אנו מודים לד&quot;ר פינה Colarusso לבין תא חי מתקן הדמיה על עזרתם עם הדמיה ניתוח התמונה: גב &#39;Lailey לקבלת סיוע טכני שלה, היחידה 51 בבית החולים שפלת בקלגרי, א.ב. למתן חבלי הטבור אדם. ד&quot;ר KD פאטל היא מתפתחת אלברטה: המדען Health Solutions. עבודה זו נתמכה על ידי מענק ההפעלה של המכון הקנדי למחקר בריאות מענקי ציוד ותשתיות מן הקרן הקנדית חדשנות המדע אלברטה רשות המחקר.

1. בידוד ותחזוקה של אדם לתאי אנדותל כלי דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמה 2 הליכים biosafety יש להשתמש בעת עבודה עם דם ברקמות האדם. מספריים חותכים את כבל מן השליה ולאחר מכן לבדוק מקרוב את חבל על קרישי דם ונזק נגרם על ידי לחיצה כבל במהלך הלידה. לגזור וזורקים אלה חלקים של חוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון collagenase טרי על 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ידי לשפוך 50 מ&quot;ל של חיץ כבל חם לתוך צינור המכיל 50 מ&quot;ג collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה לתוך כפפות סטריליות ולפתוח מגש כלי autoclaved המכיל cannulas קהים מעוקרות, Clamps חוט, מספריים, 3-way Stop-תרנגולים גזה בשכונה זרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות את שני העורקים וההווה וריד אחד בחוט. העורקים הם קטנים נוטים להיות מכווץ בחוזקה, בעוד וריד גדול וקל cannulate. כדי לשטוף את הדם מעורק, בעדינות להכניס צינורית עם שסתום דו כיווני קשור אליו אניn כדי קצה אחד של הווריד ומקום מלחציים סביב צינורית להחזיק אותו היטב במצב. Perfuse חיץ כבל דרך הווריד. חזור על הפעולה עד לזרום דרך ברורה, ואז להדק את קצה החוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Collagenase Perfuse לווריד, לסגור את שסתום, מקם את כבל לתוך מבחנה המכילה מאגר כבל דגירה חמים למשך 10 דקות. אחרי 10 דקות, הסר את כבל לעסות בעדינות את כבל כדי לשחרר לתאי אנדותל של לומן של הווריד. מסננים את הפתרון לתוך צינור המכיל מדיה תא האנדותל (ECM). לשטוף עם חיץ כבל פעמיים כדי להסיר את התאים הנותרים. מסננים את הפתרון לתוך צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה תאים ב XG 350 במשך 10 דקות עד גלולה לתאי אנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ&quot;ל של ECM על גלולה. בעדינות resuspend התאים ECM, ואז להעביר את התאים בקבוק T75 מראש מצופה עם 0.2% ג&#39;לטין. מראש עם ציפוי ג&#39;לטין נעשה במשך שעה לפחות 1 ב 37 ° C. לגדל את התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לנער את הבקבוק בעדינות כדי לסלק את כל כדוריות דם אדומות ולאחר מכן להסיר את supernatant לשטוף עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק חם (HBSS). הסר HBSS ולהאכיל את התאים עם 10 מ&quot;ל של ECM חם. לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ על מנת להבטיח כי תאי דם אדומים הוסרו. להעריך את מידת מפגש ומורפולוגיה של בתאי האנדותל. לתאי אנדותל בשלב זה צריך להיות מוארך ללא כל סימן של vacuoles. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך לשנות את התקשורת כל שלושה ימים עד אשר התאים מגיעים confluency, פיצול תאים ולאחר מכן באמצעות פתרון של 0.08% טריפסין המכיל EDTA 1 מ&quot;מ. בתאי אנדותל פלייט בצלחות הרצויות מראש מצופה 0.2% ג&#39;לטין. תאים צריך להגיע למפגש ב 3-6 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת שימוש בתאי ibidi, מעיל מראש כל תא עם 0.2% ג&#39;לטין. הסרת עודפי ג&#39;לטין ו fibronectin ולאחר מכן להוסיף 1.5 X 10 6 / mL של בתאי האנדותל המרחפים ECM לתוך החדר. לשנות את התקשורת