理が正常に完了すると、測定器は、それが[ステータス]メニューの下の &quot;分離のための準備&quot;であることが表示されます。 </li><li>行Bの否定的なフラクションコレクションと行のCの肯定的なフラクションコレクションのために15 mlコニカルチューブの行、50 mlコニカルチューブに磁気標識した細胞をチューブのサイズと場所に適した冷却したチューブのラック50mlコニカルチューブを選択します。 </li><li>サンプルから区別するモードで標識した標的細胞のポジティブセレクションのための &quot;POSSEL_S&quot;細胞分離プログラムを選択します。磁気標識した標的細胞をオートカラムに保持されます。非標識細胞は磁石の自動後退の行Bに負の分数のコレクションチューブに放出され、標識した標的細胞は、チューブの行Cで正のコレクションチューブに放出されます。ラック。 </li></ol>+充実した白血球のポストソート分析<ol><li> GR-1 +とGR-1を再集計-トリパンブルーと血球計を使用した画分を。 3％の染色培地中の所望の濃度で再懸濁した細胞を50μlの5×5×10 6個の細胞（1×10 7細胞/ ml - 2×10 7細胞/ ml）と等価であるように、それに応じて標識されたFACSチューブに50μlを転送します。 </li><li>サンプルあたり50μlの最終容量の3％のSMで1:25希釈で、唯一のMac-1のMMを準備します。細胞を染色し、フローサイトメトリー分析用G​​R-PEは、Mac-1 FITCおよびDAPIの単一の染色補正を準備します。前述のように200μlの3パーセントのSMとDAPI生存染料を追加します。 </li><li>パーセンテージもMDSC割合事前·事後autoMACS濃縮を比較する- GR-1 +とGR-1を決定するためにフローサイトメトリーのデータ収集を実行します。 </li></ol> 6。代表的な結果ここでは、rを示す<html> MDSC（ 図1）の並べ替え、その後のFACSのためにプールされた、ナイーブ脾臓からのGr-1 +白血球のautoMACS濃縮用epresentative結果。 1×10 6ナイーブ白血球前autoMACSのソートに、BD LSRII器を使用してMDSC割合を識別するには、Mac-1-FITCとGr-1-APC抗体で染色した。 1×10 7ナイーブ白血球はその後autoMACS Proの区切り記号を使用して、GR-1 +白血球の濃縮のためにAnti-Gr-1-PE抗体およびPE-MicroBeadsを用いて染色した。ポストautoMACSの濃縮は、GR-1 +とGR-1 GR-1の割合-収集した画分はフローサイトメトリーを用いて評価した。 1×10 6のGr-1 +白血球は、フローサイトメトリーによって腫瘍を白血球をプールし、非濃縮する濃縮のMDSC割合、プールされたナイーブな白血球を分析し、比較するには、Mac-1-FITC抗体で除去し、染色した。 fig1.jpg &quot;/&gt; ソートMDSC FACS用ナイーブGR-1 +白血球の図1。AutoMACS濃縮。脾臓、膵臓腫瘍を有するとナイーブなマウスから採取し、単一細胞懸濁液に加工された。ナイーブな白血球表面のフローサイトメトリー分析の前autoMACS濃縮（）には、Mac-1とGR-1蛍光標識抗体で染色した。 GR-1 +（B）とGR-1のフローサイトメトリー分析- GR-1-PE抗体と抗PE MicroBeadsで染色し、プールされたナイーブleuckocytesからのGr-1 +細胞の（C）分画のポストautoMACS濃縮。 MDSCおよびGR-1のフローサイトメトリー分析のGr-1 +の割合はポストautoMACS濃縮担癌マウス（E）から非濃縮プールされた白血球（ナイーブマウス、n = 5の場合と比較して、プールされたナイーブな白血球（D）から+細胞、担癌マウス、n = 3）で。 MDSCおよびGr-1の割合は、代表的なコンタープロットとヒストグラムのゲートがあります。

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利害の衝突が宣言されません。

これは、様々な動物モデルから別のリンパ組織にも適用可能であるMDSC集団を処理し、immunophentypingの詳細な方法です。特に、autoMACSの濃縮は、脾細胞4のGR-1の枯渇、脾臓細胞、リンパ節5から骨髄のサブセットの精製、CD8の骨髄好中球14の単離および精製+脾臓からT細胞を含む種々の白血球集団の分離に使用することができますとリンパ節15。かかわらず?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> COMPANY </td><td> カタログ＃ </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 1Xリン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィックハイクローン</td><td> SH30028.02 </td><td>のCa 2 + / Mg 2 +を /フェノールレッドフリー</td></tr><tr><td>ウシ血清（BSA）からアルブミン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A7906 </td><td> BSAをPBSに邪魔されずに溶解させ、無菌環境</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィックハイクローン</td><td> SV3001403HI </td><td>不活化熱、無菌環境</td></tr><tr><td>ラット抗マウスCD16/32モノクローナル抗体（FCブロック） </td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 553142 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td>抗マウスCD11bをする（Mac-1）のFITC </td><td> eBiosciences </td><td> 11から0112 </td><td>無菌の環境</td></tr><tr><td>抗マウスLy6G（GR-1）APC </td><td> eBiosciences </td><td> 17から5931 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td>抗マウスLy6G（GR-1）PE </td><td> eBiosciences </td><td> 12から5931 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td> DAPI </td><td>インビトロジェン</td><td> D1306 </td><td>希釈無菌環境</td></tr><tr><td>細胞解離ふるい</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> CD1-1KT </td><td>使用前にオートクレーブ</td></tr><tr><td> 70μmのストレーナー</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352350 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td> 1X RBC Lysis Bufferを</td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td>無菌環境、使用前に室温に暖かい</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08-757-12 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td> 50ミリリットルCONiCalの管</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 339652 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td> 5ミリリットル12X75mmポリスチレン丸底チューブ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352054 </td><td> FACSチューブとして知られている。無菌環境</td></tr><tr><td> 96ウェルV底プレート</td><td>コー​​ニング</td><td> 3897 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td> Cellgro </td><td> 25から900-CI </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td> PE MicroBeadsは</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-048-801 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td> AutoMACS Proのセパレータ</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS列</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-021-101 </td><td></td></tr><tr><td>ランニングバッファーAutoMACS </td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-091-221 </td><td&gt; </td></tr></tbody></table>

