This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).

1.一般内皮細胞の培養<ol><li>培養ウシ大動脈内皮細胞をゼラチンコーティングした組織培養フラスコに（継代4-9）（コート組織培養表面15分間室温でPBS中/ vのゼラチン0.1重量％の）EGM-2弾丸とのEGM-2培地中で（ 5％ウシ胎児血清、成長因子およびヒドロコルチゾンを除いて、製造業者によって提供されるすべてのサプリメント）を含むキット。 </li><li>細胞（1後約3日後に播種：4分割）、ほぼコンフルエントである場合、重量/体積トリプシン0.05％/ 37℃でのPBS中のEDTA w / vの0.02％での処理によって収穫細胞。細胞の大部分が分離した後、トリプシン、その後遠心分離（100×gで、5分）を急冷し、完全EGM-2メディアを追加。 </li><li>そして、この基板上に確立された密着性（実験2：第3節）と内皮細胞のその後の脱接着：フィブロネクチンへの内皮細胞のデノボ密着性（第2節実験1）の研究のために細胞を準備します。 <ol><li>洗って収穫一度/ vのウシ血清アルブミン（BSA）および再遠心分離（100×gで、5分間）を1％wを含有する無血清199培地での細胞。 </li><li>再懸 ​​濁（生細胞イメージング分析）2.5×10 5細胞/ ml（細胞-基質インピーダンス測定）または5×10 5細胞/ mlで、1％のw / vのBSAを含有する無血清199培地中で細胞を37に維持する使用前°C。 注：細胞の接着応答がそのように、以下のプロトコルの間に細胞を処理し、治療するために使用されるすべての機器との溶液を37℃の一定温度に保たれるべきである（対流効果によるなど ）の温度差に非常に敏感である。 </li></ol></li></ol> 2.実験1：ネイティブおよびMPO酸化フィブロネクチン（細胞-基質インピーダンス）で定量化·デ·ノボ内皮細胞接着注：実験1は、フィブロネクチンのMPO媒介酸化デノボをサポートする能力を損なう程度を調べ</em&gt;一時停止内皮細胞の接着。 <ol><li> 96ウェル金細胞 - 基質インピーダンス微小電極アレイ上にコートフィブロネクチン。 PBS中5μg/ mlで80μL/ウェルの精製したウシのフィブロネクチンを追加し、37℃で2時間インキュベートし、溶液を除去する。 </li><li>表面に結合したフィブロネクチンへMPOの結合を可能にするためにMPOとのフィブロネクチンでコーティングされた表面をインキュベートする。 80μL/ウェルのハンクス平衡塩溶液（HBSS）で20 nmで精製されたヒト好中球MPOを追加し、37℃で0.5時間インキュベートする。 </li><li>ウォッシュは、未結合のMPOを削除するには、HBSSで二回表面。 </li><li>開始するために、80 /ウェルHBSSを含む微小電極アレイプレートのウェルにH 2 O 2（0〜10μMの最終濃度）を加えるHOClの依存性フィブロネクチン酸化、MPOの触媒による、37℃でさらに0.5時間インキュベートする。 </li><li> MPO触媒反応（ 例えば 、代替のMPO酵素の関連阻害剤またはモジュレーターの効果を調べるため基質、酵素阻害剤または抗酸化剤; ）詳細については9を参照してください、H 2 O 2添加の直前にHBSSにこれらを追加します。 </li><li> 0.5時間後、残留表面結合酸化種をクエンチするメチオニンで表面を処理する。交絡細胞活性を発揮することができるすなわち 、反応性タンパク質結合クロラミン、。ウェルあたり80μlのHBSS中の10mMメチオニンを追加し、37℃で10分間インキュベートする。 </li><li>ブロックは、BSAで表面。 37℃で2時間インキュベートし、溶液を除去、0.2％BSAの80 /ウェルを追加W / V PBSに。 注：残留コーティングされていない表面領域は、細胞接着を支持し、非接着性タンパク質、これらを遮断する（ すなわち 、BSA）は、細胞接着応答が厳密にこの場合のフィブロネクチンに用いる精製された細胞接着性マトリックスに依存することを保証する。 </li><li>ウォッシュをHBSSで二回表面。 注：上記の表面処理はいずれもかなり細胞 - 基質の読影に影響を与えないGS。 </li><li>種子懸濁内皮細胞は、（追加200μl/ウェルで、約2.5×10 5細胞/ mlで、血清を含まない199培地を含む1％BSAで調製し、1.3を参照のこと）、天然またはMPO酸化フィブロネクチンでコーティングされた表面上に。 </li><li>すぐに細胞を播種した後（ すなわち 、前のいずれかの細胞接着および拡散する）、（5％CO 2存在下、37℃のインキュベーター内に収容された）インキュベーターポート上に微小電極アレイ板を取り付ける。 <ol><li>機器のソフトウェアを使用すると、すぐに細胞接着の非存在下で得られた初期バックグラウンド値に続く細胞 - 基質インピーダンス（「セル·インデックス &#39;）の値を正規化するために読んで「空白」を取る。 </li><li>連続細胞インデックスデータ（1セル·インデックス·読み取り/分以上）の取得を開始します。 </li></ol></li><li> 2時間後、最大の細胞接着および拡散が達成される期間のためにCO 2、37℃で、5％の細胞をインキュベートする。これにより反射され細胞指数値のプラトー（ 図3A参照 ）。 注：上記の実験（実験1）は、フィブロネクチンの最初のMPO媒介酸化は、この基板上に細胞接着を確立する内皮細胞の能力を制限する方法を調べる。以下の実験（実験2）MPO媒介フィブロネクチン酸化は、この基板上に確立された接着性を有する内皮細胞における細胞-マトリックス接着（ すなわち 、脱接着性）の減少を促進する方法を調べる。これら二つの実験において処置はMPO媒介フィブロネクチン酸化のタイミングを除いて、本質的に同一である（細胞接着の前に、すなわち 、 -実験1;細胞接着後-実験2）。 </li></ol> 3.実験2：MPO媒介フィブロネクチン酸化（細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージング）に応じて、フィブロネクチンから内皮細胞脱接着の定量化<ol><li> 96ウェルの金微小電極aの上にコートフィブロネクチン生細胞イメージングの分析のための細胞 - 基質インピーダンス測定（PBS中5μg/ mlで80 /ウェルフィブロネクチンを追加し、37℃で2時間インキュベート）または35mmのガラス底の細胞培養皿用rrays（2 mlで加える/ PBS中5μg/ mlのフィブロネクチンの皿を37℃で2時間インキュベート）。 </li><li>ブロックは、BSAで表面。 3.1に示されている音量で、PBS中w / vの0.2％BSAを追加し、37℃で2時間インキュベート。 </li><li>フィブロネクチンへMPOの結合を可能にするためにMPOで表面をインキュベートします。 3.1に示されている音量でHBSS中に20 nMの精製したヒトMPOを追加し、37℃で0.5時間インキュベートする。 </li><li>ウォッシュは、未結合のMPOを削除するには、HBSSで二回表面。 </li><li>天然またはMPO担持フィブロネクチンでコーティングされた表面上に、シードは、内皮細胞（1.3を参照BSA w / vの1％を含有する無血清199培地中で調製）を懸濁させた。 <ol><li> 96ウェル細胞-基質インピーダンス微小電極アレイに2.5×10 5細胞/ mlで200μl/ウェルを追加。 </li> &lt;李は&gt;細胞培養ディッシュ底35ミリメートルガラスに5×10 5細胞/ mlで2ミリリットル/皿を追加します。 </li></ol></li><li>すぐに細胞を播種した後（ すなわち 、事前のすべての細胞接着へと拡散）： <ol><li> （5％CO 2存在下、37℃のインキュベーター内に収容された）細胞-基質インピーダンスインキュベーターポート上にマウントし、96ウェルの微小電極アレイプレートおよびセル·インデックス·データの連続的な取得を開始するために「ブランク」読み取りを行う（参照、2.10 ）。 </li><li>転送35mmのガラスを、5％CO 2存在下、37℃のインキュベーターに細胞培養皿底。 </li></ol></li><li>最大の細胞接着および拡散（参照：セクション2.11）を可能にするために2時間、37℃で細胞をインキュベート。 </li><li>簡単に述べると、96ウェルマイクロ電極アレイ板（この時点で休止細胞指数読み取り値）を削除するか、または35mmのガラスを37℃のインキュベーターから細胞培養皿の底、細胞上清を除去およびpとして温めた（37℃）HBSS（ボリュームを追加ERのステップ3.1）。 注：後者は酸化反応を妨害する酸化可能な種を含むように代わりに完全な培地のMPO触媒による酸化反応を研究する際にHBSSを使用する。 </li><li> MPO触媒反応（代替酵素基質、酵素阻害剤または抗酸化剤）または細胞シグナル伝達阻害剤（ 例えば 、アクトミオシン収縮性を阻害する40μMのブレビスタチン）の阻害剤/モジュレーターの効果を調べるために、今、これらを追加します。 </li><li>すぐに37℃のインキュベーターポートに微小電極アレイプレートを配置する（この時点で再開始する細胞指数読み取り値）、または35mmのガラスはバックを37℃のインキュベーター内に細胞培養皿の底、及び細胞がで平衡化させる0.5時間HBSS。 注：HBSSで0.5時間の平衡化の後、セルインデックス値はわずかに低い値で安定する。酵素基質、酵素および細胞シグナル伝達阻害剤または抗酸化剤を用いて細胞をプレインキュベートするとき、最初にそのトンを確保するHESE大幅に平衡後に得られた値に影響を与えません。 </li><li> MPOが触媒する、のHOCl依存フィブロネクチン酸化と脱接着を開始します。 <ol><li> 96ウエル微小電極アレイプレートを用いた細胞のインピーダンス試験のために： <ol><li>インキュベーターから微小電極アレイプレートを取り外し、セル·インデックス·測定を一時停止する。 </li><li> HBSSにH 2 O 2（0〜10μMの最終濃度）を加え、穏やかに繰り返しピペッティングにより混合します。 </li><li>直ちに、背面37℃インキュベーターポート上に微小電極アレイを再マウントし、細胞指数測定値の取得を再度開始する。 </li></ol></li><li> 35mmのガラスを用いて生細胞イメージング研究のための細胞培養皿の底。 <ol><li>インキュベーターから培養皿を取り出し、生細胞ムービーを記録するのに適しDIC光学系と63X水の対物レンズを備えた倒立型共焦点顕微鏡の37℃で加熱されたステージにマウントします。 </li><li>細胞に焦点を当て、DIC光学系（;詳細については、13を参照してくださいケーラー照明、バイアス遅滞とカメラオフセット/ゲイン）を最適化する。 </li><li> DICムービーを開始し、1分間の未処理細胞のベースライン測定値を記録します。 </li><li> H 2 O 2（0〜10μMの最終濃度）を加え、穏やかに繰り返しピペッティングにより混合します。顕微鏡を再フォーカス（必要な場合）、必要な時間だけ処理した細胞のDICの動画を撮影し続ける。 </li></ol></li></ol></li></ol> 4.データ分析とプレゼンテーション<ol><li>細胞 - 基質インピーダンスデータ<ol><li>スプレッドシートにエクスポートし、生​​データ（セルインデックス対時間）。 </li><li>細胞の脱接着試験（実験2：セクション3）については、（ すなわち 、直ちに3.11でH 2 O 2を添加する前に、前の1の値でMPO媒介フィブロネクチン酸化の開始にすぐに記録された値を設定することによってデータを正規化する.1.1）。 注：これは相対的なことが保証さMPO媒介フィブロネクチン酸化により誘発される細胞指数値の変化は、ウェル間の絶対的な細胞指数値の小さい初期差異によってマスクされていない。 <ol><li>時間（x軸）に対する正規化された細胞指数（y軸）のプロットとして存在するデータ。 </li></ol></li></ol></li><li>細胞イメージングデータ（細胞脱接着試験は、実験2：セクション3）生きる<ol><li> DICの直前に、標準的画像解析プログラム（ 例えば、ImageJソフトウェア）でMPO媒介フィブロネクチン酸化の開始後に記録細胞イメージング映画を生きる開きます。 </li><li>少なくとも2つの別個のDIC·ムービー、ランダムに複数のセルを選択し、手動でそれらの膜のエッジをトレースし、囲まれたピクセルの数を定量化することによって連続フレーム（ 例えば、1分間隔で）での投影面積を測定します。 </li><li> Excelスプレッドシートにエクスポートし、生​​データ（時間に対する投影細胞面積）とすぐに記録された値を設定することによりセル面積のデータを正規化する前1の値でのMPO媒介フィブロネクチン酸化の開始（ すなわち 、直ちに3.11.2.3におけるH 2 O 2の添加前）。 </li><li>時間（x軸）に対する正規化されたセル面積（y軸）のプロットとして存在するデータ。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+focal+adhesions+and+barrier+function.">Endothelial focal adhesions and barrier function.</a> J Physiol. 569, 359-366 (2005).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).</li><li>Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+extracellular+matrix+and+its+role+in+human+pathologies.">Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies.</a> Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).</li><li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix:+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer.">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).</li><li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+transcytosis+of+myeloperoxidase+confers+specificity+to+vascular+ECM+proteins+as+targets+of+tyrosine+nitration.">Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration.</a> J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).</li><li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+pulmonary+and+vascular+nitrotyrosine+reveals+the+pivotal+role+of+myeloperoxidase+as+a+catalyst+for+tyrosine+nitration+in+inflammatory+diseases.">Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases.</a> Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).</li><li>Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+control+of+endothelial+function+and+dysfunction:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).</li><li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-derived+oxidants+selectively+disrupt+the+protein+core+of+the+heparan+sulfate+proteoglycan+perlecan.">Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan.</a> Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).</li><li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+subendothelial+matrix+oxidation+by+myeloperoxidase+triggers+myosin+II-dependent+de-adhesion+and+alters+signaling+in+endothelial+cells.">Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells.</a> Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).</li><li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+(RT-CES)+technology+to+cell-based+assays.">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically.">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).</li><li>Vissers, M. C., Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypochlorous+acid+disrupts+the+adhesive+properties+of+subendothelial+matrix.">Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix.</a> Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).</li><li>Ziv, N. E., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Interference+Contrast+(DIC)+Imaging+of+Living+Cells.">Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Kennett, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxynitrite+modifies+the+structure+and+function+of+the+extracellular+matrix+proteoglycan+perlecan+by+reaction+with+both+the+protein+core+and+the+heparan+sulfate+chains.">Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains.</a> Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).</li><li>Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+dominates+adhesive+ligand+density+in+regulating+cellular+de-adhesion+and+retraction+kinetics.">Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics.</a> Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).</li><li>Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+subcellular+release+for+studying+the+dynamics+of+cell+detachment.">Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment.</a> Nat Methods. 6, 211-213 (2009).</li></ol>