כל יומיים עד גonfluent. תאים צריכים להיות confluent ב 2-3 ימים, תלוי בחוט. </li></ol> 2. הכנת נויטרופילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נויטרופילים בודדו מדם היקפי של אדם מתנדבים בריאים בעזרת צנטריפוגה צפיפות. פרוטוקול מפורט עם הדגמה חזותית בידוד נויטרופילים ניתן למצוא בגיליון קודם של היומן הזה 6. מבודדים פעם, נויטרופילים resuspend בריכוז של 1x10 מ&quot;ל / 6 ב HBSS המכילים אלבומין אנושי 0.5%. </li></ol> 3. הקמת לשכת Ibidi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול לתאי אנדותל בתא ibidi ג&#39;לטין מצופה. לבחון אותם מדי יום באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב עד שהם הופכים confluent בחוזקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר את התאים אנדותל להגדיל את הביטוי של מולקולות הדבקה והפעלה. למטרות פרוטוקול זה, לתאי אנדותל היו מגורה עם 10 ng / mL רקומביננטי של TNF-α במשך ארבע שעות ב 37 ° C ו-CO 5% <sub&gt; 2 לפני הקמת חדר ibidi הדמיה בתנאי זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המיקרוסקופ, ואת משאבת מזרק כמתואר חזותית על ידי ויזה ועמיתיו 11 באמצעות תא ריק ibidi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההבדלים העיקריים בין פרוטוקול זה הליך ויזה כוללים מראש למלא צינורות, כדי למנוע חשיפה של תאים אנדותל אוויר, שמירה על מאגר של 37 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים, באמצעות צינור PharMed לשמור על חיץ בין לאבד את הטמפרטורה באמצעות אחר מטרות על המיקרוסקופ תלוי אם הדמיה עם ניגודיות שלב או פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המיקרוסקופ הוא להגדיר את צינור מלא HBSS, לסגור את כל והברזים למיניהם ולהסיר את החדר ריק ibidi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר לשכת ibidi המכיל TNF-α גירוי בתאי האנדותל כדי צינורות. </li></ol> 4. גיוס גלגול נשמות נויטרופילים ו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו monolayer תא האנדותל ב microscאופ באמצעות המטרה 10x לעומת שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את משאבת מזרק לסגת ולהתחיל את זרימת HBSS על הלחץ גזירה הרצוי (בדרך כלל בין 0.5-2 ס&quot;מ / Dyn 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצד כניסת, לעבור מן HBSS כדי נויטרופילים מבודדים (1x10 6 / ml) על ידי סיבוב משולש הפסקת הזין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הקלטה באמצעות מצלמת ה-CCD מחובר או כדי מקליט DVD או מחובר ישירות למחשב. הפעל את שעון העצר כאשר הנויטרופילים להיכנס לחדר. Perfuse נויטרופילים במשך ארבע דקות. סך של 3 מ&quot;ל של השעיה נויטרופילים מספיק עבור ניסוי בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי ארבע דקות, לחזור HBSS כדי למנוע את הקובץ המצורף של נויטרופילים חדשים. אם הנתונים עבור אינטראקציות הכל, התגלגלו הדבקה החברה הם הרצוי, 6 שדות תמונה אקראית למשך 10 שניות כל אחד באמצעות המטרה 10x לעומת זאת בשלב דקות בין 4 ו -5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למטרה 40X ולהקליט שדה אחד של נוף בין 5 ל 10 דקות. לאחר 10 דקות, לאסוףבין 5 ל 10 שדות אקראיות של תצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את זרימת ולעבור לחדר הבא. </li></ol> 5. דימות פלואורסצנטי בתנאי זרימה באמצעות לשכת Ibidi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית לתאי אנדותל או נויטרופילים עם החללית ניאון של עניין. כך, למשל, נוגדנים נגד VE-cadherin מצומדות ל-Alexa [547] ניתן להשתמש כדי להמחיש