그녀의 기술 지원 양 Lailey;과 인간의 탯줄 코드를 제공하는 캘거리, AB의 산기슭 병원의 단위 51 우리는 박사 피나 Colarusso 및 이미징 및 이미지 분석과 그들의 도움을 라이브 셀 이미징 시설 감사드립니다. 박사 KD 파텔은 앨버타 혁신이다 : 건강 솔루션 과학. 이 작품은 혁신과 앨버타 과학 연구 기관에 대한 캐나다 재단 보건 연구 장비 및 인프라 조성을위한 캐나다 연구소에서 운영 교부금에 의해 지원되었다.

1. 인간 혈관 내피 세포의 분리 및 유지 보수 <ol><li> 인간의 혈액과 조직과 함께 작업할 때 수준 2 biosafety 절차를 사용해야합니다. 이용 가위는 태반에서 탯줄을 절단하고 긴밀하게 혈전 및 납품 중에 코드를 클램핑하여 발생한 손상에 대해서는 코드를 검사합니다. 잘라 및 코드의이 부분을 버리고. </li><li> 50 MG의 collagenase를 포함 튜브로 따뜻한 코드 버퍼의 50 ML을하고 있는걸 1 밀리그램 / ML에서 신선한 collagenase 용액을 준비한다. </li><li> 멸균 장갑으로 변경하고 소독 무딘 cannulas, 코드 클램프, 가위, 세 방식 중지 - 자지와 층류 후드에 거즈를 포함하는 autoclaved 악기 트레이를 엽니다. </li><li> 두 동맥과 탯줄에있는 단일 정맥 선물을 식별합니다. 동맥은 소규모이며 정맥이 크고 cannulate하기 쉬운 반면, 꽉 죄이고 경향이 있습니다. 정맥에서 혈액을 플러시하려면 부드럽게에 연결된 양방향 꼭지로 정맥을 삽입 전위치에 단단히 붙잡아 정맥 주위에 클램프 정맥 및 장소 니면 한쪽 끝을. 정맥을 통해 코드 버퍼를 Perfuse. 을 통해 흐름이 명확해질 때까지 반복하고 코드의 끝을 클램프. </li><li> 정맥에 Perfuse collagenase는 꼭지를 닫고 10 분 정도 따뜻한 코드 버퍼와 부화를 포함 비커에 코드를 넣습니다. 십분 후에 코드를 제거하고 부드럽게 혈관의 루멘에서 내피 세포를 느슨하게하기 위해 코드를 마사지. 내피 세포 미디어 (ECM)를 포함하는 튜브에 솔루션을 드레인. 두번 남아있는 세포를 제거하는 코드를 버퍼로 플러시. 같은 튜브에 솔루션을 드레인. </li><li> 펠렛까지 10 분 내피 세포 350 XG에 세포를 원심 분리기. </li><li> 표면에 뜨는를 제거하고 펠릿으로 ECM의 10 ML에 추가합니다. 부드럽게 ECM에서 세포를 resuspend 다음, 0.2 % 젤라틴으로 미리 코팅 T75 플라스크에 세포를 전송합니다. 젤라틴과 사전 코팅은 37 ° C.에 최소 1 시간 동안 완료되었습니다 37에서 세포를 성장 ° C에서 5% 2를 공동. </li><li> 다음날 부드럽게하는 적혈구 그때 뜨는을 제거하고 따뜻한 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)로 씻어 꺼내려 플라스크를 흔들. HBSS를 제거하고 따뜻한 ECM의 10 ML과 세포를 먹이. 적혈구가 제거되었는지 확인하기 위해 현미경으로 세포를 검사합니다. 내피 세포의 합류 조직 형태의 정도를 평가하십시오. 이 단계에서 내피 세포 vacuoles의 흔적으로 늘어나지해야합니다. </li><li> 세포가 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 트립신의 0.08 % 용액을 사용 confluency 후 분할 세포에 도달할 때까지 매 사흘 미디어를 변경하려면 계속합니다. 원하는 요리 플레이트 내피 세포는 0.2 % 젤라틴으로 미리 코팅. 세포 3~6일에 합류에 도달해야합니다. </li><li> 0.2 % 젤라틴으로 각각의 챔버 ibidi 챔버, 프리 코트를 사용하는 경우. 제거를 초과 1.5 X 챔버에 ECM에 정지 내피 세포의 10 6 / ML을 추가 후 젤라틴과 fibronectin합니다. 매일 미디어를 변경합니다 일까지onfluent. 