我々は、教員、研究員、住民、およびブリガムアンドウィメンズ病院の医師のアシスタント、これらの研究のための組織を利用可能にするために病理部に感謝。この作品は、NIH /国立がん研究所（P50 CA105009、K08 CA108748、U01 CA152990）、卵巣癌研究基金、月ケイ財団、ノバルティスファーマ、ロバートとデボラまず基金、ランディとジョエルカトラーの卵巣癌からの研究助成金によってサポートされていました研究基金、マーシャリブキン財団 - 科学奨学生賞、AACR - ジョージとがんの遺伝学的研究のためのパトリシアSehlフェローシップ、およびイスラエルの医療のためのアメリカの医師のフェローシップ - クレアとエマニュエルG.ローゼンブラット財団助成。

1。コラーゲンの準備とフィルターコーティング。 <ol><li>ヒト胎盤コラーゲンを準備するには、ヒト胎盤コラーゲン30mgのをピンセットで抜くと攪拌棒を500 mlのビーカーに50mlの蒸留水（のdH 2 O）の上に置く。 </li><li>それは容易に溶解するように直接コラーゲンに氷酢酸100μlsを追加。 37℃程度まで加温し、コラーゲンを溶解するために、それをかき混ぜる。それは20〜30分で溶解してください。コラーゲン鎖が溶液中に残っている場合は、フィルター滅菌が困難になります。 </li><li>のdH 2 Oを450 mlと50 mlのストックを希釈し、0.2μmメンブレンでろ過滅菌します。これは最終的な実用的なソリューションです。 4℃で保存します。 </li><li>コー​​ティングその晩コラーゲン（50〜100μl）を持つことによってトランスウェルフィルター膜を準備します。チルドコラーゲンをRTに温め、次いで一晩、室温でメンブレンをカバーするために、上部コンパートメントに追加する必要があります。トランスウェルフィルター上に解離主卵管（FT）上皮（下記参照）をメッキする前に、1Xリン酸塩で三回は過剰なコラーゲンを除去するために使用前に生理食塩水（PBS）少なくとも1時間をバッファリングのフィルターを洗う。 </li></ol> 2。組織の収集と解離。 <ol><li>新鮮な卵管（FT）采を50 ml遠心チューブに滅菌1X PBSで回収し、無菌組織培養フードに処理を要求する前に氷上で保存する。 </li><li> （サンプルはメディアの別のタイプに収集されたか、これはメッキの効率を妨げる可能性があるので、できるだけ多くの血液と外国メディアを取り除くために、少なくとも3倍血の洗浄であるとされている場合）1X PBSを冷やして一回20ml中の組織サンプルを洗浄してください。 </li><li>滅菌メスと滅菌ピンセットを使用して、少しPBSと10 cmの組織培養皿に滅菌ピンセット転送FTを用いて、上皮細胞の露出を最大化するために縦にカット。それはもはやチューブが、組織のほぼ平らなシートがないように采を開きます。その後小さいが、それでも回収可能部分（直径約3 mm）に切断。 </li><li> 50 mlチューブにチルド解離メディア45mlの（1.4 mg / mlのプロナーゼとは0.1 mg / mlのDNaseを含むMEM）に曲を転送する。 </li><li> 4 24〜72時間℃で穏やかに揺らし。 （経験から、48時間が最適です）。解離の量を確認するには、スライド上に解離メディアのドロップを入れて、凝集と組織の生存率（繊毛細胞を破って）の量を確認してください。あなたは、単一細胞といくつかの小さな塊の両方を見てみたい。 </li></ol> 3。卵管のメッキ。 <ol><li>上皮細胞の解離の量が最適であるときは、FBSの10％のボリュームを追加することにより、メディアを不活性化する。小さな凝集体に細胞懸濁液を取り除くために、数回転倒混和します。 </li><li>底部にチューブを解決するために大規模な組織の塊（間質組織を）許可する。第二50 mlチューブに上皮細胞を含むメディアを取り外します。 </li><li>オリジナルの50 mlチューブに冷たいMEMを50ml（無FBS）を追加します。追加の細胞を収集するために反転。第三50 mlチューブ（サンプルが非常に大きく、細胞の高い数値が期待されている場合、このステップは、セルのコレクションを最大化するために繰り返すことができる）にメディアを収集する。間質/細胞外組織の大部分は破棄することができます。これで、細胞懸濁液の2個の50 mlチューブを持っている。細胞ペレットから5分、吸引解離のメディアのための1000 rpmで遠心。 </li><li> USG培地（DMEM：F12 2パーセントUSGと1％ペン連鎖球菌を補充）の約5-10 mlに再懸濁し、37℃に温めピペット。これは上皮細胞を損傷し、文化の質を低下させる可能性があるため、あまりにも積極的にピペッティングしないように注意してください。単一細胞と小さな塊（図1）があるはずです。 </li><li> 1時間または最大3時間以上Primaria培養皿とインキュベートへ転送。線維芽細胞と赤血球は、プラスチックに付着しますが、FT上皮細胞はしません。何かが付着しているかどうかを確認する時間後にプレートを見てみましょう。繊毛細胞の存在は、繊毛の拍動に注目することによって見ることができます。 </li><li>このインキュベーションの間、コラーゲンコートされたフィルターを洗浄し、細胞播種の準備ができたことができます（ステップ1.4参照） </li><li> Primariaプレート上のインキュベーションの1-3時間後、15 mlのチューブに細胞懸濁液を転送し、5ml USGメディアとPrimariaプレートをすすぎ、15 mlの最終容量を作るためにチューブにこのメディアを転送する。 5分間1000rpmで遠心する。 </li><li>慎重に培地を吸引除去し、細胞ペレットを中断することは避けてください。ペレットの大きさから判断すると、USGメディアの適切な量で再懸濁します。あなたがする必要がある場合はさらに希釈できるように（通常1〜3ミリリットルの間で）以下は、初めに優れています。静かに懸濁します。 </li><li>血球計算盤に再懸濁した細胞を10μlを加え、細胞密度を決定する。ヒント：あなたは明らかに暗い細胞膜を持つと非柱状である上皮細胞を探している。また、確実に移動している繊毛細胞を数えることができます。