この作品は、NIHの助成金R01 DK060581、R01 DK083583（RGMの両方）によって部分的にサポートされていました。

A.材料は、必要なもの：表1（試薬）を参照して準備する前に<ol><li> HBSS（P / S）：100ミリリットル10×HBSS + 900 mlのH 2 0 +1％ペニシリン/ストレプトマイシン（冷蔵庫で保存したり、氷の上に保たれる）。 </li><li> 20パーセントBSAの在庫は水で作られ、小分けして-20℃で保存されている</li><li> HBSS（BSA）：200ミリリットル1X HBSS（P / S）20％のBSA +3 ml（最終BSAの濃度は0.3％である） </li><li>膵島培地：RPMI + 10％FBS + 1％グルタミン+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン</li><li> HISTOPAQUE 1100：240ミリリットル1119 HISTOPAQUE + 200ミリリットル1077 HISTOPAQUE </li><li> 4から0縫合糸（マッケソンは）：2¾インチの小片に切断し、10cmシャーレに格納されている</li><li>楽器：鉗子のすべての3つのペアの鋸歯状の歯が下90°、およびファイルへのファイン科学ツールから鉗子を曲げます。目標は、それらを削除しないように、退屈な歯になります。 </li><li>コラゲナーゼ/プロテアーゼ混合物を投与するためのカニューレ：27G針½インチ、30½インチ針、ピース12インチにカットPE50チューブ。シャープなエッジを持っていない滑らかな丸みを帯びた端に両方の針を下に提出。 PE50チューブのピース12インチの一端に27G針を挿入します。ケーシング¼たびにターンを回し、プライヤーでケーシングを粉砕することによりケーシングから30G針を外します。ケーシングからプライヤーで針を外して、解剖顕微鏡下PE50チューブのもう一方の端に挿入します。あなたはPE50チューブに針を挿入すると、チューブをねじらないようにしてください。 27G針を使用すると、コラゲナーゼのシリンジを添付することは終わりです。 </li><li>コラゲナーゼ（CI zyme MA）および中性プロテアーゼ（CI zyme BP）。メーカーの指示に従って再構成TDE。酵素活性の濃度を算出する分析多くの特定の証明書を参照してください。再構成されたコラゲナーゼ35万コラーゲン分解活性（CDA）の単位とreconstitの100,000中性プロテアーゼ単位の合計を転送uted BPのコニカルチューブにプロテアーゼ及びHBSS中の15mlの合計（P / S）まで希釈</li></ol> B.ステップバイステップのプロトコル 1。コラゲナーゼ/プロテアーゼ混合物による膵臓のインフレ<ol><li>頸椎脱臼によりマウスを安楽死させる、70％エタノール、任意の解剖ハサミとピンセットで完全に肛門から横隔膜に開いて腹腔内にマウス胴体を飽和させる。 </li><li>解剖顕微鏡のプラットフォーム上にマウスを置きます。 </li><li>盲腸および上行結腸を引き出し、あなたの左に体腔外に設定してください。次の手順の概要は、 図1を参照してください。 </li><li>ダイアフラムに対して肝臓のローブを置き、体腔が十分開いている場合、彼らはそこに残っているはずです。肝動脈、門脈および湾曲鉗子で十二指腸を把持することにより肝臓につながる胆管の束を見つける。湾曲した鉗子の別のペアを使用すると、動脈、静脈の下に到達し、ダクトBUndleや動脈、静脈、胆管の下4から0縫合糸の部分インチ¾2を引き、一度それを結ぶ、できるだけ肝臓の近くにタイトな引き出します。 </li><li>湾曲した鉗子の2ペアを使用して、慎重に十二指腸をつかむと、乳頭で十二指腸に接続されている胆管を見つける。乳頭に近い胆下膵臓および結合組織の右側を通って突くために鉗子のはさみを使用しています。穴を作り、それから通って鉗子のトング両方を入れて、4から0縫合糸の別の2¾インチの部分を介して取得し、それを一度結ぶと小さな円に引いたが、タイトな引っぱらずに臓器を素早くあなたの鉗子を突く。 </li><li> 90°鉗子及び超微細Vannasはさみに変更します。胆管がピンと張ったようになるまで90℃鉗子で、慎重に小腸をつまんで引っ張る。腸内にオープンハサミを刺してから、1つのモーションで切断してハサミで乳頭を挟んで水平にカットしておきます。唯一のoを作ってみるneは乳頭から胆管が外れずに乳頭を横切る。 </li><li>それでも90°鉗子で腸を押さえながら、胆管の長さの半分までの胆管にカニューレを挿入し、静かにカニューレの周りにタイトな縫合糸を引き出します。 </li><li>コラゲナーゼ/プロテアーゼ混合物の2.0ミリリットルを3 mlシリンジを埋め、ゆっくりと、一定のペースでカニューレ内に注入します。 </li><li>膵臓のインフレが完了した後、胆管からカニューレを取り外し、下行結腸から開始して、腸をプルアップするように結合組織を切り取ることによって膨張した膵臓を除去するために湾曲した湾曲した鉗子と春のはさみを使用しています。あなたが胆管に到達するまで、腸から膵臓の削除を続行し、その後、その後脾臓から胃膵臓を削除してから、腹腔の内臓から。縫合糸を離れて切り取ることによって除去を完了します。 