세포는 코드에 따라 2~3일에 합류해야합니다. </li></ol> 2. Neutrophils의 작성 <ol><li> Neutrophils는 밀도 원심 분리를 사용하여 건강한 인간 자원 봉사자의 말초 혈액으로부터 격리되었다. 호중구 격리를위한 시각적인 시범 자세한 프로토콜은이 저널 6 이전 문제에서 찾을 수 있습니다. 0.5 % 인간 알부민을 포함하는 HBSS에 1x10 6 / ML의 농도 한번에 절연, resuspend neutrophils. </li></ol> 3. Ibidi 회의소 설정하기 <ol><li> 젤라틴 코팅 ibidi 챔버에서 내피 세포 성장. 그들은 밀접하게 합류되기 전까지의 위상 콘트라스트 현미경을 사용하여 매일 그들을 검사합니다. </li><li> 접착 및 활성화 분자의 표현을 높이기 위해 내피 세포를 자극. 이 프로토콜의 목적을 위해 내피 세포는 37에서 4 시간 동안 10 NG / 재조합 TNF-α의 ML과 자극했다 ° C와 5 % CO <sub&gt; 2 전에 유동 조건 하에서 이미징을위한 ibidi 챔버를 설정합니다. </li><li> 현미경, 그리고 시각적으로 빈 ibidi 챔버를 사용 Wiese 및 동료 11 시까지 설명된대로 주사기 펌프를 준비합니다. </li><li> 이 프로토콜과 Wiese 절차 사이의 주요 차이점은 사전 충전, 공기에 대한 내피 세포의 노출을 막기 위해 튜브를 37 버퍼를 유지 ° C 온도를 잃는에서 버퍼를 유지하기 PharMed 튜빙을 사용하고 사용하여 물 목욕을 사용하여 다른 포함 위상 대조 또는 형광 이미징과 함께 여부에 따라 현미경의 목표. </li><li> 현미경이 설치되고 튜브가 가까이 HBSS 모든 stopcocks 가득되며 빈 ibidi 챔버를 제거하면. </li><li> TNF-α를 포함하는 ibidi 챔버가 튜브에 내피 세포를 자극 연결합니다. </li></ol> 4. 호중구 모집과 윤회 <ol><li> microsc의 내피 세포 단일층를 떠올10X 위상 대비 목표를 사용 ope. </li><li> 원하는 전단 응력의 ​​HBSS의 흐름을 (일반적으로 0.5-2 dyn / cm 2 사이) 철회하고 시작 주사기 펌프를 설정합니다. </li><li> 세 방향 정류장 - 거시기를 전환하여 절연 neutrophils (1x10 6 / ML)에 HBSS에서 유입 측면에서 전환합니다. </li><li> DVD 레코더에 하나 연결하거나 컴퓨터에 직접 연결 CCD 카메라를 사용하여 녹음을 시작합니다. neutrophils는 챔버를 입력하면 타이머를 시작합니다. 4 분 neutrophils를 Perfuse. 호중구 정지 3 ML 총 한 실험을위한 충분합니다. </li><li> 4 분 뒤 새로운 neutrophils의 부착을 방지하기 위해 HBSS 다시 전환합니다. 총 상호 작용, 압연 및 확고한 접착을위한 데이터를 원하는 경우에는 10 초 각각의 이미지 6 무작위 필드는 분 4와 5 사이에 10 배 위상 대비 목표를 사용합니다. </li><li> 40x 목적으로 전환 5 10 분 사이에보기의 단일 필드를 기록합니다. 십분에서 수집보기의 무작위 분야 5 사이 10. </li><li> 흐름을 중지하고 다음 챔버로 이동합니다. </li></ol> 5. Ibidi 회의소를 사용하면 흐름 조건에서 형광 이미징 <ol><li> 관심 형광 프로브와 라벨 중 내피 세포 또는 neutrophils. 예를 들어, 알렉사-[547]에 대한 복합 백신 VE-cadherin 항체는 내피 세포 분기점을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 미분 간섭 대비 (DIC) 및 형광 기능을 갖춘 현미경에 ibidi 챔버를 조립. 우리는 환경 챔버와 함께 FluoView 1000 공촛점 (올림푸스)을 사용합니다. DIC와 형광 작업을 위해 설계 목표를 사용하는 데 중점을 둡니다. </li><li> 섹션 4에서 설명한 시간 코스를 따라하면서 공급 업체에서 제공하는 소프트웨어를 사용하여 동시 DIC 및 형광 영상을 얻은 겁니다. </li></ol> 6. 