著者は、作るの開示全くない。

細胞 - マトリックス接着及び脱接着プロセスは、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージング解析を用いて高時間分解能でリアルタイムで正確に定量することができる。これらのリアルタイムのアプローチは悪い時間分解能を提供し、細胞接着のエンドポイント分析を、上の大きな利点を提供する。正確に高い時間分解能で迅速な脱接着応答を定量化することによって、これらの分析は?...

細胞とその周囲の細胞外マトリックスとの間の安定した接着剤の接点は、組織恒常性の維持のために必要とされる。例えば、血管の内皮下マトリックスの内皮細胞接着は、内皮層および規制、半透過性、血管障壁1としての恒常性維持機能の完全性を維持する上で重要な役割を果たしている。アクチン細胞骨格は、機械的に中央に指向アクトミオシンの引張力に抵抗することにより、細胞膜の位置を決定する際に重要な役割を果たす細胞 - マトリックス界面での細胞 - マトリックス接着と接着接触する部位におけるマトリックス分子を接着するように結合される。必ずしも細胞 - マトリックス界面における力のバランスを変化させる細胞 - マトリックス接着を改変細胞外刺激、急速にあるイベントは「アウトサイドインシグナル伝達」の形質導入をもたらし、機械刺激感受性シグナル伝達タンパク質によって「感知」。このクロストーク賭け予期する細胞とその周囲の細胞外マトリックスは、細胞の形状、運動性、機能、増殖及び生存2の制御において重要な役割を果たしている。 多様な病態生理学的プロセス（胚発生、炎症、創傷修復および癌転移）は、マトリックス分解酸化剤および/ ​​または酵素3,4により接着剤マトリクス基板のダイナミックリモデリングによって特徴付けられる。例えば、血管の内皮下マトリックスタンパク質を接着剤（ 例えば 、フィブロネクチン）は、反応性酸化剤の局部的な生産にヒト炎症性疾患における修飾または分解のための主要な標的として示唆されている（ 例えば 、次亜塩素酸HOClの）白血球由来酵素による炎症性血管疾患（ 図1）5-9の間、内皮下層内に蓄積ミエロ（MPO）、。 MPO由来の酸化剤および他のマトリックス修飾刺激によって誘導される細胞 - マトリックス接着の変化は、リクある今度は内皮機能とバリアの完全性を乱し、内皮細胞のシグナル伝達、形態学および生存を変化させることによって、 例えば 、エリーは、病理学的プロセスの様々な時に血管の恒常性を変化させることにおいて重要な役割を果たしている。しかし、細胞外マトリックスの修正に接着した細胞の形態学的および細胞シグナル伝達応答は、理解され始めている。 マトリックスの修飾は、細胞接着のダイナミクスと接着依存性の細胞シグナル伝達経路の変化を駆動する方法を理解するために、この技術は、正確に、高い時間分解能で、リアルタイムで細胞 - マトリックス接着の変化を定量化することが必要である。ここでは、相補的な細胞 - 基質インピーダンスと、これらの基準を満たし、非侵襲的な方法で細胞接着及び脱接着過程を定量化するためのプラットフォームを提供し、生細胞イメージング技術を記述する。 私たちはどのようにこれらの細胞 - 基質インピーダンスとライブセルイメージングアプロ示し痛みは、容易には、（i）天然の及び変性マトリクス基板上に細胞接着および拡散（ すなわち 、 デノボ細胞接着）の動態をモニターし、（ii）細胞-マトリックス剥離のダイナミクスを測定するために（ すなわち 、脱接着に用いることができる）マトリックス修飾刺激にさらさ接着細胞による。 xCELLigence細胞 - 基質インピーダンスバイオセンサシステムは、96ウェルの金微小電極アレイの表面における電気インピーダンスを定量することにより細胞 - マトリックス接触の面積の連続的な測定を提供し、「セルインデックス &#39;、無次元の値としてこれらの電気インピーダンスの測定値を表すまた（絶縁）細胞膜と電極表面11との間の平均距離の変化に敏感である一方、細胞-基板コンタクト10（ 図2）の面積に大きく比例する。細胞指数値のさらなる増加はまた、タイト、細胞 - 細胞接触の股関節形成時に達成される。tが、本研究に記載された実験の中勝訴しない11の条件を傍細胞電流が流れを制限する。経時微分干渉コントラスト（DIC）映画の画像解析による経時的な個々の細胞の投影面積の測定は、細胞 - 基質の接触面積の変化の相補的な尺度を提供するとの正確な性質および力学に関する追加情報を提供する細胞 - 基質インピーダンス法によって定量化し、形態学的変化。 具体的には、接着剤、内皮下のマトリックスタンパク質のMPO媒介酸化（ 例えば 、フィブロネクチン）（i）は、精製フィブロネクチンに懸濁した内皮細胞のデノボ癒着を減少させ、（ii）細胞-マトリックスドをトリガする方法を監視するため、これらのアプローチの適用を説明するフィブロネクチン上で確立された接着性を有する内皮細胞における-adhesion。関連BIOCHEMを用いて経時的に分析シグナル並列セルを行うことによりiCalのアッセイ（ 例えば 、ウエスタンブロット法）、接着依存性細胞シグナル伝達事象における接着/脱接着プロセスと関連した変化の間の時間的かつ因果関係を決定することができる。 これらのアプローチは、最近MPOの内皮下の堆積物によって触媒される細胞外マトリックスの酸化は、既存のアクトミオシン収縮力9によって駆動される内皮細胞の細胞-マトリックス接着の急速な減少を誘発することを実証するために使用した。重要なことは、両方の細胞接着の変化と決定されるシグナリング接着依存性細胞との間の時間的関係を可能にすることによって、これらのアプローチは、MPO誘発性マトリックス修飾および細胞の脱接着はSrcキナーゼなどの重要な接着依存性の細胞シグナル伝達経路の変化をトリガすることを同定し依存性パキシリンのリン酸化およびミオシン軽鎖IIリン（ 図1）9。