HBSSの5ミリリットルを含む50 mlチューブに膵臓を追加（P / S）。このチューブは氷の上になければなりません。 </li><li>最大4つの動物にそれぞれの動物については、上記の手順を繰り返します。最適な結果を得るためには、一度に4つしか膵臓を解離させる。最初の4つは、37℃の水浴中であるが、典型的には、我々は別の4膵臓を膨らませる。 </li></ol> 2。膵臓解離<ol><li> 15分間37℃の水浴中に膵臓を含む50 mlチューブを置きます。 </li><li>優しくチューブを揺すると組織解離をチェックするには、蓋で管を保持している間に組織は渦管を次に、簡単にバラバラに12回来てください。 </li><li>最大30 HBSS（BSA）は（これは遠心分離工程のために管のバランスをとるために必要とされるどのくらいに応じて、低量であってもよい）のmlと1分間290×gで遠心分離器を追加します。 </li><li>注意深く上清を吸引除去し、細胞ペレットを妨害しないように、下部に上清（2-3 ml）を少量にしておきます。 </li><li> 30ミリリットル注射器を使用してATTAC14G針にHED、HBSS（BSA）の10以上のミリリットルを追加し、2回ダウンサスペンションを吸引し。 </li><li> 50 mlチューブにプラスチック製の茶こしを通して細胞混合物を濾過し、別の10ミリリットルHBSS（BSA）ですすいでください。 </li><li> 2分間、330×gで遠心分離します。 </li><li>デカントで上清と1分間吸収紙タオルの上に排出するためのチューブを反転させる。 </li><li> 10ミリリットル冷たい1100 HISTOPAQUEで各チューブを再懸濁します。 </li><li> 10ミリリットルHBSS（BSA）でHISTOPAQUEをオーバーレイし、18分間、900×gで遠心分離します。 </li><li>大口径25mlのピペットを用いて上清の全体の20ミリリットルを取り外し、反転70μmのフィルターを通過し、上清を渡す。 </li><li>皿の上に右側を持ち上げながらフィルターを通して10mlの膵島メディアをピペッティングにより10cmペトリ皿に小島をすすぐ。 </li><li>実験の準備が整うまでは文化37℃、5％CO 2の組織培養インキュベーター内膵島を。典型的には、島を手摘みされ、exper前に数えimentation。 </li></ol> 3。代表的な結果膵島収量、形態、品質は膵島分離の成功を判断するために使用される一般的なパラメータである。我々の手では、平均のC57BL / 6マウスからの膵島収量は、このプロトコルを（表2を参照）を使用して150から250膵島の範囲にあり、最適化されたシグマXI型コラゲナーゼを用いて得られたデータに匹敵する。しかし、利回りは使用マウス系統とマウスの年齢に応じて変えることができる。我々は採用して動物のほとんどは8-16週齢の範囲でこのプロトコルは、C57BL / 6（180から250の小島/マウス）、CD1（200-300小島/マウス）、129 /を含む、複数のマウス系統でテストされていますアールB6（200-300小島/マウス）、BLKS-db/db（120から200の小島/マウス）、NOD（10週齢、100から150の小島/マウス）、およびNOD-SCID（100-150小島/マウス）。典型的な膵島の形態は、小島が比較的均一な大きさ（サイズunifものの持つ楕円形状にラウンドを持っている、 図2に示されているormity）がひずみにひずみから変えることができます。 図3のC57BL /精製TDES対シグマXI型コラゲナーゼを用いて単離された6マウスの膵島からグルコース刺激インスリン分泌の私たちの代表的な分析を示している。典型的には、2.5mMのグルコースで観察されるものより6から20倍である25mMグルコースにおけるインスリン刺激で高品質の膵島準備結果。その他のアプリケーションはまた、単離された膵島の品質をテストするために使用され、これらは他の11の間でperifusion技術の使用は、Ca 2 +イメージング（Fura2付き）、逆転写PCRを含めることができます。 <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。胆管カニュレーションの要約。 <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 24時間以下の分離であるC57BL / 6小島の典型的な外観。画像は内に取得した40Xの倍率でverted顕微鏡。 <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。 C57BL / 6マウス膵島のグルコース刺激インスリン分泌。24時間以下の分離では、100島を37℃で1時間で2.5 mMのグルコースを含むクレブス-リンガーHEPES緩衝溶液中で12ウェルディッシュ中でインキュベートした。小島は、その後、上清を二部位免疫酵素免疫測定法（ELISA）（クリスタルケム）を使用してインスリン測定のために収集された後に、追加の時間2.5mMのグルコースでクレブス - リンガーHEPESに移した。同じ島はその後、25mMのグルコースを含むクレブス - リンガーHEPES緩衝液に移し、培地へのインスリン放出がインキュベーションの1時間後にELISA法により測定した。

