نشكر الدكتور بينا Colarusso والتصوير الخلية الحية مرفق على المساعدة التي قدموها مع التصوير وتحليل الصور، والسيدة Lailey للحصول على المساعدة الفنية لها، وحدة 51 في مستشفى التلال في كالغاري، أب لتوفير الحبل السري البشري. الدكتور د. باتل هو يبتدع ألبرتا: الصحة حلول عالم. وأيد هذا العمل من قبل منحة التشغيل من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة والمنح والمعدات والبنية التحتية من المؤسسة الكندية للإبداع والعلوم ألبرتا والسلطة البحوث.

1. العزلة وصيانة خلايا الإنسان بطانة الأوعية الدموية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تستخدم المستوى 2 إجراءات السلامة البيولوجية عند العمل مع الدم والأنسجة البشرية. قطع مقص باستخدام حبل من المشيمة ومن ثم النظر عن كثب في الحبل السري لتجلط الدم والأضرار الناجمة عن لقط الحبل أثناء الولادة. قطع وتجاهل هذه الأجزاء من الحبل السري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الطازجة حل كولاجيناز في 1 ملغ / مل بصب 50 مل من عازلة الحبل الدافئ في أنبوب يحتوي على 50 ملغ كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير في قفازات معقمة وفتح علبة تحتوي على صك مشبع cannulas حادة معقمة، والمشابك الحبل، ومقص، وثلاثة في اتجاه ووقف الديوك والشاش في رقائقي تدفق غطاء محرك السيارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على الشرايين اثنين والحاضر وريد واحد في السلك. الشرايين هي أصغر حجما وتميل الى ان تكون مقيدة بإحكام، في حين أن وريد كبير وسهل على يقني؛ يدخل القنية. تدفق الدم من الوريد، تضاف بلطف قنية مع محبس اتجاهين مرفقة به أناn لنهاية واحدة من الوريد ومكان المشبك حول قنية لأنه عقد بحزم في موقف. يروي العازلة سلك عن طريق الوريد. كرر حتى من خلال تدفق غير واضح ومن ثم المشبك في نهاية الحبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كولاجيناز يروي في الوريد، إغلاق محبس، ووضع الحبل في كوب دافئ العازلة التي تحتوي على النخاع واحتضانها لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقيقة، وإزالة الحبل السري وتدليك بلطف الحبل على تخفيف الخلايا البطانية من التجويف من الوريد. استنزاف المحلول في أنبوب يحتوي على وسائل الاعلام الخلية البطانية (ECM). مطاردة مع عازلة الحبل مرتين لإزالة الخلايا المتبقية. استنزاف الحل في الأنبوب نفسه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منبذة الخلايا في 350 XG لمدة 10 دقيقة لتكوير الخلايا البطانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف وإضافة 10 مل من ECM لبيليه. resuspend بلطف الخلايا في ECM، ثم نقل الخلايا إلى قارورة T75 قبل المغلفة مع 0.2٪ الجيلاتين. وقد تم ذلك قبل طلاء الجيلاتين مع ما لا يقل عن 1 ساعة على 37 درجة مئوية. تنمو الخلايا على 37 درجة مئوية و 5ثاني أكسيد الكربون بنسبة 2٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، هز بلطف القارورة لطرد أي خلايا الدم الحمراء إزالة ثم طاف وتغسل بمحلول هانك دافئ وملح متوازن (HBSS). إزالة HBSS وتغذية الخلايا مع 10 مل من ECM دافئ. فحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من أن تمت إزالة خلايا الدم الحمراء. تقييم درجة التقاء والصرف من الخلايا البطانية. وينبغي أن ممدود الخلايا البطانية في هذه المرحلة مع أي علامة على فجوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستمرار في تغيير وسائل الاعلام كل ثلاثة أيام حتى تصل إلى خلايا confluency، ثم انقسام الخلايا باستخدام محلول 0.08٪ من التربسين التي تحتوي على 1MM EDTA. لوحة الخلايا البطانية في أطباق المطلوب مسبقا المغلفة مع 0.2٪ الجيلاتين. وينبغي أن تصل إلى نقطة التقاء الخلايا في 3-6 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند استخدام ibidi الغرف، قبل معطف كل غرفة مع 0.2٪ الجيلاتين. إزالة الزائدة الجيلاتين وفبرونيكتين ثم إضافة 1.5 X 10 6 / مل من