この作品は、 &quot;インターフェイスの炎症&quot;エクセレンスのDFG-クラスター（RA-IF、RA-D）によってサポートされていました。我々は、クリスティンWischnatの優れた技術支援に感謝しています。

1。 クラミジア·トラコマチス血清型Dストックの調製<ol><li> 4ミリリットルCとしたHeLa-229細胞を含むコンフルエント175cm 2の細胞培養フラスコを感染させるバッファをSPGのでクラミジア D。 </li><li>一定の揺れの間に37℃で1時間インキュベートする。 </li><li> 10％FCS、240μlのシクロヘキシミドと20ミリリットルDMEMを追加します。 </li><li> °C、5％CO 2、37で48時間加湿インキュベーター中でインキュベートします。 </li><li> C.をデタッチし、破壊するために、5 mlの滅菌ガラスビーズ、強い揺れを追加します。 HeLa細胞-229細胞をかくまっトラコマチス 。 </li><li>上清を収集し、滅菌したガラスビーズの別の5ミリリットルを追加します。 </li><li> 1分間ロック三回は、すべてのHeLa-229細胞を破壊し、リリースCにトラコマチス 。 </li><li> 1000年RPMIと4で5分間遠心°C細胞の破片を取り除くために。 </li><li>コンフルエントgをフラスコ8から10 175cm 2の培養細胞の感染上清を回収HeLa細胞229細胞とrown。 </li><li> 4 mlのSPGバッファと37℃で一時間前の​​感染から4 mlの上清°一定に振とうしながらCを持つすべてのフラスコをインキュベートします。 </li><li> 1時間10％FCS、37℃、5％CO 2で48時間インキュベートし、続いて230μLシクロヘキシミドと15ミリリットルDMEMを追加した後。 </li><li> 5ミリリットル滅菌ガラスビーズを追加し、Cを切り離し、破壊するために振るHeLa細胞-229細胞をかくまっトラコマチス 。 </li><li>上清を収集し、滅菌したガラスビーズの別の5ミリリットルを追加します。 </li><li> 1分間ロック三回は、すべてのHeLa-229細胞を破壊し、リリースCにトラコマチス 。 </li><li> 4 1000 RPMIで5分間遠心°Cは、細胞の破片を取り除くために。 </li><li>上清を収集します。 </li><li> 50ミリリットルのファルコンチューブに上清を40ml、11000 RPMI 99分間遠心を記入してください。 </li><li>遠心分離後、上清を捨て、1 mlのSPGバッファーでペレットを洗浄する。 </li><li>ホモジナイズペレット-70 1、5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブ、店舗°Cを使用するまでに1 mlのSPGとアリコートを20μlインチ準備された株式の生物学的活性が確立されたHeLa-229細胞感染モデルにおいて確認された。 </li></ol> 2。ヒト卵管の調製<ol><li>すぐにRPMI準備まで、4で抗生物質を含まない°C、5％FCSを含むで手術後に子宮摘出術を受ける女性から店のヒト卵管（HFT）。プロトコルは、リューベック大学（09から153）の倫理委員会によって承認されました。研究に含まれていた女性（53歳まで34）は前のCの既往はなかったクラミジア感染症。卵管の組織は、帝王切開時または黄体期に症候性子宮筋腫による子宮中の母親のリクエストに応じて周産期滅菌で採取した。すべてのHFTは、Cに対して陰性であったPCR法によるクラミジア 。 </li><li>を含むRPMIを含むペトリ皿にHFTを分析抗生物質を含まない5％FCS。