ハローappearanを持つ小さな細胞ceは赤血球であり、カウントすべきではない。これは一種の塊であるので、その使用電池数内に見積るため必要となります。種まきのターゲットは1.65 × 10 5細胞/細胞膜、または少なくとも75％フィルターカバー（図1）です。細胞があまりにもまばらに播種されている場合、細胞は完全に上皮層を形成することができなくなります。 </li><li> 24ウェルプレートのウェルの底にUSGメディア500μlを加え、トランスウェルを挿入します。 FTの細胞懸濁液（上記参照）の必要量は、それぞれのメンブレン上に加えることができる、これは通常100μlである。 </li><li>膜の上部を乱すことなくインキュベートし、1〜2日のために成長する。必要に応じて、それらの日の間に基底側にあるメディアを変更することができます。 1〜2日後に、慎重にUSGのメディアでトップを洗浄し、膜の上に小容量のリムーバブルメディア（50〜100μl）を追加することができます。それはメディアが顕微鏡の前にフィルタの頂端側から削除されている場合、細胞培養の合流を決定する方が簡単です。下部コンパートメントには、常にメディアが含まれている必要があります。かつての文化が（通常5日以内に）完全にコンフルエントな、頂辺に基底からフィルタを通って移動するメディアの量は無視できるはずです。 </li><li>最初の10日間の2日に1回基礎培地を変更します。下部コンパートメントには、常に細胞が生き続けるためにメディアを持っている必要があります。いったん細胞は、それらがそのような免疫蛍光（IF）または免疫組織化学（IHC）のようなさらなる研究、に使用することができる（図1と図2）タイト上皮層を形成している。 </li></ol> 4。膜処理。 <ol><li>膜処理が実行される試験の種類に依存しますが、通常はトランスウェルインサートからフィルタの除去を含む。 </li><li>フィルタは、典型的に除去する前の1X PBSを200μlで3回洗浄する。 </li><li>フィルターの先端と基底側からPBSを吸引除去する。これは、乾燥から膜を防ぐために、一度に1ウェルを行う必要があります。 </li><li> 、プレートからカバーを取り外し、それを上下逆さまに反転し、膜の周りにカットする滅菌メスを使用してください。代わりに、エッジの周りにメスをドラッグすると、膜のエッジの周りストレートカットすることによって、一枚の膜を除去するようにしてください。 </li><li>細胞が上にあるどちら側を追跡する、インサートからフィルタを削除するには、ピンセットを使用してください。フィルタは、必要に応じてIF、IHC、等のために処理することができます。 </li><li>例：試験は、フィルターが（適切な抗体との固定、透過処理、ブロッキングやインキュベーションの後、手続きIF規格に準拠）スライド上に配置する必要がある場合のために、DAPIで、Vectashieldを上向きにし、細胞をフィルター上に滴下さとで覆われてガラスカバースリップ。 </li></ol> 5。代表的な結果： トランスウェルフィルターは、容易に免疫組織化学（IHC）と免疫蛍光（IF）の両方でex vivoでの上皮を調べるために削除することができます。特異的なマーカーリネージュ使用して、一つはイメージできると分泌（正Pax8）及びこれらの培養物における繊毛（Sall2ポジティブ）細胞区画（図3）を定量化する。また、これらのマーカーを使用して、一つは各セルのタイプは異なる生理的な手がかりを10に応答する方法を監視することができます。このシステムは、様々な刺激に反応してFTの上皮のsecretomeと細胞内リン酸化プロテオームの変化を特徴付けるために使用されています。 <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。イラストは 、ex vivoでの培養は、初代ヒト卵管組織から生成される方法を描いた。卵管線毛組織が ​​手術室から取得し、24〜72時間2の解離メディアで洗浄し、インキュベートする小さな断片1を生成するためにみじん切りされています。解離が完了した後、組織片は培養管の底に沈降させていると解離上皮細胞を含む培地3を収穫される。解離の効率は、位相差顕微鏡4の下検査によって監視することができます。解離上皮細胞は、線維芽細胞と常に上皮細胞5で混合した造血細胞を除去するためにPrimariaプレート上で培養されています。非上皮細胞が十分除去されると、上皮細胞はヒト胎盤コラーゲン5で被覆されているトランスウェルフィルター上に接種されています。メディアは以下のトランスウェルを介して拡散によって提供されます。培養は24〜48時間インキュベートし、その後頂メディアが削除されます。 ex vivoでの培養物をトランスウェルフィルター上に完全な、完全な芝生を形成するために5-8日のために拡張されます。 4週間までex vivoでの培養は、この状態でviably維持することができます。漫画5は hemato付きインサートとステンドグラスから除去フィルタの例で十分に成長した生体外での文化の表現を示しています。xylinとエオシン（H＆E）は、ex vivoでの上皮の極性とアーキテクチャを実証する。 <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 FT ex vivoでの文化の明視野顕微鏡。トランスウェルインサートが（）表示されているヒト胎盤コラーゲン0.4μm孔でコーティングされています。 FT上皮細胞は、それらが上皮層（c）を形成するコラーゲンコートしたインサート（b）に、上で培養されています。いくつかの破片は通常、繊毛細胞に最も頻繁に、（矢印で示す）上皮培養細胞への付着が観察される。 <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。 FT ex vivoで培養免疫蛍光（IF）。 生体外での文化のイメージが（a）の分泌（Pax8）と（d）は線毛細胞（Sall2）マーカーに対する抗体を固定し、染色した場合の例。 DAPIは細胞核の位置（青）（BとE）とマージされた抗体とDAPI染色も（CとF）が表示されるためのコントロールとして使用されます。細胞の数は、細胞が培養している時間の長さ（; Sall2染色、3日間Pax8染色、7日間）に依存します。

