Agradecemos al Dr. Pina Colarusso y el Fondo para la célula de imágenes en vivo por su ayuda con imágenes y análisis de imágenes, la Sra. Lailey por su asistencia técnica, y la unidad 51 en el Hospital Foothills en Calgary, AB para proveer los cables umbilicales humanos. El Dr. Patel es un KD Innova Alberta: Salud Científico de Soluciones. Este trabajo fue apoyado por una subvención de funcionamiento de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y las donaciones de equipos y la infraestructura de la Fundación Canadiense para la Innovación y la Ciencia y la Autoridad de Investigación de Alberta.

1. Aislamiento y mantenimiento de las células endoteliales vasculares <ol><li> Nivel 2 los procedimientos de bioseguridad debe ser utilizado cuando se trabaja con la sangre y tejidos humanos. Usando tijeras de cortar el cordón umbilical de la placenta y luego examinar de cerca el cable de coágulos sanguíneos y daños causados ​​por el pinzamiento del cordón durante el parto. Corte y deseche las partes de la cuerda. </li><li> Preparar una solución de colagenasa fresco a 1 mg / ml mediante el vertido de 50 ml de tampón de cable caliente en un tubo que contiene 50 mg de colagenasa. </li><li> Cambiar a guantes estériles y abrir una bandeja de instrumentos esterilizados en autoclave que contiene cánulas romas, pinzas, tijeras, cordón de tres vías de dejar de gallos y la gasa en una campana de flujo laminar. </li><li> Identificar las dos arterias y el presente sola vena en el cordón. Las arterias son más pequeñas y tienden a ser fuertemente restringido, mientras que la vena es grande y fácil de canular. Para lavar la sangre de la vena, suavemente insertar una cánula con una llave de paso de dos vías que se le atribuye into uno de los extremos de la vena y un lugar abrazadera alrededor de la cánula para sujetarlo firmemente en su posición. Perfundir cable de búfer a través de la vena. Repetir hasta que el flujo a través es claro y entonces sujetar el extremo del cable. </li><li> Colagenasa perfusión en la vena, cierre la llave de paso, colocar el cable en un vaso que contiene el tampón de cable de calentamiento y se incuba durante 10 minutos. Después de 10 minutos, retire el cable y masajear suavemente el cable para aflojar las células endoteliales de la luz de la vena. Escurrir la solución en el tubo que contiene los medios de células endoteliales (ECM). Lavar con tampón cable dos veces para eliminar las células restantes. Escurrir la solución en el mismo tubo. </li><li> Centrifugar las células a 350 xg durante 10 minutos para sedimentar las células endoteliales. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 10 ml de ECM para el pellet. Resuspender las células en ECM, a continuación, transferir las células a un matraz T75 pre-recubiertas con gelatina al 0,2%. Pre-recubrimiento con gelatina que se ha hecho por lo menos durante 1 hora a 37 ° C. Crecer las células a 37 ° C y 5% De CO 2. </li><li> Al día siguiente, agite suavemente el frasco para desprender las células rojas de la sangre a continuación, retire el sobrenadante y se lava con solución salina balanceada tibia de Hank (HBSS). Retire HBSS y alimentar a las células con 10 ml de ECM caliente. Se examinan las células bajo el microscopio para asegurar que las células rojas de la sangre se eliminaron. Evaluar el grado de confluencia y la morfología de las células endoteliales. Las células endoteliales en esta etapa debe ser alargado y no hay indicios de vacuolas. </li><li> Continuar para cambiar los medios de comunicación cada tres días hasta que las células llegan a las células confluencia, a continuación, se separaron utilizando una solución de 0,08% de tripsina que contiene EDTA 1 mM. Las células endoteliales de placa en los platos que desee pre-recubiertas con gelatina al 0,2%. Las células deben llegar a la confluencia en 3-6 días. </li><li> Cuando se utiliza ibidi cámaras, pre-capa cada cámara con gelatina al 0,2%. Eliminar el exceso de gelatina y fibronectina y luego añadir 1,5 x 10 6 / ml de células