호중구 채용 분석 <ol><li> 세포를 압연 및 상호 작용의 분석은 Wiese 외 11 시까지 설명되어 있습니다. </lI&gt; <li> 내피 단일층 오초의 시대에 하나 이상의 셀 직경 이사 neutrophils의 숫자를 계산에 압연 neutrophils의 비율을 측정. 롤링 세포의 비율을 결정하기 위해 필드에 leukocytes의 총 숫자가이 번호를 나누십시오. 확장하여 나머지 세포는 단단히 자기편으로 간주됩니다. </li><li> 호중구가 특정 기간에 여행 후 초 단위로 그 시간으로 나누어 거리를 계산하여 호중구의 회전 속도를 측정합니다. </li><li> 윤회는 모양을 변경하고 단일층 열 아래에 마이그레이션한 neutrophils의 수를 계수에 의해 결정됩니다. 이러한 neutrophils들은 위상되는 밝고으로 변경했다는 사실에 의해 식별됩니다 때 단일층 10 아래 위상 어두운 격 단일층 위에. transmigrated 세포의 숫자는 전망이 분야의 총 세포의 비율로 또는 원시 감각으로 표현하실 수 있습니다단위 면적 당 transmigrated 세포의 어. 이 모델 시스템에서 neutrophils의 일반적으로 50 % 십분 후에 윤회하다. </li></ol> 7. 대표 결과 Unstimulated 내피 세포는 호중구 채용을 지원하지 않습니다. 대조적으로, 호중구 압연, 확고한 접착력과 윤회의 TNF-α 결과 내피 세포를 자극. 이러한 데이터의 예제는 그림 1과 2에 표시됩니다. 그림 1A는 TNF-α-자극된 내피 세포와 상호 작용하는 neutrophils를 보여줍니다. 이러한 상호 작용은 내피 세포와 상호 작용 neutrophils의 총계뿐만 아니라 (그림 2) 확고하게 자기편이나 transmigrated, 압연 neutrophils의 수를 공개, 계량하실 수 있습니다. 호중구 윤회는 세포 분기점이나 내피 세포 자체를 통해 발생할 수 있습니다. 이 두 조건을 구별하기 위해 내피 세포는 반 VE-C로 분류하고 있습니다<html> adherin 항체와 윤회는 (그림 1B와 C) paracellularly 또는 transcellularly 발생으로 채점됩니다. 이 모델에서는 거의 모든 윤회 7 paracellular입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" /> 그림 1. ibidi 챔버를 사용하여 유동 조건 하에서 동시 DIC와 형광 이미징. () DIC 이미지와 신선한 인간 제대 정맥 내피 세포를 통해 이주하는 인간 neutrophils을 분리. 노란 화살촉은 자기편 호중구를 보여줍니다; 흰 화살촉은 transmigrating 호중구를 보여줍니다. (B) 내피 세포 분기점은 알렉사-[547]와 몇 군데의 복합 백신 VE-cadherin 항체 물들일되었다. (C) 채널 A와 B는이 모델의 거의 모든 transmigrating가 paracellular임을 밝히의 오버레이를 표시합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . _content &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" /> 그림 2. 내피 세포 unstimulated 남았다 또는 TNF-α의 10 NG / ML로 자극했다. 사시간 후, 병렬 플레이트 흐름 챔버는 조립되어 neutrophils은 1 dyn / cm 2 시에 걸쳐 perfused되었다. () 호중구 상호 작용은 검사와 NIH에서 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정되었다. 총 상호 작용하는 세포는 (B) 압연, 단단히 자기편 또는 (C) transmigrating로 특성화했다. 데이터는 3시 사이에 5 실험 평균 + SEM을 나타냅니다. 패널 및 C의 제어 및 TNF의 차이는 의미였다 (P &lt;0.001).

