著者らは、のためにアイオワ州立大学のフローサイトメトリー施設からの財政支援と博士ショーン·リグビーは、米国陸軍医学研究および資材コマンド（グラント番号W81XWH-09-1から0386までとW81XWH-10-1-0806）に感謝したいと思います彼の専門的なテクニカルサポートを提供しています。

1。肺洗浄を使用してマウスから肺胞マクロファージを（AMɸ）収穫<ol><li>このような実験着と使い捨て手袋、適切な眼の保護、適切な個人用保護具（P​​PE）を着用してください。 </li><li>収穫の開始前に完全なAMɸ（cAMɸ）培地を準備します。 Dulbelccoダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の222.25 mLのペニシリン/ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌）溶液に、β-メルカプトエタノール（2 - メルカプトエタノール）を250μL、熱不活化ウシ胎児血清（FBS）を25 mLの2.5 mLを加える。 cAMɸ媒体が真空下で孔径0.2μmボトルトップフィルタを使用してフィルター滅菌する。 </li><li>安楽死のチャンバー内のCO 2窒息により健康なマウスを安楽死させる。 C57BL / 6マウス（6-8週齢）は、このプロジェクトの目的のために使用されていますが、この肺胞洗浄法は、マウスのいずれかの株に行うことができます。圧縮ガスシリンダーを使用して、チャンネルにマウスを置く前に1分間チャンバー内にガスを流すチャンバが完全にCO 2が充電されることを保証するためにオレンジ色に点灯します。マウスを安楽死させるために少なくとも1分間チャンバー内にマウスを置きます。さらに、1.4で説明したように、マウスの死亡を確認するために物理的な方法として、心臓穿刺を介して各マウスを放血させる。 </li><li>その背中の上にマウスを置く（背側）、70％エタノールでスプレー、胸骨を見つけて、腹部から30度の角度で、胸腔内に約50mm 23ゲージの針を（1 mLシリンジに接続されている）を挿入する。針の適切な配置と、それはマウスの大きさに応じて血液中の0.4から1 mLの間に収集することが可能でなければなりません。バイタルサインの停止のために動物を調べます。 </li><li>実験台の上に置き、マウス、その腹部（腹側）に横たわっているようにします。作業環境を滅菌するために70％エタノールでスプレーマウス。約半分マウスの背筋皮をつまむ。 70％エタノールで滅菌された解剖はさみを使用して、皮膚を​​通して小さな切開を行います。&lt;/ LI&gt; <li>切開の両側に皮をつかむと、マウスの頭蓋 - 尾軸に沿って反対方向に肌を引き出します。正しく完了したら、皮膚は、基礎となる枝肉から削除されます。 </li><li>マウスの首は現在公開され、筋肉や腺を表示する必要があります。慎重にその組織を切り取って、それによってマウスの喉頭、気管、食道を露出し、鉗子を使用して、マウスの前方に向かって引き出します。頸静脈または頸動脈を切断しないようにしてください。 </li><li>気管は、現在表示され、その周りの軟骨環を有する組織として識別できます。繊細な鉗子で気管を保持し、ゆっくりと持ち上げると背側に位置して食道から気管を分離します。 </li><li>いずれかが気管が喉頭に後方を保持している場所の前方に小さな切開を行います。切開は約45°度の角度でなされるべきである。これに後退からそれを防ぐことができますとしても、完全に、気管を横断するしないでください体腔。 </li><li>気管の内腔にカテーテルを挿入するための準備中に、滅菌PBSでトムキャットカテーテルを装着し1ccのシリンジを記入してください。鉗子を用いて気管を保持し、手でコントロールを向上させ、穏やかに気管切開部位に挿入し先端に近いカテーテルを保持します。穏やかに20mm程度気管にカテーテルを挿入します。もう一方の手を解放し、カテーテル管の周囲にある気管を掴む。 </li><li>カテーテルを装着し1 mLのシリンジを用いて、穏やかに肺に室温、滅菌したPBSの0.75 mLを注入し、PBSで穏やかに戻ってシリンジに吸引します。外部からの胸をマッサージしながら、このプロセスを3回繰り返します。カテーテルからシリンジを取り外し、15 mLの遠心チューブに洗浄液を分注する。新鮮なPBSの0.75 mLの注射器を充填し、カテーテルにシリンジを再接続した後、各マウスについて、手順1.9倍1.10を繰り返します。流体の回復はVO未満を取得し、部分的かもしれませんLUMEが注入された。複数のマウス由来の細胞を収集する場合、すべての肺lavagesが実行されるまで、氷の上で採取した細胞で15 mLのチューブを配置します。 </li></ol> 2。肺洗浄AMɸハーベストの処理<ol><li> 4時10分℃、250×gで肺胞洗浄液を遠心</li><li>バイオセーフティキャビネット内の適切な廃棄容器に無菌、上清をデカントを使用します。静かに試験管ラックの上部に遠心管を掻き集めることによって、細胞ペレットを再懸濁します。細胞を再懸濁するcAMɸ培地1 mLを加える。 </li><li>コー​​ルターカウンターバイアルにISOTON II希釈液の10 mLに細胞を20μLをピペッティングによりコールター粒子カウンタZ1を用いて細胞を列挙します。 、バイアルにZAP-oglobin II溶解試薬の3から4滴を加え穏やかに反転し3〜4倍して、細胞濃度を得るためにカウンターの上にサンプルバイアルをロードします。表示するには、2×10 4の希釈率でカウンタをプログラムしてくださいmL当たりの細胞数として細胞濃度。 </li><li> cAMɸ培地を用いmL当たり2.5×10 5細胞を希釈する。 </li><li> 6ウェル組織培養皿の各ウェルに2.5×10 5細胞/ mL 2 mLを分注します。 </li><li>細胞がウェルの底に付着できるようにするには、AMɸために6時間、5％CO 2雰囲気下37℃の加湿インキュベーター内にインキュベートし、培養皿を豊かにする。