全体の処理中に組織が乾燥を防ぐために、メディア内に浸漬する必要があります。 </li><li>カットオフと手術中に破壊された結合組織と組織を破棄します。 </li><li>解剖した後に小さなメスで慎重にHFTを開きます。 </li><li>さらなる実験が1cm×1 cmに0.5cmの大きさに×0.5 cmの組織片を準備します。 </li><li>抗生物質を含まない5％FCSを含むRPMI 1ミリリットルの感染ストアHFT標本のために。 HFT検体はC.の5.5x10 5 IFU（インクルージョン形成単位）に感染していたトラコマチス 。 </li><li> 37 HFT試料をインキュベート°C、5％CO 2、21％O 2と同様に37°C、5％CO 2および2％で24時間O 2。 </li><li>インキュベーション時間の後に4で少なくとも3日間モンティの固定の標本や店舗を集める°SEM / TEMの準備までのC。 </li></ol> 3。 TEM用HFT試料の調製<ol><li>のためにTEMはモンティの固定から標本を削除して、4×5 mmの部分に2×2ミリメートルを切る。残りの組織は、SEMに使用することができます。 </li><li> 1時間カコジル酸ナトリウム緩衝液、pH 7.35の部分を洗う。 </li><li>アクアdestに1％（w / v）の四酸化オスミウムでインキュベートする。一晩。 </li><li>カコジル酸ナトリウム緩衝液、pH 7.35で6x5分を洗浄することによって過剰な四酸化オスミウムを削除します。 </li><li>水の中のエタノールの濃度を増加させ（v / v）の（2時間で30％、2時間、40％、2時間の50％、2時間で60％、夜70％以上、2の80％でインキュベートすることにより水を除去H、1時間の90％、1時間の95％、1時間の100％。 </li><li>酸化プロピレンの2×15分間エタノールを洗い流し、その後、50％の混合物（v / v）のプロピレンの新たに調製したアラルダイト（すべてのコンポーネントを含む）に転送し、一晩インキュベートする。 </li><li>少なくとも1時間、新たに調製したアラルダイト（すべてのコンポーネントを含む）に転送されます。 </li><li>平坦な埋め込み金型に移し、アラルダイトで記入してください。 </li><li>アラルダイト硬化のためにしましょう60°Cで少なくとも48時間</li><li>埋め込まれたサンプルのトリミング後のガラスナイフまたは基くダイヤモンドナイフを使用して、ウルトラミクロトームで、半薄切片（700 nm）をカットし、リチャードソン染色で染色される。 </li><li>ダイヤモンドナイフと銅グリッド（例えば150平方メッシュ）への転送を用いた超薄切片（約70 nm）を切り取ります。 </li><li>アクアdestに0.5％（w / v）の酢酸ウラニルで超薄切片を染色する。 3％（w / v）のアクアdestにクエン酸鉛に続く。自動セクション·シュタイナーインチまた、セクションはアクアdestに酢酸ウラニルの飽和遠心分離ソリューションにグリッド15分を残して、手動で染色することができます。アクアdestに0.3％クエン酸鉛（w / v）に続く。 </li></ol> 4。 SEMのHFT検体の調製<ol><li> SEMのためにモンティの固定、1.5×1cmのコルクシートや昆虫針を使用してフィックスの位置で上向きに直面している上皮と東洋から標本を削除します。 </li><li>適当な金属バスケットにコルクに試料を移し、カコジル酸ナトリウム緩衝液、pH 7.35で30分間洗浄する。 </li><li>アセトン/水混合物の濃度の増加（v / v）の6時間で30％、6時間の40％、8時間で60％、夜70％以上、2時間、80％、90％の試料をインキュベートすることによって水を除去一晩で2時間、100％（試料が連続的に水没しておくことは非常に慎重である）。 </li><li>臨界点乾燥（温度40℃、圧力80バール）により新鮮な100％アセトンおよび乾燥標本に転送されます。 </li><li>導電性カーボンセメントを用いた導電性カーボンのタブを備えたSEM試料マウントに上向き上皮で針、コルクと接着剤の試験片を取り外します。マウントと導電性カーボンのタブの間に導電性を高めるために液体の導電性の銀を使用しています。 </li><li>スパッタコーターを用いて試料の導電性白金、金またはパラジウムコーティングを準備します。 </li></ol> 5。リチャードソンのステインセミ薄切片の染色<ol><li>スライド上半薄切片を乾燥させます。 </li><li> 1〜2分間60℃で染色溶液でセクションを染色。 </li><li>アクアdestに洗ってください。 </li><li>乾燥したセクションとカバースリップ。 </li></ol> 6。代表的な結果人間の卵管の感染症モデルの中で我々は、非感染コントロール（ 図1）とCの間の上皮形態の違いを視覚化することができましたマティス -正常酸素条件下で感染したチューブ（ 図2）。特徴的な形態の違いが非感染コントロールでは検出できなかった卵管上皮細胞の病原体誘起膨潤および溶解を示唆した。半薄切片を透過型電子顕微鏡を用いて、我々は細胞内のCを証明することができました非感染コントロール（ 図4）にヒト卵管組織（ 図3、5）感染はなく、ex vivoでのクラミジア封入体形成。酸素濃度として女性の生殖管のtionsは、我々はまた、低酸素条件下で我々のモデルを検討し、炎症過程で生理的条件下で11、さらに減少の下で既に低くなっています。予備的な結果は、モデルが酸素濃度を変化させることでクラミジアの成長と子孫を分析するのに有用であることを示します。クラミジアによって誘導される上皮細胞の損傷は感染症（ 図6）の前に卵管の無謀な準備と処理を介して媒介される成果物から分離する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="図1" /> 一日のインキュベーション後、非感染ヒト卵の図1走査型電子顕微鏡（SEM）は、コントロール培地（緑色の矢印が繊毛細胞、青色の矢印を表示、非繊毛細胞を示す）。 <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="図2" /> 図2走査電子マイクロ<html> ex vivoでのC.トラコマティス感染したヒト卵管一日感染後（白い矢印マーク破裂インクルージョン）のコピー（SEM）。 <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。セミ薄いセクションでは、Cと人間の卵管の感染後に典型的な細胞内封入体（白矢印）1Dを表示クラミジアエクスビボ 。 <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="図4" /> 図4：コントロール培地中で一日のインキュベーション後、非感染ヒト卵管の透過型電子顕微鏡（TEM）。 <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="図5" /> 図5 のex vivoでの透過型電子顕微鏡（TEM） クラミジアは、ヒトの卵管一日感染後（白矢印はクラミジア封入体にマークを付ける）を感染させた。 ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="図6" /> 図6。無謀な準備と検体の取り扱い（白い矢印マークは、上皮組織の破壊）を使用して破損して卵管上皮の走査電子顕微鏡（SEM）。