レドックス依存性シグナル、INVのこのモード細胞-マトリックス接着を破壊する細胞外の酸化反応によって、細胞内シグナル伝達事象の活性化をolving、（ 図1）9 &quot;外で酸化還元シグナル伝達」と呼ばれる細胞シグナル伝達の新規のモードを示す。 一般に、これらの補完的な細胞 - 基質インピーダンスバイオセンサーと生細胞イメージングのアプローチは、マトリックス修飾刺激または薬剤は、多種多様な対象の異なる付着細胞型内の細胞接着のダイナミクスの変化、形態学およびシグナル伝達を駆動する方法の異なる明らかに価値があるはず実験的な設定を行います。 以下のプロトコルは、デノボ内皮細胞接着（ 実験1）および内皮細胞脱接着（ 実験2）プロセス上のMPO媒介マトリックス酸化の影響を定量化する方法について説明します。 MPOは、フィブロネクチンおよび他の接着内皮下の細胞外マトリックスタンパク質に貪欲に結合し、私達塩化物イオン（のCl - ）を変換するエス過酸化水素（H 2 O 2）、これらのマトリックスタンパク質を局所的に反応し、その細胞接着性（ 図1）8,9 を破壊する反応性の高い塩素化酸化剤、次亜塩素酸（HOClの） に12。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1328">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:551px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">E-Plate 96</td>
			<td>single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">blebbistatin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">B0560</td>
			<td>selective inhibitor of non-muscle myosin-II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">BW-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">05470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGM-2 BulletKit</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">CC-3162</td>
			<td>endothelial cell growth media kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fibronectin, lyophilized powder</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">F-4759</td>
			<td>from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish</td>
			<td style="width:223px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:151px;">FD35-100</td>
			<td>Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Gelatin from bovine skin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G9391</td>
			<td>cell culture substratum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:223px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">107298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Medium-199</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">11150-059</td>
			<td>serum-free cell media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Methionine</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M9500</td>
			<td>quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes</td>
			<td style="width:223px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">475911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">-</td>
			<td>Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using cell-substrate impedance and live cell imaging to measure real-time changes in cellular adhesion and de-adhesion induced by matrix modification

