このプロトコルを用いた腸からの免疫細胞の表述法解析における単離は、GIおよび全身性炎症性疾患の理解に適用可能であることが証明されている。この方法は、フルールの原子数または他の方法によってその後の免疫表現を可能にする汚染破片を最小限に抑えることによって、かなりの数の生存可能な単核細胞を分離する。腸は多くの疾患における炎症の主要な標的部位であるため、このプロトコルは、癌、アレルギー、移植、および自己免疫のマウスモデルにおける腸内免疫集団の研究に有用であり得る。
このプロトコルの歩留まりと効率を最適化するために、重要なソリューションと材料を事前に準備しておくことをお勧めします。マウスを安楽死させ、垂直中線切開を行った後、腹骨を開くために細かい解剖はさみを使用してください。鉗子を使用して、小腸を片側に移動し、下降結腸を露出させる。
コロンの直腸部分を最大限に露出させるために、下降結腸をわずかに上向きに引っ張ります。次に、骨盤の奥深くに遠位直腸を切断し、遠位直腸からセカールキャップまでの1つの単位として結腸全体を解剖する。まず、湿らせたペーパータオルの上にコロンを置き、はさみまたは鉗子の鈍い端を使用して、腸壁に軽度の圧力を加え、固形便を抽出します。
次に、ペトリ皿にコロンを入れ、18ゲージの鈍い充填針で10ミリリットルの注射器を使用して、10ミリリットルの冷たい結腸バッファーで腸を洗い流します。5~10ミリリットルの冷たい結腸バッファーを充填したシャーレにコロンを入れ、残りの大腸内容物を洗浄するために手動で攪拌します。この洗浄を2~3回繰り返し、洗浄ごとに新鮮なバッファーを含む新しいシャーレを使用します。
この後、新鮮な冷やした結腸バッファーを含む新しいシャーレにコロンを移します。結腸を縦方向に切断し、そのより筋肉質の直腸端から近位結腸まで、単一の矩形の開いた結腸片を生成する。皿の中の中央値を捨て、きれいな冷やした結腸バッファーに置き換えます。
長方形の結腸組織をコロンバッファーで湿らせたペーパータオルの上に置き、水平にスライスしてから小さな断片にスライスして切ります。20ミリリットルのチルドコロンバッファーを含む50ミリリットルのポリプロピレンコンピカルチューブに結腸断片を集めるために、細かい鉗子を使用してください。その後、チューブを30秒間激しく旋回して断片を洗浄します。
洗浄後、上清を消す前に組織断片をチューブの底に落ち着かせ、組織断片を失うことを避けるために、洗浄ごとに新鮮な結腸バッファーを使用してこの洗浄プロセス全体を3回繰り返します。まず、洗浄された結腸フラグメントを含むチューブに20ミリリットルのコラゲターゼ消化バッファーを加える。チューブを密封し、60分間2倍のGの回転速度で摂氏37度で軌道シェーカーに置きます。
組織断片が撹拌中に一定の動きをしていることを確認します。まず、66%シリカベースの密度分離培地を3つの別個の15ミリリットルのポリプロピレンチューブのそれぞれに5ミリリットル注ぎます。次に、25ミリリットルの血清ピペットを使用して、コラゲナーゼ消化器1から上清のみを収集する。
40マイクロリットルのろ過不良生地セルストレーナーを通して上清をフィルターし、清潔な50ミリリットルのポリプロピレンコニカルチューブに入れ。冷却された結腸バッファーでチューブを完全に充填し、コラゲラーゼ消化バッファーをクエンチします。次に細胞を回転させ、上清を吸引し、ペレットを氷の上に置いておきます。
テキストプロトコルで概説されているようにコラゲラーゼ消化2を実行し続けます。コラゲナーゼ消化2が完了した後、18ゲージの鈍い端の針を通して、チューブと10ミリリットルのシリンジの間で組織断片を激しく往復させる。このフラッシュを少なくとも7〜8個の通路に対して繰り返し、総組織断片または破片が見えないまで続ける。
次に、40マイクロメートルのろ過不良の生地セルストレーナーを通して組織分解懸濁液を、清潔な50ミリリットルのポリプロピレンチューブに入れる。チューブを冷やした結腸バッファーでリムに充填し、消化と遠心分離機を摂氏4度で5分間クエンチします。真空吸引を介して上清を捨て、コラゲナーゼ消化器1から対応するチューブに再懸濁ペレットを引き出します。