<ol>
	<li>Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Liang, Q. -. L., Dai, L. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+of+islet+isolation+without+neutral+protease+supplementation.">Experience of islet isolation without neutral protease supplementation.</a> Islets. 2, 278-282 (2010).</li><li>Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+purified+tissue+dissociation+enzyme+mixtures+for+human+hepatocyte+isolation.">Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li><li>McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+collagen+degradation+assay+to+assess+purified+collagenase+used+in+islet+isolation.">Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation.</a> Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).</li><li>Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+pancreatic+ductal+collagenase+injection+for+isolation+of+pancreatic+islets.">Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets.</a> Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).</li><li>Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+in+islet+yield+from+a+cold-preserved+pancreas+by+pancreatic+ductal+collagenase+distention+at+the+time+of+harvesting.">Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting.</a> Transplantation. 51, 566-570 (1991).</li><li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics:+comparison+study+with+Ficoll,+iodixanol+and+dextran.">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3, 144-149 (2011).</li><li>Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+enzyme+neutral+protease+assessment.">Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment.</a> Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).</li><li>Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR-{gamma}+Activation+Restores+Islet+Function+in+Diabetic+Mice+Through+Reduction+of+ER+Stress+and+Maintenance+of+Euchromatin+Structure.">PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).</li></ol>

NDSは、土、RGMは開示することは何もありません。著者AGBはVitaCyteで採用されています。著者RCMはVitaCyteにおける所有持分を有しています。

このプロトコルでは、ランゲルハンス島を単離することを目標に、カニュレーション、コラゲナーゼ灌流、及びネズミの膵臓の解離のために私たちの手順を説明してきました。技術的には、我々の方法は、一度マスターして、動物の安楽死の4分以内に膵臓の分離を可能にする必要があり、1時間することで、単一の動物から膵島の分離をもたらすべきである。技術の速さは、それによって3000小島までの分離で、その結果、私たちは典型的なストレッチで12匹までから膵島を分離することができます。 コラゲナーゼの粗調製物を使用する他のプロトコルとは異なり、我々のプロトコルは、精製されたプロテアーゼは、CI zymeコラゲナーゼマサチューセッツおよびCI zyme BPのプロテアーゼの使用を特徴とする。市販されているTDE製剤の一貫性のばらつきは各ロットは個別に一般的に使用する前にテストされ、最適化されている必要があります。このロット間変動は、私たちはプリの使用を考慮するために導いVitaCyteからfied TDES。これらの高度に精製されたTDESは敏感な蛍光標識基質アッセイの使用を含む複数の方法によって特徴づけられる。蛍光CDAのアッセイが劣化天然コラーゲンで異なる動態を持っコラゲナーゼの異なる分子形態の影響を受けやすくなります。歴史的なペプチド基質アッセイは、コラゲナーゼの不完全なアセスメントを提供します。複数のメソッドでコラゲナーゼを特徴付けることはロット間の大きい酵素活性を確実にします。 市販のコラゲナーゼ製剤のさまざまな方法を使って、社内テストに基づいて、我々は、精製酵素の組み合わせが再現可能なロットの結果をもたらしたことがわかった。最適な酵素組成物を定義した後、このアプリケーションで高度に精製され、厳格に特徴付けTDESを使用する主な利点は、ロット間の性能の一貫性が保証されています。