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	<li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping.">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li><li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility.">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li><li>Peipert, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Genital+chlamydial+infections.">Clinical practice. Genital chlamydial infections.</a> N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).</li><li>Mardh, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubal+factor+infertility,+with+special+regard+to+chlamydial+salpingitis.">Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).</li><li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells.">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55 (2006).</li><li>Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gamma+interferon-mediated+antichlamydial+defense+mechanisms+in+human+and+mouse+cells.">Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells.</a> Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li><li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection.">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li><li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo.">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li><li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin.">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li><li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring.">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

感染組織への病原体によって誘発される損害の可視化は困難とマウスの実験手順にしばしば制限されています。我々 は 、C を分析するために人間の卵管にex vivoでの感染モデルを確立上部の雌の生殖器のクラミジア感染症。この方法を使用することによって、我々はC.を可視化することができましたマティス -一日後の感染内の人間卵管上皮に起因する損傷。携帯電話の腫れや溶解はC で観察された典型的な形態変化であったマティス -非感染コントロールの感染卵管はありません。 TEM分析は、再分化した小学校の体だけでなく、永続性を示している可能性があります拡大して網目状の本体と小さい介在物の大型介在物を示す、クラミジアは、感染した組織内に典型的な細胞内発育周期を実装することを明らかにした。しかし、単独で形態学的画像は、REPLを区別するのに十分ではありません減少し代謝を特徴としていicatingと永続的な感染症は、抗菌剤10に抵抗を増加させた。 感染した卵管の上皮の破壊は 、Cの破壊のいずれかによるものであるマティス -細胞内の発育サイクルや感染小学校団体のリリースや炎症性サイトカイン8のリリースが完了した後、感染した上皮細胞。病原体によって誘発される組織の損傷および Cに対する宿主によって誘導される免疫反応クラミジアは、上皮細胞機能の喪失、線維芽細胞のリモデリングおよび in vivo 8,11 で最後に卵管不妊につながる大きな要因であると考えられている。 このモデルの大きな制限の1つは、最初のCに二次的効果の分析を阻害する炎症性細胞の不在である卵管上皮のクラミジア感染症。しかし、このモデルはapです。異なる環境条件（例えば、酸素含有量）と急性Cの最初のホスト·免疫応答を調査するためにpropriate クラミジア感染症8,9。さらに計画ではC.に対する抗菌薬のテストのためのモデルを確立することです。全体の人間の卵管にクラミジアと2光子レーザー走査顕微鏡による卵管上皮で観察された別の発達段階の代謝状態を特徴づける。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-8​​02 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPGのバッファ</td><td>さまざまな</td><td></td><td>以下のレシピを参照してください。 </td></tr><tr><td>モンティの固定</td><td>さまざまな</td><td></td><td>以下のレシピを参照してください。 </td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム緩衝液</td><td>さまざまな</td><td></td><td>以下のレシピを参照してください。 </td></tr><tr><td> Richardsonの染色</td><td>さまざまな</td><td></td><td>以下のレシピを参照してください。 </td></tr></tbody></table>レシピ： 1。 SPGのバッファ<ol><li> 75グラムのショ糖を追加します。 </li><li> 2.47グラムリン酸二ナトリウムを追加します。 </li><li> 0.36グラムナトリウム、リン酸を追加します。 </li><li> 0.72グラムグルタミン酸を追加します。 </li><li>アクアdestが1 lに記入してください。 </li><li> 7.3にpHを調整します。 </li></ol> 2。 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液、7.35。 <ol><li> 42.80グラムジメチルヒ酸ナトリウム塩を追加します。 </li><li> 68.46グラムのショ糖を追加します。 </li><li>アクアdestが1 lに記入してください。 0.2 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を取得します。 </li><li>アクアをdestで希釈した溶液を使用する前に。所望の濃度にし、必要に応じて7.35にpHを調整します。 </li></ol> 3。モンティの固定<ol><li> 156ミリリットル0.12 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を追加します。 3.2アクアdestに25ミリリットル25パーセントタルジアルデヒドを追加します。 </li><li> 19ミリリットルを追加します。アクアdestに10％のパラホルムアルデヒド。 </li><li>アクアdestに3ミリリットル三パーセントCaCl 2を追加します。 </li><li> 7.35にpHを調整し、水をdestに記入してください。 312ミリリットル最終的な解決に。 </li></ol> 4。リチャードソンの染色<ol><li>アクアdestの1％水溶液ホウ砂溶液と1％アズールIIで1％メチレンブルーの等しい部分を混在させること。 </li></ol>