この後、各ペレットを24ミリリットルの44%シリカベースの密度分離培地に再び中断します。10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、この培地の8ミリリットルを66%シリカベースの密度分離媒体を含む3つのチューブのそれぞれにゆっくりと重ね合わせて使用してください。計量スケールまたはバランスを使用して遠心分離バケツ内のチューブのバランスを慎重に調整します。
859倍のGで20°Cで20分間、休憩なしで遠心分離機。ロッドは、勾配のインターフェースで細胞を破壊しないように注意して、チューブを取り外す前に完全な休息に来るようにします。まず、通常1〜2ミリリットルの厚い白いバンドが存在する5ミリリットルマーク付近の勾配界面を視覚化する。
真空吸気し、インターフェイスへの簡単なピペットアクセスを可能にするために勾配の上7ミリリットルを捨てます。連続的な手動吸引および安定した回転の手首の動きを使用して、細胞のインターフェイス層を集める。2つの勾配の間の界面が明確かつ屈折するまで収集し、新しい50ミリリットルのポリプロピレンコニカルチューブにインターフェイスを転送します。
次に、全懸濁液が50ミリリットルに達するまで、この浴槽にFACSバッファを追加します。摂氏4度で5分間800倍Gで遠心分離機。次いで、真空吸引を介して上清を吸引し、ペレットをFACSバッファーの1ミリリットルで再懸濁させた。
このビデオで説明する手順は、結腸から、または、変更を加えて、小腸から単核細胞を単一核細胞を分離するために使用することができる。さらに、細胞測定およびデータ分析は、コラゲナーゼEまたはDのいずれかを単離に使用する場合のアポトーシスリンパ球および壊死/死死リンパ球の分画を比較するために行われ、DNAse 1治療なし。アネキシン5および各単一の単一細胞懸濁液上の固定可能な生死死性染料染色に続いて、ドナーゼを含まないコラゲナーゼEは、ドナーゼを含まないコラゲナーゼDと比較して、単離後の生細胞の割合が有意に高いことを示した。
ドナーゼを使用していずれかのコラゲナーゼと比較しても.また、コラゲナーゼE群の壊死細胞を41.0%、コラゲナーゼD群で90.0%の中央値割合で同定しました。コラゲラーゼE DNAse群では75.9%、コラゲナーゼD DNAse群では80.3%。
その後、BMTまたは同種異系または同系のBMTモデルを受けた後、7日目にCD45.2バルブCレシピエントマウスから分離されたMNCにマルチペリメトリックフローサイトメトリーが適用されます。BMTレシピエントの結腸から抽出されたドナーCD4陽性およびCD8陽性T細胞の平均絶対数を計算し、比較する。したがって、このようなマウスモデルで希少な免疫細胞集団を同定および/または定量することが重要です。
希少なサブセットは、ドナー由来FOX-P3陽性T調節細胞を含む、同系および同種異系のBMTモデルの両方で評価される。この方法を用いて、ドナー由来のコロニーT調節性レシピエントマウスの結腸など、BMT後の稀なサブセットであっても、分析することができる。コラゲターゼEは摂氏37度で活動していることに留意すべきである。
したがって、すべてのコラゲターゼ溶液は、適切なコラゲターゼ活性のために事前に温め、活動を終了するために徹底的に消し止める必要があります。このプロトコルは、フルールサイトメトリー、分子生物学技術、顕微鏡、培養、および部位などによって、その後の特性評価に使用できる多数の単核細胞を可能にする。このプロトコルは、骨髄移植モデルにおける実験的対制御マウスの結腸における炎症の信頼できる評価を提供した。
このように移植耐性の新しい調節免疫機構の発見を促進する。クロストリジウム・イストリチカムのコラゲナーゼは、ラボの安全技術で取り扱うべき試薬です。吸入すると健康に有害であり、皮膚や眼の刺激を引き起こす可能性があります。