付着細胞を破壊しないように静かに上清を吸引除去する。 </li><li>非接着細胞および残骸を削除するには、滅菌PBS（カルシウムとマグネシウムは無料）を使用して、ウェルを洗浄します。各ウェルにcAMɸ培地2mlを追加します。 </li><li>覚せい剤を添加する前に、5％CO 2雰囲気下37℃の加湿インキュベーター内に一晩細胞をインキュベートします。この濃縮工程の後、細胞の約87％はマクロファージマーカーCD11bをとF4/80（ 図2c）に対して陽性である。 </li></ol> 3。 Polyanhydridの追加電子ナノ粒子およびコントロールトリートメント<ol><li>無水物の抗溶媒のナノカプセル化15を介してナノ粒子を作製する。このプロセスでは、ポリマーは塩化メチレンに溶解し、（4°C 25 mg / mLの濃度で）、ペンタン（比1:200塩化メチレン-20°C：ペンタン）で沈殿させた。 </li><li>滅菌は、正確にマイクログラムの量を測定することができますバランスに紙の重さを使用して無水物ナノ粒子を秤量する。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに粒子を追加します。 </li><li> cAMɸ冷たい氷の中にナノ粒子を再懸濁します。計算は、媒体のそれ以上の0.3 mLをナノ粒子の所望の濃度を得るために各ウェルに添加されるように作られています。ナノ粒子がウエルの培養に追加されるまで氷上で再懸濁粒子を保持します。 </li><li>前のAMɸ文化にナノ粒子を追加する、マイクロチップのベンチトップ超音波を用いた粒子を超音波洗浄します。 70％エタノールとwipinを噴霧してマイクロチップを殺菌超音波処理の前に滅菌キムワイプでg。チューブを氷上に保ちながら、30から45の10〜20ジュールで超音波洗浄します。肉眼的にナノ粒子懸濁液を観察します。粒子が十分に分散されていない場合は、懸濁液は、ナノ粒子が30から45秒のために再度超音波処理する前に、ポリマーのガラス転移温度以下であることを確認するには、1〜2分間氷上で設定することができます。この超音波処理ステップの目的は、十分に50:50 CPTEGとして、ナノ粒子を分散させることです。水性の環境にさらされた場合CPHナノ粒子が凝集してしまう傾向がある。しかし、ナノ粒子のいくつかの小さな凝集体は依然として懸濁液中に残ることがあります。 </li><li>ナノ粒子懸濁液は、（十分に分散する）氷上で保存すべきであり、時期尚早の表面侵食や凝集を防ぐために直ちに使用することができます。 </li><li>インキュベーターからAMɸおよびバイオセーフティキャビネット内の場所を含む培養皿を取り外します。メディ量から約45度の角度とピペットで傾斜プレートええと、その（それは0.3 mLを超えないようにしてください）​​ナノ粒子懸濁液に添加されます。培地を除去したときに接着細胞を乱すことがありません。 </li><li>渦前に、適切なウェルにそれを追加する簡単に無水物ナノ粒子懸濁液。特定のウェル（S）にナノ粒子懸濁液の量（以上0.3 mL）をピペットでいますが、混在させるピペッティングしていません。このアクションは、井戸からAMɸ付着を切り離すことができます。粒子は井戸の底に沈殿した細胞を連絡させていただきます。このレポートで説明されている研究のために、ナノ粒子の最終濃度AMɸと共培養し、125μg/ mLであった。その後の井戸と、所望の治療群に進みます。そのような培地のみと指定された井戸から200 ng / mLのリポポリサッカライド（LPS）などの正および負の対照群が含まれています。 </li><li> 48時間5％CO 2雰囲気下で37℃の加湿インキュベーターに培養皿を返します。私たちのlaboratorにおける運動の研究yはそれが発生する転写とタンパク質合成のための十分な時間を許可するように細胞表面マーカーの発現およびサイトカイン分泌の両方を評価するための最適な培養期間であることが48時間を示している。サイトカインの高いレベルは、拡張培養期間（すなわち、72時間）の間に蓄積されていますが、この時点で評価する細胞表面マーカーの発現はサイトカインの上昇の寄与によって混同することができます。観察表面マーカー発現の変化は、ナノ粒子自体の刺激に直接起因するとは限りません。 </li></ol> 4。フローサイトメトリーを用いてAMɸアクティベーションを評価する<ol><li>蛍光活性化セルソーティング（FACS）緩衝液（0.1％アジ化ナトリウムおよび0.1％ウシ血清アルブミン（BSA））0.1 Mリン酸は、従来のナノ粒子Oと共培養されたメッキマクロファージを採取する液（pH7.4）緩衝生理食塩水を準備します。rの覚せい剤。 </li><li>ブロッキングバッファーおよびモノクローナル抗体のワーキング溶液を調製。ブロックバッファを準備するには、FACS緩衝液中で、それぞれ、ラットIgG（Sigma）およびanti-CD16/32（ベイバイオサイエンス）に1 mg / mLと10μg/ mLで希釈します。メーカー推奨濃度またはユーザ最適化された濃度のいずれかにFACS緩衝液で表面マーカー抗体のパネルを希釈します。本研究で示された結果のため、表面マーカーパネルは、MHC II、CD86、CD40およびCIRE（CD209）に対する抗体で構成されています。マクロファージマーカーF4/80とCD11bに対する抗マウス抗体はまた、積極的にデータ解析時にマクロファージ表現型を識別するために、パネルに含まれています。近交系マウスは、しばしば彼らのMHC IIハプロタイプが異なるように、MHC II分子に対する抗体を選択する際には注意する必要があります。選択された抗体は、目的のマウス系統によって発現特定のMHC同種抗原と反応しなければなりません。 </li><li>ナノ粒子および/またはとのインキュベーションの48時間後覚せい剤、20分間氷上に静置細胞培養皿。