ここでは、初代マウス肝正弦波細胞単離またはLSECs単離のプロトコールを実証する。このプロトコルは、非実質細胞精製およびCD146磁気ビーズ選択のための肝臓コラゲナーゼ灌流および低速超遠心分離からなる。当社のLSEC単離法は非常に効率的で、健康なマウスや病気のマウス肝臓に適用できます。
絶縁されたLSECは高純度を示し、構造と機能を維持します。このプロトコルを使用して単離されたLSECは、機能的および分子的研究およびマルチオミクスデータ生成に最適です。このプロトコルは、肝臓における細胞間通信を研究するのに役立ちます。
10センチメートルの培養皿に3ミリリットルのコラーゲン溶液をコーティングすることから始めます。その後、ディッシュを室温で1時間インキュベートする。1時間後、コーティングされた表面から余分な流体を除去する。
PBSで食器を3回洗い、風乾させます。加熱加湿再循環灌流装置を設置する。10%の漂白剤を使用して灌流システムを5分間すすぎます。
その後、滅菌水でさらに10分間システムを再すすいでください。コラゲナーゼ溶液で灌流する前に、できるだけすすぎ液を排出してください。コラゲナーゼ溶液を灌流システムを通して注入し、摂氏37度に予温する。
速度制御ダイヤルでポンプ速度を速度 1 に設定します。手順全体を通して同じ速度を維持します。手順のためにマウスの重量を量ります。
その後、手術面に固定します。マウス腹部に70%エタノールを噴霧する。外科用はさみを使用して、腹部の下部から剣状突起まで約5センチメートルの切開を行う。
その後、腹部の両側に小さな虹彩はさみを使用して2つの横方向の切り傷を作り、腹部の器官を完全に露出させます。IVカテーテルのシースを動物の背中の下に置き、腹部を持ち上げて水平にします。通常の湾曲したドレッシング鉗子を使用して、腸と胃を動物の左側に静かに引き離します。
次に、露出した左腎臓のすぐ下の下大静脈(IVC)の下に5-0の外科用縫合糸を置きます。縫合糸に緩いヒッチを結びます。次に、肝門脈の周りに別の5-0外科的縫合糸を置く。
縫合糸を肝門脈の脾静脈分岐点のすぐ上に置きます。もう一度、縫合糸に緩いヒッチを結びます。門脈縫合糸を張力として用い、20ゲージIVカテーテルを1cm下の肝門脈に挿入し、左右の肝門脈に分岐させる。
次に、カテーテルを静脈上にスライドさせますが、分岐領域の下に保ちます。血液が滴り落ち始めるまでカテーテルを下るのを許します。IVカテーテルを門脈縫合糸で固定する。
IVラインを使用して、バッファAの入ったIVボトルをカテーテルに取り付けます。次に、システムへの空気の侵入を避けながら、この溶液で肝臓を洗い流します。腎臓の下のIVCの周りに縫合糸を結びます。
その後、動物が出血できるように縫合糸の下のIVCをカットします。灌流したら、胃、腸、脾臓、肝臓に付着した他の内臓を切り取ります。次に、横隔膜および主要血管を胸腔から切り取ります。
動物から肝臓を取り出し、それを灌流トレイの上に置きます。IVラインを慎重に取り外し、再循環チャンバ内のコラゲナーゼ溶液をフックアップする。カプセルがモデル化され、濁って見えるまで肝臓に灌流させます。
通常、これには 10 ~ 15 分かかります。消化したら、肝臓をチャンバーから取り出し、約20ミリリットルの無血清DMEMを入れた10センチメートルのペトリ皿の上に置きます。いくつかのピペットチップで肝臓を優しく拾い上げ、胆道の木を捨てます。
その後、肝臓懸濁液を70マイクロメートルのセルストレーナーを通して50ミリリットルの円錐形チューブに濾過する。細胞懸濁液を室温で2分間50倍Gで遠心分離する。次いで、非実質肝細胞を含む上清を回収する。
上清を300倍Gで4°Cで5分間遠心分離する。その後、細胞ペレットを収集し、1ミリリットルの単離緩衝液に再懸濁する。製造元の指示に従って、自動セルカウンターを使用してセル番号を確認します。
次に、細胞懸濁液を遠心分離する。上清を完全に吸引し、1000万細胞あたり90マイクロリットルの単離緩衝液でペレットを再懸濁する。総細胞1,000万個あたり10マイクロリットルのCD146マイクロビーズを加える。
それをよく混ぜて、摂氏4度で15分間インキュベートします。細胞を洗浄するには、1,000万個の細胞あたり1〜2ミリリットルの単離緩衝液を加える。溶液を300倍Gで10分間遠心分離する。
その後、上清を完全に吸引し、500マイクロリットルの単離緩衝液に最大10億個の細胞を再懸濁する。次に、3ミリリットルの分離バッファーでリンスして分離カラムを作製する。細胞懸濁液を、70マイクロメートルの予備分離フィルターを積み重ねたカラムに塗布します。
カラムを 3 ミリリットルの分離バッファーで 3 回洗浄します。その後、分離器からカラムを取り出し、15ミリリットルの遠沈管の上に置きます。5ミリリットルの単離バッファーをカラム上にピペットする。
磁気ビーズ標識細胞を回収するには、プランジャーをカラムにしっかりと押し込んで細胞を洗い流します。最後に、細胞を300回Gで4°Cで5分間遠心分離する。単離されたLSECの純度および表面マーカーをフローサイトメトリーで評価した。
ゲートLSECおよびシングルレットのデータ分析およびゲーティング戦略は、前方散乱および側方散乱データに基づいています。単離されたLSECを、生存率色素およびCD45、CD146およびスタビリン−2抗体の組み合わせで染色した。生存可能なLSECをCD45陰性集団上でゲーティングし、CD146およびスタビリン−2発現について分析した。
このデータから、単離されたLSECは94%を超える生存率および90%を超える純度を有することが確認された。単離された細胞のLSEC特異的表現型を、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡を用いてさらに確認した。単離されたLSECsを完全増殖培地中で6時間培養し、光学顕微鏡によって調べた。
SEM画像の白い矢印は、LSECの特徴的な形態学的特徴であるLSECフェネストラを示している。肝臓組織の完全な灌流を確実にするための重要なステップは、適切なカテーテルテープの位置決め、カテーテルへの空気の導入の回避、およびコラゲナーゼ消化の最適なタイミングです。当社のプロトコールを用いて取得した高品質のLSECは、LSEC機能の分子機構の同定を容易にし、肝臓、健康および疾患における細胞間通信におけるそれらの役割の理解を改善する。
