我々のプロトコルは、T細胞誘発腫瘍細胞アポトーシスにおける骨髄由来サプレッサー細胞および腫瘍関連マクロファージの効果を評価する。潜在的な治療介入の根本的なメカニズムの調査と並んで。このプロトコルは、T細胞誘導性腫瘍細胞アポトーシスを高感度で直接評価し、細胞間相互作用の縦方向解析およびイメージングを可能にする。
チェックポイント阻害剤の有効性は、特定の腫瘍タイプにおける腫瘍浸潤骨髄細胞によって最もよく見られる。この技術は、これらの腫瘍に対する新しい治療法の同定につながる可能性がある。この方法は、がん免疫学の研究を進めるだけでなく、免疫不全や自己免疫疾患に関する洞察を提供する可能性もあります。
脾臓分離CD8陽性T細胞の活性化および増殖のために、最初のアリコートは、E-DMEMの50マイクロリットルの50マイクロリットルのCD8陽性T細胞に10回10回、96ウェルU-底板の個々のウェルに入った。次に、50マイクロリットルのE-DMEM、または50マイクロリットルのE-DMEM単独で50マイクロリットルの5番目のサプレッサー細胞に10回10をT細胞の各ウェルに加える。次に、50マイクロリットルの新たに調製した活性化培地と50マイクロリットルのE-DMEMを、目的の試験試薬の有無にかかわらず、適切なウェルに加えます。
そして、プレートを摂氏37度、湿度95%の5%の二酸化炭素インキュベーターに4日間置きます。事前活性化CD8陽性T細胞標的細胞共培養をセットアップするには、まず顕微鏡に適した96ウェルフラットボトムプレートの適切なウェルに、1〜100-希釈成長因子減少可溶性基底膜マトリックスの30マイクロリットルを追加します。プレートを振ってマトリックスを均等に広げ、プレートを細胞培養インキュベーターに少なくとも1時間置きます。
プレートが平衡している間、ターゲット細胞を準備する。培地を吸引し、PBSで洗浄し、室温で05%トリプシン-EDTAの1ミリリットルを1分間加えます。9ミリリットルのDMEMを、穏やかなピペットによって胎児ウシ血清を添加し、解き分けた細胞をチューブに移す。
細胞を遠心した後、500マイクロリットルのE-DMEMでパレットを再懸濁する。細胞ストレーナーを通して再中断された細胞をフィルタリングし、生きている細胞を数えます。次に、氷上の新鮮なE-DMEMで1ミリリットル当たり4倍の標的細胞に密度を10倍に調整します。
次に、プリ活性化CD8陽性T細胞を数回ピペットし、細胞を単一の細胞懸濁液に再懸濁させ、浮遊T細胞を1つの1.5ミリリットルチューブに1つの条件に移した。井戸あたり200マイクロリットルのPBSで残りの細胞を収集し、適切な1.5ミリリットルチューブに流し込み、遠心分離機を入れ替えます。培地を吸引し、遠心分離のために各チューブにE-DMEMを1ミリリットル加えます。
遠心分離後、1管当たり新鮮なE-DMEMの100マイクロリットルでペレットを再懸濁する。カウント後、各チューブ内の細胞を1.6倍の密度に調整し、培地1ミリリットル当たり5番目の事前活性化CD8陽性T細胞に調整し、細胞を氷の上に置きます。細胞の準備ができたら、96ウェル顕微鏡プレートの各ウェルから基部膜マトリックスを吸引し、混合してプレートの内側60ウェル内の個々のウェルにターゲット細胞の50マイクロリットルを追加します。
25マイクロリットルのE-DMEMをIL2のミリリットル当たり3単位に4倍10回添加し、10マイクロモルフルオロゲンカスパーゼ-3基質を適切なウェルに加えます。次に、適切なウェルに25マイクロリットルの事前活性化CD8陽性T細胞を加えます。最後に、E-DMEMを適切なウェルに加え、最大100マイクロリットルの総容量を作ります。
すべての空の井戸にPBSまたは無菌水の200マイクロリットルを追加します。プレートを振り、平らな面に10分間置いておきます。細胞を画像化するには、顕微鏡を位相コントラストで画像を取得するように設定します。