endoteliales en suspensión en ECM en la cámara. Cambiar los medios de comunicación cada día hasta que confluent. Las células deben ser confluentes en 2-3 días, dependiendo de la médula. </li></ol> 2. Preparación de Neutrófilos <ol><li> Los neutrófilos se aislaron de la sangre periférica de voluntarios humanos sanos utilizando centrifugación de densidad. Un protocolo detallado con una demostración visual para el aislamiento de los neutrófilos se puede encontrar en la edición anterior de esta revista 6. Una vez aisladas, neutrófilos volver a suspender en una concentración de 1x10 6 / ml en HBSS conteniendo 0,5% de albúmina humana. </li></ol> 3. La creación de la Cámara ibidi <ol><li> Se cultivan las células endoteliales en una cámara revestida con gelatina ibidi. Examine todos los días mediante microscopía de contraste de fase hasta que se convierten bien confluente. </li><li> Estimular las células endoteliales para aumentar la expresión de moléculas de adhesión y la activación. Para los fines de este protocolo, las células endoteliales se estimularon con 10 ng / ml de TNF-α recombinante durante cuatro horas a 37 ° C y 5% de CO <sub&gt; 2 antes de configurar la cámara para obtener imágenes de ibidi bajo condiciones de flujo. </li><li> Preparar el microscopio, y la bomba de jeringa como visual descrito por Wiese y sus colegas 11 utilizando una cámara de vacío ibidi. </li><li> Las principales diferencias entre este protocolo y el procedimiento Wiese incluyen pre-llenado de la tubería para evitar la exposición de las células endoteliales a la atmósfera, el mantenimiento de la memoria intermedia a 37 ° C usando un baño de agua, utilizando tubos PharMed para mantener la memoria intermedia de la pérdida de la temperatura y el uso de diferentes objetivos en el microscopio, dependiendo de si la imagen con contraste de fase o de fluorescencia. </li><li> Una vez que el microscopio está configurada y el tubo se llena con HBSS, cierre todas las llaves de paso y quitar la cámara de vacío ibidi. </li><li> Conectar la cámara ibidi contiene TNF-α estimula las células endoteliales a la tubería. </li></ol> 4. El reclutamiento de neutrófilos y Transmigración <ol><li> Visualice la monocapa de células endoteliales en el Microscopa utilizando un objetivo de contraste de fase 10x. </li><li> Establecer la bomba de jeringa para retirar e iniciar el flujo de HBSS en el esfuerzo cortante deseado (normalmente entre 0,5 a 2 dinas / cm 2). </li><li> Por el lado de la entrada, cambio de HBSS a los neutrófilos aislados (1x10 6 / ml), girando el camino de tres llave de paso. </li><li> Comience a grabar con una cámara CCD de conectar a un grabador de DVD o conectar directamente al ordenador. Inicie el cronómetro cuando los neutrófilos entran en la cámara. Perfundir los neutrófilos durante cuatro minutos. Un total de 3 ml de la suspensión de neutrófilos es suficiente para un solo experimento. </li><li> Después de cuatro minutos, volver a HBSS para evitar la adhesión de los neutrófilos nuevos. Si los datos de interacción total, rodamiento y adhesión firme se desea, imagen 6 campos al azar de 10 segundos cada uno con un objetivo de contraste de fase 10x entre los minutos 4 y 5. </li><li> Cambiar a un objetivo de 40x y graba un solo campo de visión entre los 5 y 10 minutos. A los 10 minutos, recopila losentre 5 y 10 campos aleatorios de vista. </li><li> Parar el flujo y pasar a la siguiente cámara. </li></ol> 5. Proyección de imagen fluorescente bajo condiciones de flujo usando una cámara de ibidi <ol><li> Etiqueta, ya sea células endoteliales o neutrófilos con una sonda fluorescente de interés. Por ejemplo, un anticuerpo anti-VE-cadherina conjugado a Alexa-[547] puede ser usado para visualizar las uniones de las células endoteliales. </li><li> Ensamble de cámara ibidi en un microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC) y capacidad de fluorescentes. Usamos una FluoView 1000 confocal (Olympus) con una cámara ambiental. Enfocar con un objetivo diseñado para el trabajo DIC y