preparation of myeloid derived suppressor cells (mdsc) from naive and pancreatic tumor-bearing mice using flow cytometry and automated magnetic activated cell sorting (automacs)

MDSCは、寄生虫感染、炎症、外傷後ストレス、移植片対宿主病、糖尿病や癌1から7を含む病理学的条件下でリンパ系器官に蓄積される未熟なマクロファージ、樹状細胞および顆粒球の不均一な集団である。マウスでは、MDSCエクスプレスMAC-1（CD11bを）とGR-1（Ly6GとLy6C）の表面抗原7。 MDSCはよくそれらが大幅に拡大し、7月10日ナイーブな対応に比べて抗腫瘍免疫応答を抑制されている各種担癌宿主内で研究されていることに注意することは重要です。しかし、病態に応じて、抑制11,12の別個のメカニズムやターゲットとMDSCの異なる亜集団が存在する。したがって、実行可能なMDSC集団を分離するための効果的な方法は、in vitroおよび in vivo で抑制のそれぞれ異なる分子メカニズムの解明において重要である。 最近、Ghansahグループは、マウスの膵臓癌モデルでMDSCの拡大を報告しています。私たちの担癌MDSCは、恒常性の損失を表示し、ナイーブなMDSC 13に比べて抑制機能を増加させた。 MDSC割合はナイーブ対担癌マウスのリンパ系のコンパートメントで有意に少なくなります。これは、しばしばこれらのMDSCの正確な比較分析を妨げている主要な警告です。したがって、前の蛍光活性化セルソーティング（FACS）にナイーブマウスからのGr-1 +白血球を豊かにすると、純度、生存率を高め、大幅にソート時間が短縮されます。これらはソートクイックFACSのために豊富にありますしかし、担癌マウスからのGr-1 +白血球の濃縮はオプションです。したがって、このプロトコルでは、我々はMDSCをイムノタイムリーにMDSCをソートするためのナイーブマウスの脾臓からのGr-1 +白血球を濃縮する非常に効率的な方法を説明します。免疫C57BL / 6マウスは、マウスPanc02 CEを接種するナイーブなマウスは、1XPBSを受け取るのに対し、皮下LLS。約30日後に接種、脾臓細胞解離ふるいを使用して単一細胞懸濁液に収穫し、処理されます。脾細胞は、その後赤血球（RBC）を溶解し、これらの白血球のアリコートを、フローサイトメトリーを用いた免疫表現型MDSC割合にMac-1とGR-1に対する蛍光標識抗体を用いて染色されています。平行実験で、ナイーブマウスからの全白血球は蛍光標識のGr-1抗体、PE-MicroBeadsでインキュベートし、積極的に自動化された磁気活性化細胞選別（autoMACS）プロ区切り記号を使用して、選択した状態で染色されています。次に、GR-1 +白血球のアリコートを、フローサイトメトリーを用いてMDSC割合の増加を識別するためにMac-1抗体で染色されています。今、これらのGR1 +濃縮白血球は 、in vivo および in vitro での比較分析（ナイーブ対担癌）で使用するMDSCのソートFACSの準備ができている</em&gt;のアッセイ。

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Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

これは、ミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）をイムノおよびGr-1を豊かにし、迅速かつ包括的な方法です<sup&gt; +</supマウスの脾臓から&gt;白血球。このメソッドは、実行可能なGR-1に濃縮するために選別フローサイトメトリーとAutoMACSセルを使用しています<sup&gt; +</sup使用するためにMDSCのソート、FACSの前に&gt;白血球<emin vivoでの&gt;</em&gt;と<em&gt; in vitroで</em&gt;アッセイ。

フローサイトメトリーおよび自動化された磁気活性化細胞選別（AutoMACS）を使用して、ナイーブ膵腫瘍を有するマウスからミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）の調製

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

26.1K ビュー.  University of South Florida Morsani College of Medicine. これは、ミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）をイムノおよびGr-1を豊かにし、迅速かつ包括的な方法です +白血球。このメソッドは、実行可能なGR-1に濃縮するために選別フローサイトメトリーとAutoMACSセルを使用しています +白血球と in vitroで...

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

ソート幹細胞アッセイおよびフローの原発性脳腫瘍組織の処理

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

医学

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

臨床および前臨床研究用途のための半自動循環腫瘍細胞（CTC）アッセイの適応

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

ナノボディ及び抗体ベースの検証<em&gt;インビボ</em使用してマウスにおける&gt;腫瘍異種移植NIRFイメージング実験<em&gt;エクスビボ</em&gt;フローサイトメトリーおよび顕微鏡

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別によるヒトリンパ内皮細胞の単離

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（<em&gt;アオコ緑膿菌</em&gt;）フローサイトメトリーを使用して

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.