الخلايا البطانية علقت في ECM الى غرفة. تغيير وسائل الاعلام كل يوم آخر حتى جonfluent. وينبغي أن تكون خلايا متكدسة في 2-3 أيام اعتمادا على الحبل. </li></ol> 2. إعداد العدلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم عزل العدلات من الدم المحيطي من متطوعين من البشر الأصحاء باستخدام الطرد المركزي كثافة. ويمكن الاطلاع على بروتوكول مفصل مع مظاهرة البصرية للعزلة العدلة في هذه القضية في وقت سابق من هذه المجلة 6. المعزولة مرة واحدة، العدلات resuspend بتركيز 1x10 مل / 6 في HBSS تحتوي على الزلال البشري بنسبة 0.5٪. </li></ol> 3. إنشاء غرفة Ibidi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة خلايا بطانية في غرفة ibidi الجيلاتين المغلفة. فحص لهم كل يوم باستخدام المجهر النقيض من المرحلة حتى تصبح متجمعة بشكل محكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحفيز الخلايا البطانية لزيادة التعبير عن جزيئات الالتصاق والتنشيط. لأغراض هذا البروتوكول، وحفز الخلايا البطانية مع 10 نانوغرام / مل من المؤتلف TNF-α لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ <sub&gt; 2 قبل إعداد غرفة ibidi للتصوير في ظروف تدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير المجهر، ومضخة محقنة كما هو موضح من قبل بصريا فيسه وزملاؤه 11 باستخدام غرفة ibidi فارغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلافات الرئيسية بين هذا البروتوكول وإجراء فيسه وتشمل ما قبل ملء أنبوب لمنع التعرض للخلايا بطانية للهواء، والحفاظ على المنطقة العازلة عند 37 درجة مئوية باستخدام حمام ماء، وذلك باستخدام أنبوب PharMed للحفاظ على المنطقة العازلة من فقدان الحرارة، واستخدام مختلف أهداف على المجهر اعتمادا على ما إذا التصوير مع النقيض من مرحلة أو مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تم تعيين مجهر صعودا ويتم ملء الأنبوب مع HBSS، على مقربة من جميع الصمامات وإزالة غرفة ibidi فارغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الغرفة التي تحتوي على ibidi TNF-α حفز الخلايا البطانية للأنابيب. </li></ol> 4. العدلة التوظيف والتهجير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور أحادي الطبقة الخلية البطانية في microscمكتب مستشار رئيس الوزراء باستخدام النقيض من مرحلة 10X الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مضخة محقنة لسحب ويبدأ تدفق HBSS في إجهاد القص المطلوب (عادة ما بين 0.5 إلى 2 سم / DYN 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الجانب مدخل، والتحول من HBSS إلى العدلات المعزولة (1x10 6 / مل) من خلال تحويل الطريق لمدة ثلاثة وقف الديك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التسجيل باستخدام كاميرا CCD متصلة إما إلى مسجل DVD أو متصلة مباشرة إلى الكمبيوتر. بدء موقت عندما العدلات أدخل غرفة. يروي العدلات لمدة اربع دقائق. ما مجموعه 3 مل من تعليق العدلة كافية لتجربة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أربع دقائق، يعود مرة أخرى الى HBSS لمنع الحجز على العدلات جديد. إذا ما المطلوب بيانات عن التفاعلات الكلية، المتداول والتصاق شركة، صورة 6 حقول عشوائية لمدة 10 ثانية كل باستخدام النقيض مرحلة 10X الهدف بين 4 و 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحول إلى هدف وتسجيل 40X حقل واحد من عرض ما بين 5 و 10 دقائق. في 10 دقيقة، وجمعبين 5 و 10 حقول عشوائية من الرأي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف تدفق والانتقال إلى الغرفة التالية. </li></ol> 5. فلوري التصوير تحت ظروف تدفق باستخدام غرفة Ibidi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا البطانية التسمية أو العدلات مع التحقيق الذي تجريه فلوري من الفائدة. على سبيل المثال، يمكن استخدام الأجسام المضادة لمكافحة VE-كادهيرين مترافق إلى ترتيب، [547] لتصور تقاطعات الخلية البطانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجمع ibidi غرفة في المجهر مع تباين تدخل الفرق (DIC) وقدرات فلوري. نستخدم 1000 FluoView مبائر (أوليمبوس) مع غرفة البيئية. تركز باستخدام هدفا مصممة للعمل في مدينة دبي للإنترنت وفلوري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور في وقت واحد، ومدينة دبي للإنترنت فلوري باستخدام البرمجيات التي توفرها بائع بينما بعد الدورة مرة وصفها في الفقرة 4. </li></ol> 6. تحليل التوظيف العدلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصفت تحليل المتداول والتفاعل من قبل خلايا فيسه وآخرون 11. </lI&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس نسبة العدلات المتداول على أحادي الطبقة البطانية تحصي أعداد العدلات التي انتقلت أكثر من قطر خلية في الفترة من 5 ثوان. تقسيم هذا العدد من اجمالي عدد الكريات البيض في هذا المجال لتحديد نسبة الخلايا المتداول. وبالتالي، تعتبر الخلايا المتبقية تمسكا راسخا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس سرعة المتداول من العدلة عن طريق حساب المسافة العدلة سافر في فترة زمنية معينة ومن ثم تقسيمه في ذلك الوقت في ثوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحديد التهجير من قبل حساب عدد العدلات التي غيرت شكل وهاجروا تحت أحادي الطبقة 10. ويتم تحديد هذه العدلات من حقيقة ان يغيروا من كونها مرحلة مشرقة عندما على رأس أحادي الطبقة إلى مرحلة مظلما عندما تحت أحادي الطبقة 10. ويمكن التعبير عن عدد الخلايا transmigrated كنسبة مئوية من مجموع الخلايا في مجال الرؤية أو على شكل خدر الخامإيه من الخلايا transmigrated في وحدة المساحة. في هذا النظام النموذجي، وعادة 50٪ من العدلات transmigrate بعد 10 دقائق. </li></ol> 7. ممثل النتائج الخلايا البطانية Unstimulated لا تدعم تجنيد العدلات. في المقابل، وتنشيط الخلايا البطانية مع TNF-α النتائج في المتداول العدلة، التصاق وطيد والتهجير. ويرد مثال على هذه البيانات في الشكلين 1 و 2. الشكل 1A يظهر العدلات التفاعل مع TNF-α-حفز الخلايا البطانية. يمكن قياس هذه التفاعلات، وكشف عن عدد من العدلات التفاعل مع الخلايا البطانية، فضلا عن عدد من العدلات المتداول، وتمسكا راسخا أو transmigrated (الشكل 2). يمكن للهجرة العدلات تحدث في التقاطعات الخلية أو عن طريق الخلايا البطانية أنفسهم. للتمييز بين هذين الشرطين، وصفت الخلايا البطانية مع مضاد-C-VE<html> وسجل adherin الأجسام المضادة والتهجير كما يحدث paracellularly أو transcellularly (الشكل 1B و C). في هذا النموذج، وتقريبا جميع التهجير هو paracellular 7. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" /> الشكل 1. مدينة دبي للإنترنت في وقت واحد والتصوير مضان تحت ظروف تدفق باستخدام غرفة ibidi. (أ) صورة مدينة دبي للإنترنت معزولة حديثا العدلات البشرية المهاجرة عبر خلايا بطانة الوريد السري. رأس السهم الأصفر يظهر تمسكا العدلة، ورأس السهم الأبيض يظهر العدلة transmigrating. (ب) وملطخة تقاطعات الخلايا البطانية مع الأجسام المضادة لمكافحة VE-كادهيرين مترافق إلى ترتيب، [547] والمصورة. (ج) يظهر تراكب من قناة A و B كشف أن جميع transmigrating في هذا النموذج هو paracellular. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . _content &quot;&gt; <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" /> الشكل 2. تركت unstimulated الخلايا البطانية أو وحفز مع 10 نانوغرام / مل من TNF-α. بعد 4 ساعات، وتدفق لوحة موازية غرفة تجميعها وكانت perfused العدلات عبر DYN في 1 / سم 2. (أ) تم فحص التفاعلات العدلات وتقاس باستخدام يماغيج البرنامج من المعاهد الوطنية للصحة. وتميزت هذه الخلايا المتفاعلة مجموعها (B) المتداول، تمسكا راسخا أو transmigrating (C). البيانات تمثل الوسط ووزارة شؤون المرأة + من بين 3 و 5 من التجارب. وكان الفرق بين الرقابة وTNF في لوحات وجيم معنوية (P &lt;0.001).

