サポートは、ベクトン·ディッキンソンの技術によって提供されました。この申請において示された見解は著者のものであり、米国政府の公式方針を反映するように意図されません。研究は、動物福祉法と実験動物のケアと使用するためのガイド 、国家研究評議会、1996年に述べた原則に動物や付着を伴う動物実験に関連する他の連邦法および規制を遵守して実施されました。本研究が実施された施設は完全に実験動物ケア·インターナショナルの評価と認定協会の認定を受けています。

1。 NALTの収集と培養<ol><li>承認されたIACUCガイダンスを使用してマウスを安楽死させる。 NALTに影響を与える可能性吸入麻酔薬の使用は避けてください。無菌スペースまたは生物学的安全性キャビネットにマウスを転送します。マウスの下顎を外して、アルコールとヨウ素ワイプと上部口蓋エリアを清掃してください。 </li><li>慎重にマウス切歯と臼歯の内側の輪郭に従うことによって、上部口蓋を削減し、消費税にメスハンドルに11号​​手術ブレードを使用しています。 </li><li>口蓋を引き裂くないように注意しながらピンセットでそっと背中の皮口蓋、。 </li><li>このステップでは、文化の汚染を低減する必要があると、複数の味覚を処理するために設計されています。 10％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640、100μg/ mlのストレプトマイシン、100から成る完全培地（37℃）を250μLの滅菌48ウェルプレートにあらかじめ入力の最初の列の個々のウェルに配置する味覚UI / mLペニシリン、50μg/ mLのゲンタマイシン1μg/ mLのファンギゾン/アムホテリシン。メディアは、味覚を5％CO 2/95％湿度の高い空気インキュベーター（37℃）で培養し、あるいは非CO 2培養用の10 mM HEPES pH 7.4を使用している場合はバッファリングされ、炭酸でなければなりません。 </li><li>味覚を洗浄するために、口蓋は8回の洗浄の合計を受けているまで、慎重に、洗浄の間に板をタップ、行の連続した​​各ウェルに味覚を移動するために鉗子を使用しています。 </li><li>ウェル内の新鮮な完全培地（37℃）の250μLを含む新しい滅菌48ウェルプレートに味覚を転送します。 </li><li>研究の期間培養し、37℃のインキュベーターに味覚を含むプレートを配置します。 </li><li>無菌的に新鮮な37°Cの培養液100μLで置き換え、エッペンドルフチュー​​ブ、24時間ごとに培養ウェルから培地100μLを転送することによって分析のためのサンプルを収集します。 </li><li>ペレットの破片〜10分、4℃、380 xgで培地サンプルを遠心します。 </li><li>分析する準備ができるまで-20℃で新鮮なエッペンドルフチュー​​ブや店舗を遠心分離し、試料から上清を移します。 </li><li>抗原特異的IgG、IgMおよびIgAの、または分泌されるサイトカインは、標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって組織培養上清で測定されます。 </li></ol> 2。 NALTの外科的アブレーション<ol><li>雌性BALB / cマウス、年齢の7から9週では、適切な科目であるが、他の株も許容されます。ポスト操作投与される食料や水代わりにマウスを順応するのに三日、手術前にゲル状のウェットフードを提供しています。 </li><li>手術前に口腔内にメタカムの疼痛緩和薬（1.5 mg / mlまたはは0.05 mg /ドロップ）1滴を管理します。 </li><li>乾燥を防ぐために、ケタミン、アセプロマジン、およびキシラジンの混合物（KAX）とは、例えば、承認されたIACUCのガイダンスを使用してマウスを麻酔し、眼にPuralube獣医軟膏を適用します。 NALTに影響を与える可能性吸入麻酔薬の使用は避けてください。 Anesthesiaは、つま先の穏やかなピンチに反射反応の有無によって確認することができます。 </li><li>皮下手術後のマウスの潜在的な脱水を防ぐために22から28ゲージの注射針とシリンジを用いて肩甲骨の間1 mLの生理食塩水（0.9％塩化ナトリウム注射USP）を管理することができます。また、手術中と後に健康な呼吸を促進するために22から28ゲージの注射針とシリンジを用いて肩甲骨の間に皮下Respiramの0.1 mLを管理することができます。 </li><li>後続のすべての操作中にマウスに熱サポートを提供しています。 </li><li>仰臥位で麻酔にマウスを置き、ゆっくりと口をこじ開けるように上限と下限歯の周囲に縫合糸の2つの別々のループを使用して、上部の口蓋を公開しています。 </li><li> NALTのサイトの上部口蓋の正中線の下の長さの切開が約3ミリメートルを作るために11番手術ブレードを使用しています。 </li><li>切開に0.5 mmのmicrocuretteを差し込んで、静かに縁の下に落とすNALTを混乱させる。 </li><li>熱焼灼装置のストレート細かいループを使って出血を止めるために切開を焼灼する。 </li><li>マウスが完全な意識と活動に復帰しながら熱のサポートを続行します。 </li><li> 3日後の手術のために一日に一回必要と経口鎮痛剤として脱水を防ぐために、皮下まで一日三回、肩甲骨の間の注入あたり1 mLの生理食塩水でマウスを提供しています。皮膚の膨圧をチェックするために皮膚テントテストを実行することにより脱水を決定します。それがつながったケースまでされるように、肩甲骨の間に皮膚や毛をつかみます。皮膚はすぐに正常、前の位置に返した場合、マウスは脱水ではありません。皮膚が上昇したまま、ゆっくりと移動した場合、マウスは脱水の状態であり、生理食塩水が必要になります。回復のための十分な時間を可能にするために、手術後少なくとも3日間ウェットフードを提供しています。 </li><li>すべての実験手順の前に、体重増加を追跡することによって、8月10日日間マウスを観察します。貧しい重量の回復通常不完全口蓋治癒を示し、これらのマウスは、さらなる研究から撤退しなければなりません。 </li></ol> 3。組織学のためにNALTを準備し、NALT手術の成功を評価する<ol><li>後述するようにNALT手術の成功は、組織によって確認する必要があります。すべての実験的研究を完了した後、承認されたIACUCガイダンスを使用して安楽死で、頭蓋のコレクションのためにマウスを準備します。 NALTに影響を与える可能性吸入麻酔薬の使用は避けてください。 </li><li>安楽死させたマウスの首筋をつかみます。両側にハサミで下顎頭プロセスを経てsnippingによって頭蓋骨の残りの部分から下顎骨を削除します。 </li><li>うなじから始まり、徐々に剥離し、頭蓋骨の腹側に向かってカットして頭蓋骨から、皮膚や毛皮を削除します。 </li><li>慎重に鼻の領域の周りの皮膚を除去し、完全に削除するには、鼻の先端から皮膚を切り取る。 </li><li>脊椎ウィットから頭蓋を切り離すはさみのHAスニップ。 </li><li>大後頭孔にハサミを挿入し、固定時の軟組織にホルマリンの浸透を可能にするために正中線に沿って頭蓋骨の下半分カット。 </li><li>室温で24時間（NBF）緩衝ホルマリン、10％中性に頭蓋を固定します。 </li><li>石灰を除去するためには、ギ酸混合物と瓶の中に、骨に触れてからRexynを防ぐためにガーゼに包まれた、サンプル、別のカセットを配置します。室温で12時間インキュベートし、その後約20分間、水道水の下に連続的に洗い流してください。 </li><li>かみそりの刃を持つ隔壁と過去の目の軌道にサンプルをトリミングします。 </li><li>サンプルおよびカセットを10％NBFの短期保存できます。 </li><li>一晩処理のための組織·プロセッサにサンプルを置きます。これは、パラフィン包埋の準備のために、試料から水分を除去するために行われます。 </li><li>ダウン鼻のパラフィンブロックに埋め込む処理組織を削除し、それを冷却することができます。 </li><li>トリムR自動化されたミクロトームを持つブロックのウワーッ15μmの断面は、NALTのおおよその位置に近づくと、44.3℃の水浴中でガラススライド上にマウントするための5μmの切片に切断し続けています。 </li><li>ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）組織染色は、NALTアブレーションを評価するために使用されるべきである。 </li></ol> 4。マウス由来の生体試料の収集 4.1血清<ol><li>慎重にヒートランプで体温を上昇させると、血流が増加します。手術ブレードを横尾静脈をニッキングにより血液を収集します。血液がMicrotainer血清セパレータチューブに自由に滴下することができます。 </li><li>血流を停止するには、そのようなガーゼやタオルなどの吸収性材料とのニックネームに穏やかな圧力を適用します。 </li><li> 30分間Microtainersで血液凝固を可能にし、少なくとも90秒間、6月15日×1,000 gの間遠心します。 </li><li>のためのクリーンなエッペンドルフチュー​​ブにMicrotainerからの血清に分離譲渡ストレージ-80℃ </li></ol> 4.2唾液<ol><li>頬と歯茎の線の間に緩衝生理食塩水（PBS）20から30μL滅菌リン酸をピペッティングしながら垂直に麻酔マウスを保持します。頬と歯茎の間にピペットチップを向けることによって、希釈唾液を収集します。 </li><li> -20℃で2倍のプロテアーゼ阻害剤とストアの10μLを含む新しいチューブに希釈した唾液を転送</li></ol> 4.3鼻汁<ol><li>承認されたIACUCガイダンスを使用して、鼻の分泌物を収集する前に、マウスを安楽死させる。 NALTに影響を与える可能性吸入麻酔薬の使用は避けてください。 </li><li>垂直方向にマウスを持って、慎重に鼻孔に滅菌したPBSの30μLをピペットで収集他の鼻孔からすすいでください。 </li><li> -20℃で2倍のプロテアーゼ阻害剤とストアの10μLを含む新しいチューブにリンス転送</li></ol> 4.4膣分泌物<ol><li>番目の開口部に、マイクロピペットの先端を挿入します。安楽死させたマウスのe外陰部は、滅菌したPBSを50μLと膣を洗浄し、マイクロピペットですべての流体を収集します。 </li><li> -20℃で2倍のプロテアーゼ阻害剤とストアの10μLを含む新しいチューブにリンス転送</li></ol> 5。採取した試料中の抗原特異的抗体やサイトカインをELISA法または他の定量法によって測定することができる。 6。代表的な結果 図1は、ex vivoでの解析のための NALTを含む組織の処理に必要な手順の一般的な回路図を提供しています。 図2（A、B）では、口蓋のサイズは、点線で示され、アブレーション手術中に切開の場所（）と同様に、表示されます。 NALTの場所は、並列組織を示す図2の切り出し、ヘマトキシリン染色口蓋（C）、上の小臼歯領域の矢印で示されています。 図3上部のNALTにアクセスするための口蓋（A、B）、アブレーション（C）と、切開の最終的な焼灼（D）の露出を示す、NALT混乱手術の手順を示します。直接手術後microcuretteによってNALT混乱のイメージは、 図3Fに表示されている間に手術前にNALTを囲む副鼻腔領域の典型的なH＆E断面は、図3Eに示されています。手術から回復するための十分な時間ができるように、切開部を閉じる必要がありますし、NALT（ 図3G）の鼻腔欠いている。 これらの技術を用いて得られた典型的な実験結果は、ブドウ球菌サブユニットワクチン（STEBVax）の研究から組織培養上清と生物学的試料を比較すると、 図4に示されています。マウスは鼻腔（IN）または腹腔内（IP）経路によりSTEBVax投与した。ワクチンは、Toll様受容体4の経路3,1を活性化するアジュバントで策定された<html> 4、およびコントロールは、生理食塩水またはワクチンアジュバントなしで与えられた。実験群から得られた培養NALTには、ELISA法による測定だった培地中に抗原特異的免疫グロブリンを分泌する。この例では（ 図4A）、結果はIgAの最大量は、アジュバントと組み合わせたサブユニットワクチンとではワクチン接種したマウスから得られたNALTによってリリースされたことを示しています。 コントロールやNALTフリーマウスから得られた生体試料（例えば、血清、唾液、鼻汁、膣分泌液など）は組織培養の結果との比較のために鼻の抗原に対する生体の免疫応答内のプロファイルに使用することができます。 図4Bに、予防接種INへのIgAおよびIgG応答が大幅に機能NALTずに減少した。抗原特異的IgAのレベルは、ワクチン接種したマウスの粘膜の分泌物（唾液、鼻洗浄）中のIgGよりも一般的に大きかった。 upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。NALTの収集およびex vivoでの培養の模式図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> 図2。NALTおよび手術切開の位置を示すマウス口蓋の可視化。点線（）で表される手術切開と上部口蓋のサイズと位置、口蓋の前方側（口蓋の小臼歯領域で染色された濃い紫色を並列NALTを表示するには、上部の切り出し、口蓋（B）またはヘマトキシリン​​で染色し（C） 。） NALTは矢印で示された。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> 図3手術NALTの中断。 NALT混乱手術の主要な段階：手術前にマウスの上部口蓋の仰臥位ビュー（）; NALT（B）にアクセスするために、上部口蓋に行わ正中切開。でNALT構造を破壊するために正中切開を通して挿入microcuretteプローブtegrity（C）、手術の終了時に切開の焼灼（D）。鼻腔の顕微鏡画像、H＆E染色、手術（E）の前に、手術直後（F）の後、および首尾よく癒され、NALTフリーマウス（G）。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> 図4培養NALT、唾液、鼻汁からワクチン特異的抗体は、ワクチン接種したマウスから採取した。 NALTフリーまたは正常対照マウスは、INまたはSTEBVaxとIP予防接種を受けていたし、生体試料を採取した。トリプリケートサンプルの抗体レベルをELISAを用いて測定した。 （A）NALTは、コントロールマウス（外科的に操作しない）から削除され、抗体応答を調べるために培養した。ワクチンを接種したマウスでは培養のワクチン特異的IgA応答はコントロール（スチューデントのt検定、p≤0.01、無アジュバントなしのワクチンに比べて）から統計的に異なっていた。 （B）NALTの混乱は、実質的に特異的な抗体応答を減少させ予防接種をINに。特定の抗体レベルの間に有意差が認められたNALTとNALT唾液IgGの結果（スチューデントのt検定、p≤0.05）を除くすべての比較のために+グループ（非手術またはコントロール手術）。