プレートから付着したマクロファージを削除するには、穏やかに24センチメートルセルスクレーパーで井戸を落とす。 </li><li> 5 mLの血清学的ピペットを使用して、静かに、単一細胞懸濁液を生成するために上下に5回細胞と培地を吸引除去する。独立した5mLのポリスチレンチューブに個々のウェルの内容物をピペットように異なった実験的な治療から細胞を一緒に混合することはありません。 </li><li>各チューブへのFACS緩衝液2mlを追加します。 </li><li> 10分間、4℃で250×gで細胞のチューブを遠心します。 </li><li>試験管ラックの上部にチューブを掻き集めることにより上清をデカントし、残留液に静かに再懸濁し、細胞ペレット。 </li><li>モノクローナル抗体の非特異的結合を防ぐために、細胞の各チューブにブロッキングバッファー10μL（4.2で調製）を追加します。渦管と30分間氷上でインキュベートする。 </li><li>各チューブとincubに希釈したモノクローナル抗体の適切なボリュームを追加する15分間、氷上で暗闇の中で食べました。分析するサンプルが含まれているチューブは、polycromaticパネル（前の抗体の組み合わせの最適化、個々のラボで行われるべきである）の抗体の組み合わせを受信する必要があります。追加の制御グループが正しく個別に単一色を使用して標識した細胞に対応して標識されていない細胞の管を含む、フローサイトメーターで測定パラメータ、および補償管を設定するには、含まれるべきである。正しくフローサイトメトリー分析のためにゲートを設定するには、蛍光マイナスワン（FMO）のコントロールは、取得時に含まれるべきである。 FMOのコントロールは、それぞれのアイソタイプコントロールに置き換えられています1を除いてパネルに使用​​されるすべての蛍光標識抗体で標識した細胞である。正と負の集団（すなわち、単独で陽性対照刺激と培地で処理した細胞の別のアリコート）もFMOと補償制御管に含まれるべきである。 </li><li&gt;は、10分間4℃、250×gで各チューブ、ボルテックスと遠心℃にFACS緩衝液2 mLを追加します。 </li><li>上清をデカントし、試験管ラックの上部にチューブをかき集め、残留液に再懸濁し、細胞ペレット。 </li><li>抗体パネルは蛍光色素に直接結合しない抗体で構成されていますが、代わりにビオチンに結合している場合は、蛍光標識ストレプトアビジンは、表面マーカーを可視化するために必要とされる。このステップでは、希釈した蛍光標識ストレプトアビジンの適切な量を追加し、氷上で15分間、暗所でインキュベートします。 4.2のように、ストレプトアビジンは、製造元が推奨する濃度になるように、またはユーザが最適化されたものに希釈されます。この手順は、ビオチン化一次抗体を含むパネルが必要になります。 </li><li> 4.10で説明したように洗浄ステップを実行します。 </li><li>脱イオン水で固定1:3安定BDの適切な量を希釈します。しばらく静かにVOを各チューブに希釈固定液100μLを追加します。細胞の凝集を防ぐためrtexing。 °Cで約一週間のフローサイトメーターで買収する前にラベルを付け、固定した細胞を安定的に4℃で暗所に保存することができます。 </li></ol> 5。代表的なデータステップ3.1で作製したナノ粒子は、163の平均直径±24 nmであり、これまでの研究5,16で得られたものと一致する形態を持っていた。超音波処理の前後に溶液中でナノ粒子は、粒子の適切な分散を確保するために超音波処理の必要性を示すために、 図1に示されています。肺胞を介して得られる収穫AMɸsのフローサイトメトリー分析は、 図2に示されています。抗マウスCD11bを、抗マウスF4/80抗体と同様に対応するFMOコントロールの組み合わせで細胞を標識すると、さらに分析するためにAMɸsとゲーティングを識別し、バックグラウンドの標識を確立することができる。無水物と肺胞マクロファージの治療MHC II、CD40、CD86、およびCIRE（ 図3）の増加、平均蛍光強度で示すように、ナノ粒子は、活性化を高めます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> 図1 50:50 CPTEG：CPH（）は前にナノ粒子と超音波の（B）30秒後。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> 図2フローサイトメトリー（A）のAlexa Fluor®700抗CD11bとPE-Cy7 FMOコントロール、（B）のAlexa Fluor 700 FMO制御とPE-Cy7 anti-F4/80で標識された収穫肺胞マクロファージの分析と（C ）のAlexa Fluor®700抗CD11bとPE-Cy7 anti-F4/80。右上隅にある番号は、二重陽性細胞の割合を表します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> 図3蛍光INTENの増加を示すヒストグラム50:50 CPTEGと肺胞マクロファージの共培養後、MHC II（）、CD40（B）、CD86（C）とCIRE（D）の表面発現のためにsity：CPH無水物は、48時間ナノ。ヒストグラムはAMɸFMOコントロールとしてラベルの結果を示している（ <img alt="グラフの1行目" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ）、未処理のAMɸすべての細胞表面マーカーに対する抗体で標識された（ <img alt="グラフの3行目" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> ）とAMɸナノ粒子を培養し、すべての細胞表面マーカーに対する抗体で標識された（ <img alt="グラフの2行目" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> 。）