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li><li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+rolling,+arrest,+and+transmigration+across+activated,+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b/CD18.">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Petri, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+LSP1+is+involved+in+endothelial+dome+formation,+minimizing+vascular+permeability+changes+during+neutrophil+transmigration+in+vivo.">Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo.</a> Blood. 117, 942-952 (2011).</li><li>Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+junctional+adhesion+molecule-C+promotes+neutrophil+transendothelial+migration+in+vitro+and+in+vivo.">The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+Protocol.">Neutrophil Isolation Protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+leukocyte+transmigration:+cell+surface+interactions+and+signaling+events.">Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events.</a> J. Immunol. 172, 7-13 (2004).</li><li>Alcaide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+under+shear+flow:+it's+all+about+endothelial+cell+rings+and+gaps.">Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps.</a> Microcirculation. 16, 43-57 (2009).</li><li>Jutila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neutrophil+adhesion+under+conditions+mimicking+blood+flow.">Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow.</a> Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).</li><li>Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+vitro+under+flow+conditions.">Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium.">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Petzelbauer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture.">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li><li>Bonder, C. S., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+leukocyte+recruitment+to+splanchnic+organs+to+reduce+inflammation.">Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation.</a> Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).</li><li>Cuvelier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells.">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li><li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials.">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

<html> وقد استخدم الباحثون بصورة روتينية الخلايا البطانية من أسرة الأوعية الدموية المختلفة لدراسة تجنيد العدلات والتهجير. ومن الأمثلة على ذلك، ولكنها لا تقتصر على، وخلايا الجلد بطانة الاوعية الدموية الدقيقة 12، الكبد الخلايا البطانية الجيبية 13 و الخلايا ال...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف والمعدات </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> كولاجيناز نوع 1 </td><td> ورثينجتون </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> حبل العازلة </td><td></td><td></td><td> التركيب: 140 مم كلوريد الصوديوم 4 مم بوكل 10 ملي مد الجلوكوز في ناه 2 PO 4 / نا 2 1MM العازلة 4 هبو في درجة الحموضة 7.4 </td></tr><tr><td> وسائل الإعلام الخلية البطانية (ECM) </td><td></td><td></td><td> M199 مع أملاح نسر تستكمل مع مصل الدم البشري 16٪ تحتوي على 100 وحدة من البنسلين 100 ميكروغرام من الستربتومايسين و 0.3 ملغ من L-glutamine/ml </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين جلتاميت الستربتوميسين (100X) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi الغرف </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> Prepro التقنية </td><td> 300-01A </td><td></td></tr><tr><td> الإنسان الزلال حل 20٪ </td><td> المنتجات الاحيائية الجوزاء </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS دون كا 2 + 2 + والمغنيسيوم </td><td> سيغما </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + </td><td> سيغما </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions

العدلات هي النوع الأكثر وفرة من خلايا الدم البيضاء. وهم يشكلون جزءا أساسيا من نظام المناعة الفطرية 1. أثناء التهاب حاد، العدلات هي خلايا التهابية 1 إلى الهجرة إلى موقع الإصابة. تجنيد العدلات إلى موقع الإصابة عملية متدرجة تشمل الأولى، تمدد الأوعية الدموية لزيادة تدفق الدم، وثانيا، تغييرات هيكلية الاوعية الدموية الدقيقة والهروب من بروتينات البلازما من الدم؛، المتداول 3 التصاق، والتهجير من العدلات في جميع أنحاء البطانة، ورابعا تراكم من العدلات في موقع الإصابة 2،3. وقد تطورت وهناك مجموعة واسعة من في والمجراة في المختبر طرق لتمكين دراسة هذه العمليات 4. هذه الطريقة تركز على هجرة العدلات عبر الخلايا البطانية الإنسان. أسلوب واحد شعبية لدراسة العمليات الجزيئية تشارك في التهجير العدلة يستخدم ن الإنسانeutrophils التفاعل مع الخلايا البشرية الأساسية بطانة الوريد السري (HUVEC) 5. وقد وصفت العدلة العزلة بصريا في مكان آخر 6؛ وبالتالي هذه المادة سوف تظهر طريقة لعزل HUVEC. عزل مرة واحدة ونمت لالتقاء، يتم تنشيط الخلايا البطانية مما أدى إلى upregulation من جزيئات الالتصاق والتنشيط. على سبيل المثال، تنشيط الخلايا البطانية مع السيتوكينات مثل TNF-α النتائج في زيادة selectin-E و IL-8 التعبير 7. E-selectin يتوسط التقاط والمتداول من العدلات و IL-8 تفعيل يتوسط والتصاق شركة من العدلات. بعد العدلات التصاق transmigrate. يمكن أن يحدث التهجير paracellularly (من خلال تقاطعات الخلية البطانية) أو transcellularly (من خلال الخلية البطانية نفسها). في معظم الحالات، وهذه التفاعلات تحدث في ظل الظروف الموجودة في تدفق 7،8 الأوعية الدموية. تدفق مواز لوحة الغرفة هو نظام يستخدم على نطاق واسع أن ميلميكروفونات الضغوط العثور على القص الهيدروديناميكية في الجسم الحي، وتمكن هذه الدراسة من تجنيد العدلات تحت حالة تدفق 9،10 في المختبر. العديد من الشركات تنتج مواز غرف تدفق لوحة ولكل منها مزاياه وعيوبه. اذا كانت هناك حاجة فلوري والتصوير، والزجاج أو البوليمر مماثلة بصريا يحتاج إلى استخدامها. الخلايا البطانية لا تنمو بصورة جيدة على الزجاج. هنا نقدم وسيلة سهلة وسريعة لتصوير التخلص النقيض من ذلك، ومدينة دبي للإنترنت فلوري من هجرة العدلات منخفض باستخدام قناة ibidi حجم الشريحة مصنوعة من البوليمر الذي يدعم التصاق السريع ونمو الخلايا البطانية الإنسان والصفات البصرية التي يمكن مقارنتها مع الزجاج. في هذه الطريقة، ونمت الخلايا البطانية وحفزت في μslide ibidi. وأدخلت في ظل ظروف تدفق العدلات وجرى تقييم التهجير. تمكين التصوير فلوري من تقاطعات في الوقت الحقيقي وتحديد مدى paracellular مقابلالعابر للهجرة.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions at JoVE.com

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

توضح هذه المقالة لأول مرة إجراء لعزل الخلايا البطانية الإنسان من عروق السري ثم يوضح كيفية استخدام هذه الخلايا لدراسة هجرة العدلات في ظل ظروف التدفق. باستخدام غرفة تدفق كميات قليلة مصنوعة من البوليمر مع الخصائص البصرية للزجاج، ويعيش خلية التصوير فلوري للسكان الخلية نادر ممكن أيضا.

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي واستخدامها في دراسة التهجير تحت ظروف تدفق العدلات

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

isolation-human-umbilical-vein-endothelial-cells-their-use-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K Views.  University of Calgary. توضح هذه المقالة لأول مرة إجراء لعزل الخلايا البطانية الإنسان من عروق السري ثم يوضح كيفية استخدام هذه الخلايا لدراسة هجرة العدلات في ظل ظروف التدفق. باستخدام غرفة تدفق كميات قليلة مصنوعة من البوليمر مع الخصائص البصرية للزجاج، ويعيش خلية التصوير فلوري للسكان ال...

Video: Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

تدفق التصاق الفحص لدراسة توظيف الكرية البيضاء لالكبدي الإنسان جيبية البطانة Endothelium تحت ظروف إجهاد القص

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

التصوير في الوقت الحقيقي من غشائي المفارق خلايا العدلات خلية أثناء التهجير تحت الفسيولوجية تدفق

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

في المختبر والمجراة نموذج لدراسة التصاق البكتيريا إلى سفينة ستريت تحت ظروف التدفق

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

استخدام التدفق الخلوي لتقييم حالة لونين في خلايا T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

الدراسة المتزامنة لتجنيد الوحيدات الفئات السكانية الفرعية تحت التدفق في الأنابيب

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...