本研究の目的は、正常な膵臓の生物学的および疾患発生における膵管系の役割についての理解を深めることである。内皮画分を成功裏に濃縮することにより、膵臓機能を支配する血管系内の特定の経路を特定しようとしています。最近、膵臓の病状における内皮細胞の機能障害の役割にますます重点が置かれています。
膵臓の内皮細胞集団の不均一性を同定することで、内皮膵臓の相互作用がどのように努力し、病気から保護するかを理解することができました。単一細胞または単一核RNAシーケンシング、プロテオミクス、ゲノミクスなどのオミクスアプローチを使用して、細胞レベルでの膵臓の研究が行われています。組織レベルまたは空間レベルでの洞察を得るために、VisiumやXeniumなどの偏りのないプローブベースのアプローチを使用した新しいプラットフォームが実装されています。
このプロトコルでは、内因性膵臓酵素による細胞生存率の低下を最小限に抑える穏やかな解離技術と、内皮細胞を選択的に濃縮するための磁気細胞選別手順について説明します。私たちのプロトコルの解離と濃縮戦略により、細胞表面マーカーと、技術的な制限のためにこれまで調査が進んでいなかった膵臓内皮細胞のトランスクリプトームの両方の理解がさらに深まります。まず、安楽死させたマウスを手術台に置きます。
マウスの手足を伸ばし、ピンで固定します。手術用ハサミを使用して、下腹部から皮膚と腹膜を貫通し、胸部に向かって伸びる小さな正中線切開を行います。横隔膜を切開し、胸郭を持ち上げて心臓を露出させます。
氷冷滅菌PBSを含む注射器に接続された25〜30ゲージの針を心臓の左心室に挿入します。毎分5〜10ミリリットルの速度で心臓を灌流し、10ミリリットルを注入した後に停止します。次に、解剖ハサミと鉗子を使用して、膵臓を慎重に抽出します。
トリプシン阻害剤とともに、10ミリリットルの氷冷PBSを含む50ミリリットルのチューブに膵臓を移し、チューブを氷の上に置きます。まず、氷冷したPBSを含むペトリ皿でマウスの膵臓を取得します。手術用ハサミとピンセットを使用して、余分な組織を慎重に取り除きます。
トリミングした ?? 臓を、1ミリリットルの解離溶液を含む5ミリリットルのチューブに移します。.解剖ハサミで、チューブを氷の上に保ちながら、膵臓組織を細かく刻みます。ライセートを氷の上に置いた50ミリリットルのチューブに移します。
5ミリリットルのチューブに2ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を加えて、残っている膵臓組織をすべて取り除き、50ミリリットルのチューブに移します。チューブを摂氏37度でテンパリングした水浴で20分間インキュベートします。組織ホモジネートを入れたチューブを氷の上に置き、重力で沈殿させます。
次に、上清を70マイクロメートルのフィルターに通し、5ミリリットルの解離停止液を追加します。27ゲージの針を使用して、残りのペレットを追加の1ミリリットルの解離溶液で粉砕し、前と同じようにフィルターに通します。細胞懸濁液を300Gで摂氏4度で10分間遠心し、ペレットを1ミリリットルの洗浄緩衝液に再懸濁します。
ローテーター上で1マイクロリットルの抗CD31ビオチン抗体と7細胞の累乗で1回10回インキュベートします。20マイクロリットルの抗ビオチンMicroBeadsを加え、さらに40分間インキュベートします。次に、カラムセパレーターホルダー付きのマグネットスタンドを設置し、カラムを取り付けます。
カラムを平衡化した後、サンプルをカラムに加え、合計9ミリリットルの洗浄バッファーで洗浄します。ホルダーからカラムを取り外し、15ミリリットルのチューブに入れます。5ミリリットルの洗浄バッファーをカラムに加えます。
プランジャーを使用してカラム内の細胞を押し下げ、内皮細胞を含む溶出液を回収します。最後に、フロースルー画分と溶出画分をスピンダウンします。再懸濁後、細胞をカウントし、生存率を測定します。
内皮細胞の濃縮性を検証するための定量的PCR分析では、濃縮された画分は、フロースルーサンプルと比較してマーカー遺伝子Pecam1およびKdrのレベルが有意に高いことが示されました。濃縮された画分では、膵臓内分泌細胞の転写因子であるNK6ホメオボックス1の低レベルが観察されました。ウェスタンブロッティングでは、予想されたサイズでCD31の強いシグナルが示され、フラクションの内皮細胞の濃縮がさらに確認されました。