a human fallopian tube model for investigation of c. trachomatis infections

クラミジアトラコマチス（C.トラコマティス ）と生殖器感染症は最も頻繁には、世界中の女性に性的に病気を送信されます。病原体の非効率的なクリアランスや永続性は上部生殖管の感染を昇順と感染組織1,2に慢性炎症性損傷を引き起こすことになっているにつながる可能性があります。その結果、骨盤内炎症性疾患（PID）、卵管閉塞と不妊のような重篤な臨床的後遺症は3,4を発生する可能性があります。 Cとの研究のほとんどクラミジアは、上皮細胞株（例えば、HEp-2細胞およびHeLa-229）または、マウスで実施されている。しかし、細胞培養ベースのモデルと同様に、彼らはどちらもネイティブの組織の生理機能やCの病態を反映しません。 in vivoで 5 のクラミジア性器感染症。さらに制限が事実によって与えられている中央のシグナル伝達カスケード（例えば、IFN-γmediat細胞内のクラミジア増殖を制御ED JAK / STATシグナル伝達経路）は、基本的にマウスとヒト6,7の間で異なる。我々や他したがって、Cの間の直接的な相互作用を調査するために全体の臓器卵管モデルを確立クラミジアと人間の卵管細胞のex vivoで 8,9。 この目的のために、子宮摘出術を受ける女性からのヒト卵管は、Cで収集し、感染したトラコマチス 24時間感染後以内に血清D.、 クラミジア·トラコマチスを検出するために走査型電子顕微鏡（SEM）および透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて分析試料は同様にCなどの上皮損傷を媒介卵組織内のクラミジア封入体形成。

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A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

我々は、説明します<em&gt; ex vivoでの感染</em人間の卵管細胞を用いた細菌の病原体からの直接的な相互作用の可視化のために&gt;モデル。全体の臓器組織モデルは、調査するために設立されました<em&gt; C.トラコマチス</em&quot;生命のような&quot;条件下での女性の卵管へ&gt;誘導病理。

の調査のための人間の卵管モデル<em&gt; C.トラコマチス</em&gt;感染症

Genital tract infections with Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) are the most frequent transmitted sexually disease in women worldwide. Inefficient ...

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Research

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Medicine

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

12.8K ビュー.  University of Lübeck. 我々は、説明します ex vivoでの感染モデル。全体の臓器組織モデルは、調査するために設立されました C.トラコマチス誘導病理。

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Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

細胞培養のための人間の削減乳房形成や乳房切除組織の処理

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

医学

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

創傷治癒のマウスモデル

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

脳Microslicesの興奮毒性刺激<em&gt;インビトロ</em&gt;脳卒中のモデル

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

マウスにおける加速アテローム性動脈硬化症の誘導:ワイヤー傷害モデル

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツール<em&gt;インビボ</emヒト骨格筋における&gt;ミトコンドリア酸化的リン酸化能力

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Tubal Cytology of the Fallopian Tube as a Promising Tool for Ovarian Cancer Early Detection

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to the lack of markers or tools for the ovarian cancer identification, the early detection of HGSC remains challenging. Direct sampling of the fallopian tube can enhance sensitivity for detection of neoplastic cells when the tumor is not grossly visible. We developed a procedure to collect fallopian tube cells directly from freshly received surgical specimens, which has shown excellent correlation with histological findings. This approach lays a foundation for the future utility of minimally invasive laparoscopic screening in high-risk patient populations.

We explored a tubal cytologic method by sampling the fallopian tube directly post-surgical excision as a tool of ovarian cancer early detection. Here, we present a protocol to collect fallopian tube cells from freshly received surgical specimens.

卵巣癌早期発見のための有望なツールとしてのファロピウス管の管細胞診

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely correlated with a history of articular cartilage damage and ligament avulsion. Surgical animal models of OA of the knee play an important role in understanding the onset and progression of post-traumatic OA and aid in the development of novel therapies for this disease. However, non-surgical models have been recently considered to avoid traumatic inflammation that could affect the evaluation of the intervention. 
In this study, an intra-articular cartilage lesion rat model induced by in vivo cyclic compressive loading was developed, which allowed researchers to (1) determine the optimal magnitude, speed, and duration of load that could cause focal cartilage damage; (2) assess post-traumatic spatiotemporal pathological changes in chondrocyte vitality; and (3) evaluate the histological expression of destructive or protective molecules that are involved in the adaptation and repair mechanisms against joint compressive loads. This report describes the experimental protocol for this novel cartilage lesion in a rat model.

Here, we present the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee, generated by 60 cyclic compressions over 20 N, resulting in damage to the femoral condylar cartilage in rats.

ラット膝の周期的負荷誘発関節内軟骨病変モデルを生成するための非侵襲的方法

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...