צמתים תא האנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב חדר ibidi על מיקרוסקופ עם ניגודיות ההפרש התערבות (DIC) ויכולות ניאון. אנחנו משתמשים 1000 FluoView confocal (אולימפוס) עם תא הסביבה. פוקוס באמצעות המטרה המיועדת עבודה DIC ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות הקית&quot;ם ניאון בו זמנית באמצעות תוכנה המסופקת על ידי ספק תוך ביצוע מהלך הזמן המתואר בסעיף 4. </li></ol> 6. ניתוח של גיוס נויטרופילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח מתגלגל ואינטראקציה תאים מתואר על ידי ויזה ואח&#39; 11. </lאני&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את אחוז נויטרופילים מתגלגל על ​​monolayer האנדותל לספור את מספר הנויטרופילים אשר עברו יותר בקוטר תא לתקופה של 5 שניות. מחלקים את המספר הזה של המספרים הכוללים של leukocytes בתחום על מנת לקבוע את אחוז התאים מתגלגל. ובהרחבה, התאים הנותרים נחשבים חסיד בתוקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את מהירות גלגול של נויטרופילים על ידי חישוב המרחק נויטרופילים נסע פרק זמן מסוים ולאחר מכן וחלוקתו ב אז בתוך שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלגול נקבע על פי ספירת הנויטרופילים שעברו שינוי צורה להעביר מתחת monolayer 10. נויטרופילים אלו מזוהים על ידי העובדה כי הם משתנים מלהיות בשלב בהיר כאשר על גבי monolayer להיות כהה בשלב כאשר מתחת monolayer 10. מספר תאים transmigrated ניתן לבטא כאחוז התאים הכל בתחום הראייה או תחושה גלםאה של תאים transmigrated ליחידת שטח. במערכת מודל זה, בדרך כלל 50% נויטרופילים מתגלגלות לאחר 10 דקות. </li></ol> 7. נציג תוצאות לתאי אנדותל Unstimulated אינם תומכים בגיוס נויטרופילים. לעומת זאת, גירוי לתאי אנדותל עם TNF-אלפא גורם נויטרופילים מתגלגל, הדבקה איתן גלגול. דוגמה של נתונים אלה מוצגת במספרים 1 ו -2. איור 1 א מראה נויטרופילים אינטראקציה עם TNF-α-מגורה לתאי אנדותל. אינטראקציות אלה ניתן לכמת, חושף את המספר הכולל של נויטרופילים באינטראקציה עם לתאי אנדותל, כמו גם מספר הנויטרופילים מתגלגל, חסיד בתוקף או transmigrated (איור 2). גלגול נויטרופילים יכול להתרחש בצמתים התא או דרך בתאי האנדותל עצמם. כדי להבדיל בין שני מצבים, לתאי אנדותל מסומנים עם אנטי VE-C<html> נוגדנים adherin ואת גלגול הוא הבקיע כפי שקורה paracellularly או transcellularly (איור 1B ו-C). במודל זה, כמעט כל גלגול הוא paracellular 7. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" /> באיור 1. DIC סימולטני דימות פלואורסצנטי בתנאים זרימה באמצעות תא ibidi. (א) התמונה DIC מבודד טרי נויטרופילים אדם נודדים על פני תאים אנושיים וריד הטבור אנדותל. ראש חץ צהוב מראה נויטרופילים חסיד, ראש חץ לבן מראה נויטרופילים מתגלגלת. (ב) צמתים תא האנדותל הוכתמו נוגדנים נגד VE-cadherin מצומדות ל-Alexa [547] וכן הדמיה. (ג) מראה כיסוי של ערוץ A ו-B עולה כי כמעט כל מתגלגלת במודל זה paracellular. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . _content &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" /> איור 2. לתאי אנדותל נותרו unstimulated או היו מגורה עם 10 ng / mL של TNF-α. לאחר 4 שעות, חדר במקביל זרימת צלחת הורכב ו נויטרופילים היו perfused לעבר Dyn 1/2 ס&quot;מ. (א) אינטראקציות נויטרופילים נבדקו ונמדדו באמצעות ImageJ תוכנה NIH. התאים אינטראקציה בסך הכל היו לאפיין מתגלגל (ב &#39;), חסיד בתוקף או (ג) מתגלגלת. הנתונים מייצגים + SEM ממוצע של בין 3 ל 5 ניסויים. ההבדל בין שליטה TNF ב לוחות ו-C היה משמעותי (p &lt;0.001).