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	<li>Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+biomaterials.">Immunomodulatory biomaterials.</a> Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).</li><li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms.">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li><li>Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polymer+chemistry+and+fabrication+method+on+protein+release+and+stability+from+polyanhydride+microspheres.">Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).</li><li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release.">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li><li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+Protective+Single-Dose+Intranasal+Nanoparticle-Based+Vaccine+Platform+for+Respiratory+Infectious+Diseases.">Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases.</a> PLoS ONE. 6, e17642 (2011).</li><li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells.">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li><li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants.">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li><li>Torres, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyanhydride+microparticles+enhance+dendritic+cell+antigen+presentation+and+activation.">Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation.</a> Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).</li><li>Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+transport+pathogens+to+lung+draining+lymph+nodes.">Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes.</a> J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).</li><li>Barletta, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+compartments+in+the+mouse+lung:+Distinguishing+between+marginated,+interstitial,+and+alveolar+cells+in+response+to+injury.">Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury.</a> J. Immunol. Methods. , (2011).</li><li>Rubins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages:+wielding+the+double-edged+sword+of+inflammation.">Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).</li><li>Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Murine+Genetic+Predisposition+to+Pneumococcal+Infection+Reveals+a+Critical+Role+of+Alveolar+Macrophages+in+Maintaining+the+Sterility+of+the+Lower+Respiratory+Tract.">Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract.</a> Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).</li><li>Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+Macrophages+that+Phagocytose+Apoptotic+Neutrophils+Produce+Hepatocyte+Growth+Factor+during+Bacterial+Pneumonia+in+Mice.">Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres.">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles.">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li><li>Irvin, C. G., Bates, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+lung+function+in+the+mouse:+the+challenge+of+size.">Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size.</a> Respir. Res. 4, 4 (2003).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