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+rolling,+arrest,+and+transmigration+across+activated,+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b/CD18.">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. 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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

<html> 연구자는 정기적으로 호중구 모집하고 윤회를 공부하기 위해 다른 혈관 침대에서 내피 세포를 사용 하였다. 예는 있지만, 피부 microvascular 내피 세포 12, 인간 제대 정맥에서 10 간 sinusoidal 내피 세포를 13 내피 세포에 제한되지 않습니다. 그들 중에는 HUVEC 때문에 고립과 가용성 그들의 상대적 용이성의 넓은 인기를 얻었다. HUVEC은 생체내에서 발생하는 많은 내피 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 및 장비 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Collagenase의 타입 1 </td><td> 워딩턴 </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> 코드 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 구성 : 산도 7.4에서 1mM 아뇨 2 PO 2분의 4 나 HPO 4 버퍼에 140 밀리미터 NaCl 4 MM KCl 10 밀리미터 D-글루코오스 </td></tr><tr><td> 내피 세포 미디어 (ECM) </td><td></td><td></td><td> 페니실린의 100 단위 스트렙토 마이신의 100 μg 및 L-glutamine/ml의 0.3 밀리그램이 들어있는 16% 인간 혈청 보충 독수리 소금과 M199 </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린의 스트렙토 마이신의 글루 탐 산염 (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi 챔버 </td><td> Ibidi </td><td> 80,606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> Prepro 테크 </td><td> 300 01A </td><td></td></tr><tr><td> 인간 알부민 20 % 용액 </td><td> 제미 나이 Bioproducts </td><td> 800,120,050 </td><td></td></tr><tr><td> + 및 MG 2 칼슘이없는 HBSS + </td><td> 시그마 </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> 칼슘 2 + 및 MG 2 HBSS + </td><td> 시그마 </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions

Neutrophils는 백혈구 중 가장 풍부한 타입입니다. 그들은 타고난 면역 시스템 1의 필수적인 부분을 형성합니다. 급성 염증 동안, neutrophils는 부상의 사이트로 마이 그 레이션하는 최초의 염증 세포가 있습니다. 전체 호중구의 세 번째 압연, 접착력과 윤회이고 두 번째는 microvascular 구조적 변화와 혈류에서 혈장 단백질 탈출, 부상 사이트에 neutrophils의 채용은 혈액 흐름을 증가 혈관이 먼저 팽창을 포함 stepwise 과정입니다 내피, 부상 2,3의 사이트에 neutrophils의 및 네 번째 축적. 생체내 및 시험 관내 방법의 다양한는 이러한 프로세스 4의 연구를 활성화하는 진화하고있다. 이 방법은 인간의 내피 세포에 걸쳐 호중구 윤회에 초점을 맞추고 있습니다. 호중구 윤회에 관련된 분자 프로세스를 검사 하나는 인기있는 방법은 인간의 N을 활용기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 5 상호 작용 eutrophils. 호중구 격리는 다른 여섯 시각적으로 설명하고, 따라서이 문서는 HUVEC의 격리를 위해 방법을 보여줍니다. 일단 격리와 합류로 성장, 내피 세포 부착 및 활성화 분자의 upregulation 결과적으로 활성화됩니다. 예를 들어, 증가 E-selectin 및 IL-8 표현 7의 TNF-α 결과 같은 크린 시토킨와 내피 세포의 활성화. E-selectin의 mediates neutrophils과 IL-8 mediates 활성화와 neutrophils의 확고한 유착의 캡처 및 압연. 유착 neutrophils은 윤회하다 후에. 윤회가 (내피 세포 자체를 통해) transcellularly paracellularly 발생 (내피 세포 분기점을 통해) 또는 수 있습니다. 대부분의 경우 이러한 상호 작용은 vasculature 7,8에서 발견 유동 조건에서 발생합니다. 병렬 플레이트 흐름 챔버는 널리 사용되는 시스템입니다 MI유체 전단은 생체내에서 발견하고 체외 9,10에서 유동 조건하에 호중구 채용의 학습을 가능하게합니다. 강조 마이크 몇몇 기업들은 병렬 플레이트 흐름 챔버를 생성하고 각각 장점과 단점이 있습니다. 형광 이미징이 필요한 경우, 유리 또는 광학 유사한 폴리머가 사용해야합니다. 내피 세포는 유리에 잘 성장하지 않습니다. 여기 급속한 접착력과 인간 내피 세포의 성장을 지원하며 비교할 수있는 광학 자질이 있는지 폴리머로 만들어진 낮은 볼륨 ibidi 채널 슬라이드를 사용하여 호중구 윤회의 위상 대비, DIC 및 형광 이미징을위한 쉽고 빠른 방법을 제시 유리. 이 방법에서는 내피 세포 성장되었으며 ibidi의 μslide에 자극. Neutrophils는 유동 조건에서 소개되었으며 윤회가 평가되었다. 분기점의 형광 이미징은 대 paracellular의 범위에 실시간 결정을 활성화transcellular 윤회.

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K 조회수.  University of Calgary. 이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

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Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

연구

면역학 및 감염병학

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...