この一貫性は、通常必要とされる多くの資格の労働集約的なプロセスを排除原油または濃縮コラゲナーゼ製品の。精製TDESはまた、異なるマウス系統から回収された膵島の収量と品質を向上させるための組成物の追加の変更を有効にしてください。マウスの異なる系統から膵島を分離するための最適な酵素組成物を報告することは、より効果的に伝達することができます。これは、順番に、実験的なデザインのリソースと柔軟性の向上をより生産的な利用につながる。 我々のプロトコルを使用して、膵島単離の結果に影響を与えることができる多くの重要なステップがあります。第一は、酵素製剤の血中に、膵臓の効果的なインフレ率を達成する必要があります。シリンジに優しい力でインフレを起動して、膵臓が膨らむような力を高めることが重要である。それが腸を移動し、コラゲナーゼ全体臓器を灌流ように膨張時に膵臓を持ち上げておくと便利です。もう一つの重要なステップは、1つは、チューブafteを振るする力である37℃（ステップ2.2）において、rはインキュベーション。私たちは、チューブのキャップかたい膵臓を振ると、膵島の断片化が発生しますが、この段階で機械的解離の任意のフォームなしで、膵島収量が劇的に減少することを見出した。それは、シリンジ（ステップ2.5）との解離工程中に、中レベルの力は、プランジャと上下運動中に適用されることも不可欠ですが、これはフィルタリングステップ（2.6）の前に十分な組織解離を保証し、どこに非常に少ない組織は、茶漉しフィルター上に保持されるべきである。最後に、慎重にフォローするための最後のステップは、HISTOPAQUE画し膵島の全体の20ミリリットルの願いです。小島はHISTOPAQUEし、HBSSの界面に典型的であるが、我々は唯一のインタフェースを削除しようとしたとき私たちは島を失うことを発見したのではなく、我々は今、大口径25mlのピペットを使用することで全体の20ミリリットルを削除します。我々は、cに必要性を排除するために反転さ70μmのフィルター（ステップ2.11）を通して濾過を追加しましたHISTOPAQUEを洗い流すために繰り返し膵島をentrifuge。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td></td><td> カタログ＃ </td></tr><tr><td> 10X HBSS </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 10から040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td> HISTOPAQUE 1077 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> HISTOPAQUE 1119 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4から0縫合糸100ヤードロール</td><td>マッケソン</td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14グラム平滑末端針</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>VannasのスーパーファインSciss </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td>湾曲した春のはさみ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td>湾曲した鉗子（2） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td>湾曲した鉗子（90°用） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11052から10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2インチ針</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> 30G 1/2インチ針</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> PEの管</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼマサチューセッツ</td><td> Vitacyte、LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BPプロテアーゼ</td><td> Vitacyte、LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 3ミリリットルのシリンジ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 30mlのシリンジ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70μmのフィルター</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10cm 2のペトリ皿</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製の茶こし</td><td>どんなキッチンサプライ</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1試薬および器具 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> シグマXI型 （l010M8618） </td><td> MA（100615） BP（110329） </td><td> MA（081104） BP（100823） </td><td> MA（091211） BP（101109） </td></tr><tr><td> 216（±74） </td><td> 260（±45） </td><td> 157（±37） </td><td> 200（±4） </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表2異なるTDEロット*を使用して平均膵島収量（±SD） ※データは、少なくとも10匹のマウスの平均膵島収量を表す。括弧内のロット番号</td></tr></tbody></table>