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博士Drapkinは、ノバルティスの医薬品へのコンサルタントです。それ以外の著者は、利害の潜在的な競合を宣言しません。

SOCのための起源の候補地としてのFTの同定は、既知の危険因子をリンクするメカニズムと実際の漿液性発癌過程の解読を目指した基礎およびトランスレーショナルリサーチのための機会を提供しています。このための重要な私たちはFTSECが骨盤漿液性癌のための細胞の起源であるという仮説のテストを開始できるような扱いやすいモデル系の開発です。ここに記載さex vivoでの培養モデルでは、ネイティブのFTの上皮の形態学と生物学を維持する方法で分離し、主要なFTの分泌と繊毛細胞の共培養を可能にする斬新なシステムです。このシステムを使用して、我々は最近、この上皮のsecretomeを特徴とどのように上皮は、機械的および遺伝毒性傷害10に応答します。排卵、卵巣腫瘍形成に関連する主要な危険因子は、組織損傷、炎症性メディエーター、増殖因子、およびホルモン11の組み合わせによって特徴づけられる。このシステムは、分泌および繊毛細胞の応答と生存率に排卵環境の影響を研究するために使用することができる。さらに、他の細胞型（すなわち炎症性細胞）の影響は、そのドライブの細胞型の分化およびこれらの細胞の悪性形質転換に寄与する要因のイベントのより良い理解を可能にするために検討することができます。同様のモデルは極性上皮が存在する他の組織に記載されている。例えば、気道上皮の極性初代培養において、細胞増殖および細胞傷害への応答にヘレグリンの効果は、12を評価した。モデルシステムのこれらのタイプは、上皮組織から生じる腫瘍の開始と病因を研究する新規かつ有用な方法を提供し、これはそのようなない細胞株が現在存在しないFTのような組織で非常に重要である、と偉大ながある場所キー経路の同定と新たな治療戦略の開発のために必要。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7521</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM:F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>15-090-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultroser G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Chemical Company</td>
<td>67042</td>
<td>Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Primaria culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>353802</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 well Transwell Permeable supports</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning (Costar)</td>
<td>3470</td>
<td> Clear, 6.5 mm insert, 0.4 &mu;m pore size, treated polyester </td>
</tr>
<tr>
<td>MEM (Minimal Essential Media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pronase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11459643001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNAse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sall2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dr T. Benjamin, Harvard</td>
<td>Gift</td>
<td>1:20 dilution</td>
</tr>
<tr>
<td>Pax8 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proteintech</td>
<td>10336-1-AP</td>
<td>1: 1000 dilution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells

上皮性卵巣がんは、米国の女性の癌死亡の主要な原因です。他の女性特有の癌とは対照的に、死亡率は近年減少している乳がんや子宮がん、同じように、卵巣癌の治癒率は、過去二十人以上の比較的変わっていない。これは、手術と化学療法は3、2、最も効果的な早期の疾患を検出するための適切なスクリーニングツールの不足によるところが大きい。その結果、ほとんどの患者は、進行した段階の疾患とびまん性腹部関与を呈する。これは、さらに、卵巣癌は複数の組織学的サブタイプ4、5で異種の病気であるという事実によって複雑になる。漿液性卵巣癌（SOC）は、最も一般的で積極的なサブタイプと最も頻繁にBRCA遺伝子の突然変異に関連付けられているフォームです。この分野における現在の実験モデルは、よりよい開始遺伝的事象と疾患6,7の病因を理解するために癌細胞株とマウスモデルの使用を必要とする。最近、卵管が原点8,9の提案された細胞として卵管（FT）分泌上皮細胞（FTSEC）で、SOCの起源のための新規サイトとして浮上している。ない細胞株またはFTの上皮またはFTSECを研究するために利用可能な培養システムは現在ありません。ここでは、初代ヒトFT上皮細胞は、そのアーキテクチャ、極性、免疫表現型、および生理学的および遺伝毒性ストレス因子への応答を保持する方法で培養されている小説のex vivo培養系を説明します。このex vivoのモデルは、腫瘍がこの組織から発生する可能性、およびメカニズムが腫瘍の開始と進行に関与する方法について理解をできるように、SOCの研究のための有用なツールを提供しています。

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Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

卵管（FT）は、漿液性卵巣癌（SOC）の原産地別のサイトとして浮上している。このプロトコルは、分離するための新しい方法を説明し、<em&gt;生体外で</em卵管上皮細胞の&gt;文化。このシステムを反復する<em&gt; in vivoで</em&gt;上皮とSOCの病因の研究が可能になります。

初代ヒト卵管上皮細胞のex vivoでの文化

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

ex-vivo-culture-of-primary-human-fallopian-tube-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

19.5K ビュー.  Dana-Farber Cancer Institute. 卵管（FT）は、漿液性卵巣癌（SOC）の原産地別のサイトとして浮上している。このプロトコルは、分離するための新しい方法を説明し、生体外で文化。このシステムを反復する in vivoで上皮とSOCの病因の研究が可能になります。

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

外植片から成長した初代ヒト気管支上皮細胞

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

ex vivoで培養マウス胚の皮膚およびメラノブラストの移行のライブイメージング

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

正常に伝達する初代ヒト気管支上皮細胞に必要な最適なレンチウイルスの生産および細胞培養条件

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II cells and two types of immune cells (i.e., human monocyte-derived macrophages [MDMs] and dendritic cells [MDDCs]). A protocol for assembling the multicellular model is provided. Alveolar epithelial cells (A549 cell line) are grown and differentiated under submerged conditions on permeable inserts in two-chamber wells, then combined with differentiated MDMs and MDDCs. Finally, the cells are exposed to an air-liquid interface for several days. As human primary immune cells need to be isolated from human buffy coats, immune cells differentiated from either fresh or thawed monocytes are compared in order to tailor the method based on experimental needs. The three-dimensional models, composed of alveolar cells with either freshly isolated or thawed monocyte-derived immune cells, show a statistically significant increase in cytokine (interleukins 6 and 8) release upon exposure to proinflammatory stimuli (lipopolysaccharide and tumor necrosis factor &#945;) compared to untreated cells. On the other hand, there is no statistically significant difference between the cytokine release observed in the cocultures. This shows that the presented model is responsive to proinflammatory stimuli in the presence of MDMs and MDDCs differentiated from fresh or thawed peripheral blood monocytes (PBMs). Thus, it is a powerful tool for investigations of acute biological response to different substances, including aerosolized drugs or nanomaterials.

Presented here is a protocol for primary human blood monocyte isolation as well as their differentiation into macrophages and dendritic cells and assembly with epithelial cells into a multicellular human lung model. Biological responses of cocultures composed of immune cells differentiated from either freshly isolated or thawed monocytes, upon exposure to proinflammatory stimuli, are compared.

危険評価のための上皮細胞と原発性免疫細胞からなる多細胞ヒト歯槽モデル

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

オルガノイド培養のためのヒト肺上皮前駆細胞の単離と濃縮

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

非ウイルス遺伝子治療のための哺乳動物一次色素上皮細胞の単離、培養、遺伝子工学

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...