fluorescencia. </li><li> Adquirir imágenes simultáneas, DIC y fluorescencia utilizando el software suministrado por el proveedor mientras se sigue el curso del tiempo se describe en la sección 4. </li></ol> 6. Análisis de reclutamiento de neutrófilos <ol><li> Análisis de rodadura y la interacción células se describe por Wiese et al 11. </li&gt; <li> Para medir el porcentaje de neutrófilos de rodadura sobre la monocapa endotelial contar el número de neutrófilos que se han movido más de un diámetro de células en un período de 5 segundos. Divida este número por el número total de leucocitos en el campo para determinar el porcentaje de células de rodadura. Por extensión, las células restantes se consideran firmemente adheridas. </li><li> Medir la velocidad de rotación de los neutrófilos mediante el cálculo de la distancia que la recorrida de neutrófilos en un período de tiempo determinado y luego dividirlo por ese tiempo en segundos. </li><li> Transmigración se determinó contando el número de neutrófilos que hayan cambiado de forma y migran por debajo de la monocapa 10. Estos neutrófilos son identificados por el hecho de que cambie de ser fase brillante cuando en la parte superior de la monocapa de ser oscuro fase cuando debajo de la monocapa 10. El número de células transmigrados puede ser expresado como un porcentaje del total de células en el campo de visión o como materia prima entumecidaer de células transmigrados por unidad de área. En este sistema modelo, típicamente 50% de los neutrófilos transmigrar después de 10 minutos. </li></ol> 7. Los resultados representativos Sin estimular las células endoteliales no son compatibles con el reclutamiento de neutrófilos. En contraste, la estimulación de las células endoteliales con el TNF-alfa en los resultados de los neutrófilos de rodadura, la adhesión firme y la transmigración. Un ejemplo de estos datos se muestran en las Figuras 1 y 2. Figura 1A muestra neutrófilos que interactúan con el TNF-α-células endoteliales estimuladas. Estas interacciones pueden ser cuantificadas, revelando el número total de neutrófilos que interactúan con las células endoteliales, así como el número de neutrófilos rodantes, firmemente adherente o transmigrado (Figura 2). Transmigración de neutrófilos puede ocurrir a través de uniones de las células o las células endoteliales mismos. Para diferenciar entre estas dos condiciones, las células endoteliales están etiquetados con un anti-VE-c<html> adherin anticuerpos y la transmigración se califica como algo que ocurre paracellularly o transcellularly (fig. 1B y C). En este modelo, prácticamente toda la transmigración es paracelular 7. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" /> Figura 1. DIC simultánea y imágenes de fluorescencia bajo condiciones de flujo usando una cámara de ibidi. (A) Imagen DIC recién aisladas neutrófilos humanos migran a través de las células endoteliales de vena umbilical. La punta de flecha amarilla muestra un neutrófilos adherentes; la punta de flecha blanca muestra un neutrófilo transmigra. (B) las uniones de células endoteliales se tiñeron con un anticuerpo anti-VE-cadherina conjugado con Alexa-[547] y de imágenes. (C) muestra la superposición de los canales A y B revela que prácticamente todos los transmigración en este modelo es paracelular. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . _content &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" /> Figura 2. Las células endoteliales se dejaron sin estimular o se estimularon con 10 ng / ml de TNF-α. Después de 4 horas, una cámara de flujo paralelo placa fue ensamblado y neutrófilos fueron perfundidos a través de una dinas / cm 2. (A) las interacciones de neutrófilos fueron examinados y se mide utilizando el software ImageJ de NIH. Las células que interactúan totales fueron caracterizados como (B) de rodadura, firmemente adherente o transmigración (C). Los datos representan la media + SEM de entre 3 y 5 experimentos. La diferencia entre el control y TNF en los grupos A y C fue significativa (p &lt;0,001).