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li><li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+rolling,+arrest,+and+transmigration+across+activated,+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b/CD18.">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Petri, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+LSP1+is+involved+in+endothelial+dome+formation,+minimizing+vascular+permeability+changes+during+neutrophil+transmigration+in+vivo.">Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo.</a> Blood. 117, 942-952 (2011).</li><li>Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+junctional+adhesion+molecule-C+promotes+neutrophil+transendothelial+migration+in+vitro+and+in+vivo.">The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+Protocol.">Neutrophil Isolation Protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+leukocyte+transmigration:+cell+surface+interactions+and+signaling+events.">Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events.</a> J. Immunol. 172, 7-13 (2004).</li><li>Alcaide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+under+shear+flow:+it's+all+about+endothelial+cell+rings+and+gaps.">Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps.</a> Microcirculation. 16, 43-57 (2009).</li><li>Jutila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+neutrophil+adhesion+under+conditions+mimicking+blood+flow.">Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow.</a> Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).</li><li>Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+vitro+under+flow+conditions.">Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium.">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Petzelbauer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture.">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li><li>Bonder, C. S., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+leukocyte+recruitment+to+splanchnic+organs+to+reduce+inflammation.">Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation.</a> Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).</li><li>Cuvelier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells.">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li><li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials.">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

<html> החוקרים השתמשו באופן קבוע לתאי אנדותל של כלי הדם מיטות שונות ללמוד גיוס גלגול נויטרופילים ו. דוגמאות כוללות, אך לא רק, עורי לתאי אנדותל כלי הדם, 12 סינוסי הכבד ותאי אנדותל 13 ותאי האנדותל מווריד הטבור האדם 10. ביניהם HUVEC לפופולריות רחבה בגלל הקלות היח...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב וציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Collagenase סוג 1 </td><td> וורטינגטון </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> כבל חיץ </td><td></td><td></td><td> הרכב: 140 מ&quot;מ NaCl 4 מ&quot;מ KCl 10 mM D-גלוקוז במאגר 1mm לאא 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 ב-pH 7.4 </td></tr><tr><td> פלאפון תקשורת אנדותל (ECM) </td><td></td><td></td><td> M199 עם מלחים נשר השלימו עם סרום אנושי 16% המכיל 100 יחידות של פניצילין 100 מיקרוגרם של סטרפטומיצין ו 0.3 מ&quot;ג L-glutamine/ml </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין גלוטמט סטרפטומיצין (100x) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi בתאי </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> Prepro טק </td><td> 300-01A </td><td></td></tr><tr><td> הפתרון האנושי 20% אלבומין </td><td> מזל תאומים Bioproducts </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS ללא Ca 2 + ו - Mg 2 + </td><td> סיגמא </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> HBSS עם Ca 2 + ו - Mg 2 + </td><td> סיגמא </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions

הנויטרופילים הם סוג השכיח ביותר של תא דם לבן. הם מהווים חלק בלתי נפרד של מערכת החיסון המולדת 1. במהלך דלקת חריפה, הנויטרופילים הם תאים דלקתיים הראשונים לעבור באזור הפציעה. גיוס של נויטרופילים לאתר הפציעה הוא תהליך הדרגתי, הכולל התרחבות 1, של כלי הדם כדי להגביר את זרימת הדם, השנייה, שינויים מבניים כלי הדם ולברוח של חלבונים פלזמה מזרם הדם, 3, הדבקה מתגלגל, גלגול של נויטרופילים פני האנדותל, ו 4 הצטברות נויטרופילים באתר הפגיעה 2,3. מגוון רחב של in vivo ו בשיטות חוץ גופית התפתח כדי לאפשר את לימוד התהליכים האלה 4. שיטה זו מתמקדת גלגול נויטרופילים פני לתאי אנדותל אנושיים. שיטה פופולארית לבחינת התהליכים המולקולריים המעורבים גלגול נויטרופילים מנצל n אדםeutrophils אינטראקציה עם תאים ראשוניים אדם וריד הטבור אנדותל (HUVEC) 5. בידוד נויטרופילים תוארה חזותית במקום אחר 6, ולכן מאמר זה יציג את שיטת הבידוד של HUVEC. מבודדים אחת גדלה המפגש, בתאי האנדותל מופעלים וכתוצאה מכך הגברת הביטוי של מולקולות הדבקה והפעלה. כך, למשל, הפעלה של תאים אנדותל עם ציטוקינים כגון TNF-אלפא גורם selectin-E מוגברת IL-8 הביטוי 7. E-selectin מתווכת ללכוד וגלגול של נויטרופילים ו IL-8 מתווכת הפעלה הידבקות חברה של נויטרופילים. לאחר הידבקות הנויטרופילים מתגלגלות. גלגול יכול להתרחש paracellularly (דרך צמתים תא האנדותל) או transcellularly (דרך תא האנדותל את עצמו). ברוב המקרים, אינטראקציות אלה מתרחשות בתנאים תזרים שנמצאו 7,8 בכלי הדם. החדר במקביל זרימת צלחת היא מערכת בשימוש נרחב כי mimics גזירה הידרודינמית מדגיש למצוא vivo ומאפשרת לימוד גיוס נויטרופילים בתנאי זרימת במבחנה 9,10. מספר חברות לייצר במקביל הזרימה לתאי צלחת וכל אחד מהם יש יתרונות וחסרונות. אם ניאון הדמיה יש צורך, זכוכית או פולימר דומה אופטית צריך לשמש. בתאי האנדותל אינם גדלים היטב על זכוכית. כאן אנו מציגים שיטה קלה ומהירה הדמיה שלב לעומת זאת, DIC ו הניאון של גלגול נויטרופילים באמצעות בנפח נמוך ibidi ערוץ שקופיות עשוי פולימר, אשר תומך הידבקות מהירה וצמיחה של תאים אנדותל אנושיים ויש לו תכונות אופטיות, כי הם דומים זכוכית. בשיטה זו, בתאי האנדותל גדלו ועורר ב μslide ibidi. נויטרופילים הוכנסו בתנאים הזרימה ואת גלגול הוערך. הדמיה הניאון של צמתים לאפשר בזמן אמת קביעת היקף paracellular לעומתtranscellular גלגול.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions at JoVE.com

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

isolation-human-umbilical-vein-endothelial-cells-their-use-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K Views.  University of Calgary. מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא...

Video: Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

השימוש בcytometry הזרימה מנת להעריך את המצב של הכרומטין בתאי T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...