核制限蛍光タンパク質に適した蛍光チャネルと同様に、実験で使用される蛍光活性カスパーゼ-3基質とが挙げられる。次に、各実験井戸の位相コントラストと2つの蛍光チャネルの画像を1~3時間ごとに、少なくとも72時間撮影します。撮影した画像を解析するために、基質信号に用いる蛍光チャネルにカスパーゼ-3基質を含まない標的細胞と培地のみを含むコントロールウェルから画像を開く。
核から不適切な蛍光シグナルが出されているかどうかを観察する。基質信号が核内で明らかな場合は、スペクトルを使用して、基質信号が消失するまで、核信号から除去される基質信号の割合を増加させる。次に、2つの蛍光チャネル内のカスパーゼ-3基質を含まない培地に核非標識エフェクター細胞のみを個別に含む対照ウェルを見る。
シグナルが核によって放出されるかどうかを観察します。個々のチャンネルに信号が見えない場合、スペクトルのアンミックスは必要ありません。蛍光チャネルの両方で蛍光オブジェクトを解決するには、サンプルに関連するパラメータとエッジ分割に適切なパラメータを持つ蛍光バックグラウンド減算方法を使用します。
標的細胞単一培養の画像を用い、標的細胞核蛍光のパラメータを確立する。エフェクター細胞単一培養の画像を使用して、基質誘発性アポトーシス核蛍光のパラメータを確立する。共培養の画像を使用して、標的細胞における基質誘発性アポトーシス核蛍光のパラメータを検証または精製します。
標的核の最小サイズを決定するには、カスパーゼ基質を有する標的細胞のみを含むウェルからの核シグナルチャネル内の画像を使用する。アポトーシスエフェクター核の平均サイズを決定するために、カスパーゼ基質を有するエフェクター細胞のみを含むウェルからの基質シグナルチャネル内の画像を使用する。蛍光標的細胞核数をカウントするには、適切な最小サイズ制限を用いて分析手順を設定する。
エフェクター細胞単一培養画像を用いて、アポトーシスエフェクター核の平均サイズよりも大きいアポトーシス核の数を数える第2の分析手順を設定する。次に、核信号とサイズ制限基質シグナルが有意に共局化する核数をカウントしてアポトーシス標的細胞の数をカウントする第3の分析手順を設定する。典型的には、癌細胞は、細胞が抑制細胞の不在時に抗体によって事前活性化されたCD8陽性T細胞と接触する場合、核標的カスパーゼバイオセンサーの活性化後の核内の蛍光シグナルを増加させる。
CD8陽性T細胞の核サイズは、癌細胞の核サイズよりも小さい。従って、アポトーシスエフェクター細胞は、サイズ制限画像解析法によりアポトーシス標的細胞数から除外することができる。一部の標的癌細胞は、蛍光基質のない小さな丸みを帯びた形状を示すが、これは分析に影響を与えない。
これらの細胞はアポトーシスではなく有糸分裂を受けているため、核基板信号オーバーラップマスクによってアポトーシス標的細胞数から除外される。CD8陽性T細胞を有する標的癌細胞の共培養は、癌細胞単一培養における自発的アポトーシスのレベルを上回る腫瘍細胞アポトーシスを増加させる。一般的に、エフェクター細胞に対する標的癌細胞の最適比を用いた場合、アポトーシス標的癌細胞の数のピークが観察され得る。
このピークは、データがターゲット細胞集団のアポトーシス画分として表される場合により明確になります。このプロトコルを試みる際に覚えておくべきことは、標的細胞の単一培養と、分析マスクの開発に使用するエフェクター細胞の単一培養を設定することです。この方法は、T細胞からがん細胞への相互作用の持続時間および頻度、およびヒトおよびマウス細胞の両方における遺伝子依存性細胞毒性に関連する条件に関する洞察を提供することができる。
現在、このアッセイをヒト細胞を用いたハイスループットスクリーンに開発し、骨髄細胞介在免疫抑制を阻害する化合物を同定し、チェックポイント阻害剤の有効性を高めています。