単回投与レジメン5で鼻腔内に投与した場合、無水物ナノ粒子ワクチンのプラットフォームでは有効性を示している。このワクチン·デリバリー·プラットフォームによって誘発される肺内に常駐貪食細胞集団の活性化を測定することにより、最終的に適応免疫応答を促進するために、その潜在的能力の評価を可能にします。 具体的には、肺胞洗浄液から肺胞マク?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> CAMメディア </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15から013-CV </td><td></td></tr><tr><td>の50 mM 2 - メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン万μg/ mLのソリューション</td><td> Cellgro </td><td> 30から002-CI </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> FACSバッファー </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA（ウシ血清アルブミン） </td><td>シグマ</td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> 抗体 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラットIgG </td><td>シグマ</td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td>抗-MS CD16/32 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 16から0161 </td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗-MS MHC IIハプロタイプIA /​​ IE、クローンM5/114.15.2、 </td><td> eBioscience </td><td> 11から5321 </td><td></td></tr><tr><td>アロフィコシアニンにコンジュゲート抗マウスCD86、クローンGL-1、（APC）-Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> APCへの結合抗マウスCD40、クローン1C10、 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 17から0401 </td><td></td></tr><tr><td>ビオチン標識抗マウスCD209、クローン5H10、 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 13から2091 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor®700標識抗マウスCD11bを、クローンM1/70、 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 56から0112 </td><td></td></tr><tr><td>フィコエリスリンに結合した抗マウスF4/80、BM8クローン、（PE）-Cy7 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 25から4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-テキサスレッド結合ストレプトアビジン</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> 他の消耗品と試薬 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A405-20 </td><td> 70％（V / V）として使用</td></tr><tr><td>圧縮されたCO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mLのシリンジ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td>ソブリン3½ &quot;FRトムCatcatheter </td><td>ケンドール</td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td> NUAIRE </td><td>シリーズ22 </td><td></td></tr><tr><td>解剖用はさみ</td><td>フィッシャー</td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td>カルシウムとマグネシウムを含まないPBS、1X </td><td> Cellgro </td><td> 21から040-CM </td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップ付き15 mLの遠心チューブ</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td>プレート処理された6ウェル組織培養</td><td>共演者</td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチックチューブのラック</td><td>ナルゲン</td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー24センチメートル</td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5mLのポリスチレン丸底チューブ</td><td>ファルコン</td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイドXL </td><td>ドラモンド</td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10、5、および2 mLピペット</td><td>フィッシャー</td><td> 13から675 </td><td></td></tr><tr><td> 200と10μLmicropipettors </td><td>ギルソンピペットマン</td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200と10μLピペットチップ</td><td>フィッシャー</td><td> 02から707 </td><td></td></tr><tr><td>安定BD固定剤</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> ISOTON II希釈</td><td> Beckman-Coulter社</td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> ZAP-oglobin II溶菌試薬</td><td> Beckman-Coulter社</td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td>コー​​ルターカウンターポリスチレンバイアル</td><td> Beckman-Coulter社</td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td>試験管</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> 機器 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷凍遠心器</td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td>加湿インキュベーターCO 2 </td><td> Nuaire </td><td>モデルオートフロー8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCantoフローサイトメーター</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td>コー​​ルターパーティクルカウンタZ1 </td><td> Beckman-Coulter社</td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td>マイクロチップと超音波液体処理装置</td><td> Misonix </td><td>モデル番号S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