細胞 - マトリックス接着細胞の形態を制御し、シグナル伝達において重要な役割を果たしている。細胞-マトリックス接着性（ 例えば 、ミエロペルオキシダーゼおよび他のマトリックス修飾酸化剤/炎症の間に放出される酵素）を崩壊させる刺激が多くの疾患において細胞機能、表現型と生存率の病理学的変化をトリガに関与している。ここでは、（病態生理学的マトリックス修飾刺激として内皮細胞およびミエロペルオキシダーゼを用いて）、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングのアプローチを容易に正確に細胞接着およびマトリックス修飾により誘導される脱接着におけるリアルタイムの変化を定量化するために使用することができる方法について説明高い時間分解能でかつ非侵襲的な方法で。 xCELLigence細胞 - 基質インピーダンスシステムは、連続的に金微小電極アレイ上で増殖させた細胞における細胞 - 基板界面での電気インピーダンスを測定することにより細胞 - マトリックス接着面積を定量化する。タイムラプスdifferenの画像解析TiAlの干渉コントラストムービー細胞 - マトリックスの接触面積の変化を示す、経時的な個々の細胞の投影面積の変化を定量化する。両方の技術を正確に細胞接着と脱接着プロセスへの急速な変化を定量化する。微小バイオセンサアレイ上の細胞 - 基質インピーダンスは、堅牢、ハイスループット測定のためのプラットフォームを提供する。生細胞イメージングは​​、細胞 - 基質インピーダンス測定によって定量化の形態学的変化の性質および力学に関するさらなる詳細を提供する分析。これらの補完的なアプローチは細胞内、細胞外マトリックス成分のミエロ触媒による酸化修飾は、細胞接着の急激な変化をトリガし、形態および内皮細胞におけるシグナル伝達方法に貴重な新しい洞察を提​​供する。これらのアプローチはまた、他のマトリックス修飾刺激に応答し、関連接着細胞（ 例えば、上皮細胞）における細胞接着のダイナミクスを研究するために適用可能である。