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	<li>Wiley, J. A., Tighe, M. P., Harmsen, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upper+respiratory+tract+resistance+to+influenza+infection+is+not+prevented+by+the+absence+of+either+nasal-associated+lymphoid+tissue+or+cervical+lymph+nodes.">Upper respiratory tract resistance to influenza infection is not prevented by the absence of either nasal-associated lymphoid tissue or cervical lymph nodes.</a> J. Immunol. 175, 3186-3196 (2005).</li><li>W, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+immunisation+with+conjugate+vaccine+protects+mice+from+systemic+and+respiratory+tract+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">Intranasal immunisation with conjugate vaccine protects mice from systemic and respiratory tract infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Vaccine. 24, 4333-4342 (2006).</li><li>Fernandez, S., Cisney, E. D., Hall, S. I., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+immunity+to+staphylococcal+toxic+shock+is+controlled+by+the+nasopharynx-associated+lymphoid+tissue.">Nasal immunity to staphylococcal toxic shock is controlled by the nasopharynx-associated lymphoid tissue.</a> Clin. 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Vaccine Immunol. 14, 1499-1504 (2007).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

我々は、生物学的サンプル、NALTに関連した免疫応答の1-4を調べるためのアッセイを得て、動物モデルを開発するための集団的方法を提示している。これらのメソッドの実行中に考慮すべきその他の要因があります。手術や組織培養のための標準無菌テクニックに従うべきである。単離および培養と同様に、滅菌した器具、作業領域、および消毒味覚を維持する時に使用される抗菌剤および抗真菌剤の組み合わせは、汚染の危険性を減らすことができます。血清抗体は一般的に高い濃度で検出されたとして唾液、鼻洗浄と同じような粘膜分泌物のサンプルは、血液中の潜在的な汚染を検査する必要があります。抗体の低濃度は、血清に比べ、これらのサンプル中に存在するので、さらに、粘膜の分泌物は、ほんの少しだけ分析のために希釈する必要があります。 マウスは、事前に直​​接、手術後に保温する必要があります潜在的な麻酔誘発性低体温を発散。不規則な呼吸を最小限に抑えるために手術後の療養中に、その両側に別の安静時のマウス。手術を行う1、口を開けて、マウスは麻酔から回復するように手術後のケアを提供するための1つを保持して支援するためにいずれかの手術では、これらのタスクを完了するために一緒に仕事を3人の方が効率的です。 これは、各マウスの手術の成功したかどうかを確認するために、すべての実験手順や研究の終了時に頭蓋の断面のH＆E染色を使用する必要があります。可能な限り手術の成果は、以下のとおりです。完全な二国間のNALTアブレーション、不完全切除、または無傷のNALT。すべての手術は、NALTの完全な損失になりますので、残留または無傷のNALTを持つ動物は、内部コントロールとして使用することができます。別の潜在的な結果は、口蓋、鼻と口腔をつなぐ開口部を残して、完全に治癒してしまうことである。不完全口蓋の治癒は、低体重と成長障害が発生し、これらの個人は、研究から削除する必要があります。 マウスモデルを持つ最初のワクチンの応答を調べると、意図した研究結果（抗体応答、生存率など）にNALTの役割を確立するのに役立つでしょう。外科的にNALTを削除すると、ローカルおよび全身性免疫に鼻の貢献の決定を容易にします。ここで説明した外科的アプローチは、NALTの欠けているマウスモデルを得るための最も直接的な方法です。選択したノックアウトマウスモデルが欠けてNALTに報告したが、これらの動物はまた、他の二次リンパ組織の発達に不可欠なサイトカインやケモカインの欠乏であり、追加の欠陥12,13を抱いていることがされています。さらに、ここで説明する方法は、鼻腔内に元の免疫応答のいくつかの側面を調べるために開発されました。我々の実験結果は、全体の上限palatを用いた研究に基づいています。組織培養のためのマウスからの電子、それはセクションが使用されている可能性がありますが。最後に、培養されたNALTモデルは、組織培養で完全に実験を行うのに便利です。