harvesting murine alveolar macrophages and evaluating cellular activation induced by polyanhydride nanoparticles

生分解性ナノ粒子は、呼吸器感染症に対する新規経鼻ワクチンの設計と実装のための汎用プラットフォームとして浮上している。具体的には、無水物は、脂肪族セバシン酸（SA）、芳香族1,6 -ビス（p-カルボキシフェノキシ）ヘキサン（CPH）、または両親媒性1,8 -ビス（p-カルボキシフェノキシ）-3,6 -ジオキサオクタンから成るナノ粒子（CPTEG）はin vivoで 3,4,5 で一意のバルクと表面浸食速度論1,2を表示し、徐々に機能的な生体分子（例えば、タンパク質抗原、免疫グロブリンなど）を解放するために悪用される可能性があります。これらは、それらのワクチン·デリバリー·プラットフォーム6,7,8のための優れた選択肢となり、本質的なアジュバント活性を有する、ナノ粒子。 鼻腔粘膜のワクチン接種後に自然免疫の活性化を支配するメカニズムを解明するために、1つは、抗原Pの分子や細胞の応答を評価する必要があります免疫応答を開始するための責任憤り細胞（APC）。樹状細胞は肺胞マクロファージは（AMɸ）肺実質9,10,11で一世を風靡しながら、気道を行うに見られる主なAPCのです。 AMɸ微生物病原体や細胞破片12,13の肺をクリアに非常に効率的です。さらに、この細胞型は、適応免疫応答9の開始に重要な最初のステップである所属リンパ節への微生物抗原の輸送に重要な役割を果たしています。 AMɸまた、生得的なパターン認識とスカベンジャー受容体、分泌炎症誘発性メディエーター、及び主要なナイーブT細胞12,14の上昇を表現しています。 AMɸ（例えば、80％以上）の比較的純粋な人口は容易に実験室での研究のために肺洗浄を介して取得することができます。 AMɸ免疫有能な動物から採取した居住者はencounteれマクロファージの代表的な表現型を提供するin vivoでの rは粒子ベースのワクチン。ここで、我々は、マウスからの収穫と文化AMɸに使用されるプロトコルを記述し、in vitroでの無水物ナノ粒子を用いた治療後にマクロファージの活性化の表現型を調べます。

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

ここで、我々は、肺に先天性免疫細胞を常駐し、無水物ナノ粒子との共培養に応答して活性化を検討しているマウスの肺胞マクロファージを採取するためのプロトコルについて説明します。

マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

harvesting-murine-alveolar-macrophages-evaluating-cellular-activation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.7K ビュー.  Iowa State University. ここで、我々は、肺に先天性免疫細胞を常駐し、無水物ナノ粒子との共培養に応答して活性化を検討しているマウスの肺胞マクロファージを採取するためのプロトコルについて説明します。

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

生物工学

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

無水物ナノ粒子のハイスループット糖鎖の合成と機能化

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

マトリックス修飾により誘導される細胞接着及び脱接着におけるリアルタイムの変化を測定するために、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea (ureolysis) in naturally occurring environments through secretion of an enzyme urease. This process of ureolysis, through a chain of chemical reactions, leads to the formation of calcium carbonate precipitates. This is known as Microbiologically Induced Calcite Precipitation (MICP). The proper culture protocols for MICP are detailed here. Finally, visualization experiments under different modes of microscopy were performed to understand various aspects of the precipitation process. Techniques like optical microscopy, Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-Ray Photo-electron Spectroscopy (XPS)&#160;were employed to chemically characterize the end-product. Further, the ability of these precipitates to clog pores inside a natural porous medium was demonstrated through a qualitative experiment where sponge bars were used to mimic a pore-network with a range of length scales. A sponge bar dipped in the culture medium containing the bacterial cells hardens due to the clogging of its pores resulting from the continuous process of chemical precipitation. This hardened sponge bar exhibits superior strength when compared to a control sponge bar which becomes compressed and squeezed under the action of an applied external load, while the hardened bar is able to support the same weight with little deformation.

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

微生物学的に誘導された方解石沈殿がによって媒介されます<em&gt;スポロサルシナパステウリイ</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

液体中のパルスレーザアブレーションによる金属ナノ粒子の生成：ナノ粒子の抗菌特性を調べるためのツール

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

植物活性酸素種体内はアニオン性セリウム酸化物ナノ粒子の触媒の清掃

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...