MPO媒介フィブロネクチン酸化（実験2）に応答して、フィブロネクチンからの内皮細胞の脱接着のリアルタイム定量化内皮細胞懸濁液を播種最大の細胞付着におけるネイティブ（MPOフリー）フィブロネクチンまたはMPO含有フィブロネクチン結果へと拡散2時間以内に、セル基板のインピーダンス測定（ 図3A）における細胞指数値のプラトーによって判断される。 MPO媒?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification at JoVE.

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

ここでは、連続的に細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージング分析により、非侵襲的に高い時間分解能での細胞接着及び脱接着プロセスを定量化するためのプロトコルを提示する。これらのアプローチは、マトリックス修飾および接着依存性のシグナル伝達事象に対する時間的関係によって誘発される細胞接着/脱接着プロセスのダイナミクスを明らかにした。

マトリックス修飾により誘導される細胞接着及び脱接着におけるリアルタイムの変化を測定するために、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

using-cell-substrate-impedance-live-cell-imaging-to-measure-real-time

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K ビュー.  University of New South Wales. ここでは、連続的に細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージング分析により、非侵襲的に高い時間分解能での細胞接着及び脱接着プロセスを定量化するためのプロトコルを提示する。これらのアプローチは、マトリックス修飾および接着依存性のシグナル伝達事象に対する時間的関係によって誘発される細胞接着/脱接着プロセスのダイナミクスを明?...

ビデオ: Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

三次元マトリックスの蛍光タグ付きタンパク質を発現する遊走細胞の生細胞イメージング

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

生物工学

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to investigate mechanisms governing cell adhesion under dynamic flow conditions. For instance, cancer cells labeled with multiple fluorophores can be perfused over a potentially reactive substrate to model mechanisms of cancer metastasis. However, multi-channel single camera systems and color cameras exhibit shortcomings in image acquisition for real-time live cell analysis. To overcome these limitations, we used a dual camera emission splitting system to simultaneously capture real-time image sequences of fluorescently labeled cells in the flow chamber. Dual camera emission splitting systems filter defined wavelength ranges into two monochrome CCD cameras, thereby simultaneously capturing two spatially identical but fluorophore-specific images. Subsequently, psuedocolored one-channel images are combined into a single real-time merged sequence that can reveal multiple target molecules on cells moving rapidly across a region of interest.

Dual camera emission splitting systems for two-color fluorescence microscopy generate real-time image sequences with exceptional optical and temporal resolution, a requirement of certain live cell assays including parallel plate flow chamber adhesion assays. When software is employed to merge images from simultaneously acquired emission channels, pseudocolored image sequences are produced.

同時にデュアルカメラエミッション分割システムを使用して、2つの発光チャンネルにリアルタイム画像のキャプチャ：アプリケーションは、接着性を細胞する

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

内皮増殖、バリアー機能、運動性の定量のための電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

ディープティシュ人間血管造影および機能前臨床研究のためのユニバーサルハンドヘルド三次元光音響イメージングプローブリアルタイムで

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

手持ちの臨床音響小動物の非侵襲的な実時間イメージングによる画像計測

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

世界的な細胞のマトリックスメタロプロテアーゼと 3 D ゲルの代謝活性を測定

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...