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ステンレススチール滅菌外科ブレード、第11号</td><td> Miltex </td><td> 4から311 </td><td></td></tr><tr><td>ナイフのハンドル、第3号</td><td> Miltex </td><td> 4月7日</td><td></td></tr><tr><td> 48ウェル細胞培養プレート</td><td>共演者</td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、不活化熱</td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 16000-044 </td><td>最終濃度：10％体積の培地に</td></tr><tr><td>硫酸ストレプトマイシン</td><td>シグマ</td><td> S9137 </td><td>最終濃度：100μg/ mLの</td></tr><tr><td>ペニシリン</td><td>シグマ</td><td> P7794 </td><td>最終濃度：100 UI / mLの</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G1397-10ML </td><td>最終濃度：50μg/ mLの</td></tr><tr><td>ファンギゾン</td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 15290-018 </td><td>最終濃度1μg/ mLの</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H0887 </td><td>最終濃度10 mMの</td></tr><tr><td>エッペンドルフ微量遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td>ニュートラゲルチェリー風味マウスウェットフード</td><td>バイオサーブ</td><td> S4798-TRAY </td><td></td></tr><tr><td>メタカム</td><td>ベーリンガーインゲルハイム</td><td> 601531000 </td><td> 1.5 mg / mLの経口懸濁液の一滴</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>ファイザー</td><td> 00856440301 </td><td>最終的な共同NC：6.06 mg / mLの</td></tr><tr><td>アセプロマジン</td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td>最終濃度：0.061 mg / mLの</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>ロイド</td><td> 4811 </td><td>最終濃度：0.667 mg / mLの</td></tr><tr><td> Puralube獣医軟膏</td><td> Pharmadermアニマルヘルス</td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0.9％塩化ナトリウム注射液USP </td><td>バクスター</td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5ミリメートルMicrocurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td>熱焼灼装置</td><td>ガイガー</td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> TCUの交換チップ、ストレートファインループ</td><td>ガイガー</td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td>外科はさみ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10％中性緩衝化ホルマリン</td><td>シグマ</td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>フィッシャー</td><td> A119P-4 </td><td> 1047 mLの水道水に426 mLのギ酸を混ぜて、その後45mLのRexyn 101（H）を追加する</td></tr><tr><td> Rexyn 101（H） </td><td>フィッシャー</td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td>組織テックVIP E150/E300 </td><td>桜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>回転式ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td>マイヤーのヘマトキシリン</td><td>シグマ</td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td>ギルNo.1のヘマトキシリン</td><td>シグマ</td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td>エオシンB </td><td>シグマ</td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer血清セパレータ</td><td> BD Medical </td><td> 365956 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td></td><td></td><td> 100mMののNaH 2 PO 4、140mMのNaCl、pH7.4の</td></tr><tr><td>プロテアーゼインヒビターカクテル、EDTA-フリー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 78415 </td><td></td></tr></tbody></table>

examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines

人間、齧歯類、および他の哺乳動物に見られる鼻咽頭関連リンパ細網組織（NALT）が、1月3日副鼻腔内免疫に貢献しています。 NALTは、硬口蓋、上記の鼻腔にある2つの平行な釣鐘型の構造であり、通常、粘膜関連リンパ系4-6の二次成分であると考えられている。 NALT内に位置し、抗原提示樹状細胞4,7,8が点在し、BおよびTリンパ球の離散的コンパートメントである。これらの細胞は、空気通路9,10の粘膜表面から抗原検索のための責任があるM細胞にインターカレートした上皮細胞層に囲まれています。 NALTを介して循環するナイーブリンパ球は、呼吸器病原体7で最初の出会いに対応するために態勢を整えています。 NALTは2歳で人間に消えている間、ワルダイヤー輪と同様に構造化されたリンパ器官は目を保持し続けるライフ6 roughout。人間とは対照的に、マウスは、このように副鼻腔11内に元の免疫応答の研究のための便利な動物モデルを提供し、生涯を通じてNALTを保持します。 NALTの単細胞懸濁液の培養は、単核細胞の収率が低いために実用的ではありません。しかし、NALT生物学は、無傷の器官のex vivoで培養することにより検討し、このメソッドは自然な組織構造を維持するための付加的な利点を持っていることができます。 in vivo試験では、NALTに限ら欠陥を提示する遺伝子ノックアウトモデルでは、発達経路の理解不足のため現在利用できません。リンホトキシン-αノックアウトマウスはNALTが萎縮している一方、例えば、パイエル板、末梢リンパ節、濾胞樹状細胞やその他のリンパ組織はまた、これらの遺伝子操作マウスを12,13に変更されています。遺伝子ノックアウトマウスの代わりに、外科的アブレーションのpとして常に承認、他の組織に影響を与えることなく、鼻腔からNALTを排除します。その結果マウスモデルは、ワクチン1,3にNALTと免疫応答の間の関係を確立するために使用されています。血清、唾液、鼻洗浄と膣分泌物のシリアルコレクションは、NALTから直接発信免疫応答は組織培養によって確認することができますが、予防接種へのホストの応答の基礎を確立するために必要である。次の手順では、鼻腔（IN）ワクチン接種局所および全身体液性免疫応答を検討するために必要な手術は、組織培養とサンプルコレクションの概要を説明します。

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Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

鼻腔内ワクチンマウスの鼻腔内および全身の免疫応答に鼻咽頭関連リンパ細網組織（NALT）の寄与を調べるためのメソッドが記述されています。我々はNALTに依存するマウスモデルを確立するために外科手術を発揮し、<em&gt; ex vivoで</em抽出されたNALTの&gt;文化。

ワクチンには、マウスの応答における鼻咽頭関連リンパ網内系組織（NALT）の役割を調べる

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

examining-role-nasopharyngeal-associated-lymphoreticular-tissue-nalt

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

25.4K ビュー.  U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. 鼻腔内ワクチンマウスの鼻腔内および全身の免疫応答に鼻咽頭関連リンパ細網組織（NALT）の寄与を調べるためのメソッドが記述されています。我々はNALTに依存するマウスモデルを確立するために外科手術を発揮し、 ex vivoで文化。

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

免疫・感染学

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV重感染のコンテキストでのマラリアに対する免疫応答を測定するためのモデル

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション<em&gt; PilG</em&gt;で<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

IL-8トランジェントトランスジェニックマウスモデル<em&gt;インビボ</em&gt;炎症反応の長期モニタリング

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

ヒトの過剰発現と精製<em&gt;シス</em&gt; - プレニルトランスフェラーゼ<em&gt;大腸菌</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

大人のゼブラフィッシュの DNA 基づかせていたワクチンの前臨床スクリーニングのため予防接種

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...