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+rolling,+arrest,+and+transmigration+across+activated,+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b/CD18.">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. 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No hay conflictos de interés declarado.

<html> Los investigadores han utilizado rutinariamente las células endoteliales de los diferentes lechos vasculares para estudiar el reclutamiento de neutrófilos y la transmigración. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, células endoteliales microvasculares dérmicas 12, el hígado células endoteliales sinusoidales 13 y las células endoteliales de vena umbilical humana 10. Entre ellos HUVEC ganado amplia popularidad debido a su relativa facilidad de aislamiento y la disponibi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Los reactivos y equipos </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> La colagenasa tipo 1 </td><td> Worthington </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> Cable de búfer </td><td></td><td></td><td> Composición: 140 mM de NaCl 4 mM de KCl 10 mM de D-glucosa en 1 mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 tampón a pH 7,4 </td></tr><tr><td> Medios de comunicación de las células endoteliales (ECM) </td><td></td><td></td><td> M199 con sales de Eagle suplementado con 16% de suero humano que contenía 100 unidades de penicilina 100 microgramos de estreptomicina y 0,3 mg de L-glutamine/ml </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina glutamato Estreptomicina (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi cámaras </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> Prepro Tech </td><td> 300-01A </td><td></td></tr><tr><td> Humano solución de albúmina al 20% </td><td> Gemini Bioproducts </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS sin Ca 2 + y Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> HBSS con Ca 2 + y Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions

Los neutrófilos son el tipo más abundante de glóbulo blanco. Ellos forman una parte esencial del sistema inmune innato 1. Durante la inflamación aguda, los neutrófilos son las primeras células inflamatorias para migrar a la zona de la lesión. El reclutamiento de los neutrófilos a un sitio de la lesión es un proceso gradual que incluye la dilatación en primer lugar, de los vasos sanguíneos para aumentar el flujo de sangre, en segundo lugar, los cambios estructurales microvasculares y escapar de las proteínas plasmáticas de la sangre, la adhesión en tercer lugar, de rodadura, y la transmigración de los neutrófilos a través de la endotelio; y cuarto acumulación de neutrófilos en el sitio de la lesión 2,3. Una amplia gama de in vivo e in vitro se ha desarrollado métodos para permitir el estudio de estos procesos 4. Este método se centra en la transmigración de neutrófilos a través de las células endoteliales humanas. Un método popular para el examen de los procesos moleculares implicados en la transmigración de neutrófilos humanos utiliza neutrophils que interactúan con las células humanas primarias endoteliales de vena umbilical (HUVEC) 5. Aislamiento de los neutrófilos se ha descrito en otros lugares visual 6, por lo que este artículo le mostrará el método de aislamiento de HUVEC. Una vez aisladas y cultivadas hasta confluencia, las células endoteliales se activan resultante en la regulación positiva de moléculas de adhesión y la activación. Por ejemplo, la activación de las células endoteliales con citocinas como el TNF-alfa resulta en aumento de E-selectina e IL-8 expresión 7. E-selectina media de captura y la rodadura de los neutrófilos y la IL-8 y media la activación firme adhesión de los neutrófilos. Después de los neutrófilos de adhesión transmigrar. Transmigración puede ocurrir paracellularly (a través de uniones de las células endoteliales) o transcellularly (a través de la célula endotelial sí mismo). En la mayoría de los casos, estas interacciones se producen bajo condiciones de flujo que se encuentran en la vasculatura 7,8. La cámara de la placa de flujo paralelo es un sistema ampliamente utilizado que mimicrófonos el cizallamiento hidrodinámico tensiones encontrado in vivo y permite el estudio de reclutamiento de neutrófilos bajo condición de flujo in vitro de 9,10. Varias empresas producir paralelas cámaras de flujo de placa y cada uno tiene ventajas y desventajas. Si fluorescente de imágenes que se necesita, vidrio o un polímero ópticamente similares necesita ser utilizado. Las células endoteliales no crecen bien en el vidrio. Aquí presentamos un método fácil y rápida para obtener imágenes de contraste de fases, DIC y fluorescencia de la transmigración de neutrófilos con un bajo volumen de diapositivas canal ibidi hecha de un polímero que se apoya la adhesión rápida y el crecimiento de las células endoteliales humanas y tiene propiedades ópticas que son comparables a vidrio. En este método, las células endoteliales se cultivaron y estimulada en una μslide ibidi. Los neutrófilos se presentó bajo condiciones de flujo y la migración se evaluó. Imagen fluorescente de las uniones activado en tiempo real determinación de la extensión de paracelular frentetranscelular la transmigración.

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K vistas.  University of Calgary. Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

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Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

El uso de la citometría de flujo para evaluar el estado de la cromatina en las células T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Estudio simultáneo de la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...