mouse islet of langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease

β細胞の遺伝子発現とin vitroでの機能の尋問は、真正面から、げっ歯類の腫瘍形成性細胞株の研究から単離されたげっ歯類の小島の研究に長年にわたってシフトしている。主要な島は、彼らがより忠実に細胞内シグナル伝達経路および分泌応答の生物学を反映していることの明確な利点を提供します。組織解離酵素（TDE）の製剤を用いた膵島分離の方法は、多くの実験室1月4日に設立されているのに対して、任意のげっ歯類の系統から膵島収量と品質の一貫性の変動は、主膵島研究の範囲と実現可能性を制限します。これらの変化はしばしば膵島分離手順で使用される部分的に精製された原油TDESの結果として発生します。頻繁に活動のロット間のばらつきを示し、多くの場合、使用する酵素の投与量の調整が必要になるTDES。レポートの数が少ないの齧歯類の細胞単離のためのTDES 5,6を精製し使用している</supは&gt;が​​、実際には、ヒト膵島単離のためのTDES、精製の日常的な使用と利点にもかかわらず普及していない。 VitaCyte、LLC（インディアナポリス、インディアナ州）と共同で、我々は、を介して粗組織分画に続いTDESをマウスの膵管に直接灌流されている後藤7,8、、によって記載されたものに基づいて修正されたマウスの膵島単離プロトコルを開発HISTOPAQUE勾配9、および精製された膵島の単離。我々のプロトコルには有意差は、精製されたコラゲナーゼ（CI zyme MA）および中性プロテアーゼ（CI zyme BP）の組み合わせを使用することである。コラゲナーゼは、基板6のように蛍光標識された水溶性の子牛の皮の繊維を利用して6蛍光コラーゲン分解活性（CDA）のアッセイの使用によって特徴づけられた。それは基質として天然コラーゲンに依存しているので、この基板は、組織マトリックスにおけるコラーゲン分解の動力学のより予測です。プロテアーゼはchであった感受性蛍光カイネティックアッセイ10でaracterized。より伝統的な生化学的な分析とともに、これらの改善されたアッセイを活用することでロット間の改良された性能の一貫性につながる、より一貫して製造することTDEを有効にしてください。ここで説明されたプロトコルは、最大限の膵島収量およびC57BL / 6マウスを用いて最適な膵島の形態用に最適化された。このプロトコルの開発時には、コラゲナーゼと中性プロテアーゼのいくつかの組み合わせが異なる濃度で評価し、コラゲナーゼの最終比：35:10の中性プロテアーゼ、シグマXI型に匹敵する酵素の性能を表しています。ラットやマウスの異なる株から平均膵島収量の大幅な変動が報告されているので、TDEの組成物の追加変更は、異なる種や菌株から回収された膵島の収量と品質を向上させるためになされるべきである。

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Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

マウス膵島分離の詳細な説明はコラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製組み合わせのin situ膵管カニュレーションと灌流の技法を用いて説明する。

コラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製の組合せを用いて単離ランゲルハンスマウスの膵島

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

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Biology

43.2K ビュー.  Indiana University School of Medicine. マウス膵島分離の詳細な説明はコラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製組み合わせのin situ膵管カニュレーションと灌流の技法を用いて説明する。

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Murine Pancreatic Islet Isolation

マウス膵島単離

生物学

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

人間の膵島単離：パートI：膵組織の消化とコレクション

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と​​文化

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

マウスの主栄養膜細胞と絨毛浸潤アッセイの分離

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

マウスおよびヒト結腸組織からの一次筋線維芽細胞の分離

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...