この作品は、ウェルカムトラストからの資金によって可能となった。 JM（080964）とSCW（080948）は、マラウイ - リバプール - ウェルカムトラストの学生の身分でウェルカムトラスト·フェローシップとDTによってサポートされていました。

1。試料捕集血小板は簡単に温度、撹拌またはストレージを介して活性化することができ、したがって、彼らは慎重に扱われるべきである。血小板の準備のための血液を収集するバキュテイナーの使用がほとんどの臨床状況では避けられないですが、吸引力が潜在的に血小板活性化の原因となりますので慎重に検討する必要があります。我々の研究の病院で使用された臨床プロトコルのために、私たちのサンプルは慎重にクエン酸ナトリウムバキュテイナーに収集されます。私たちは、このまたは我々の以前の研究12で時期尚早の血小板活性化の問題を経験していない。我々は、非特異的な血液型抗原の凝集を最小限に抑えるために血液型O +個体からの血小板製剤、血液を採取。ドナーはまた、いくつかの薬は、血小板機能に影響を及ぼすことが知られている前の日から10日間の投薬を受けていない。 多血小板血漿の1.1準備（PRP） <ol><li>約5ミリリットルを収集マラリアナイーブホストまたはクエン酸ナトリウムバキュテナー（BD製品番号36276）でCMや重症マラリア（SM）の患者からの血液の2.5ミリリットルからの全血。 </li><li>室温で10分間250×gで全血を遠心分離する。 4℃遠心しないでください°Cの低温で凝集する血小板を引き起こす可能性がある。 </li><li>慎重に新しい15 mlチューブに曇り清を移す。血小板は簡単に温度変化や物理的衝撃によって活性化されるので、注意して扱われるべきである。揺れやチューブのいずれかぎくしゃく動きをすることは避けてください。 </li><li>健康なドナーと1Xリン酸緩衝液（; PBS pHは7.2〜7.4）を使用して、CMとSMの患者からの&lt;150×10 3血小板/μlのために&gt; 300×10 3血小板/μlに血小板サスペンションをカウントし、調整するノイバウアーのhaematocytometerを使用してください。血小板数を緩和し、その精度を確保するため、高希釈倍率を選択するようにしてください。 </li></ol>注：マラリアバッチリientsは健常16,17,18に比べて減少した血小板数を持っている。したがって、CMおよびUM用血小板濃度は各マラリア診断グループ内の患者のための平均血小板数に応じて調整されています。 P.熱帯熱凝集表現型は、CM分離株では一般的であると血小板濃度はすべてのCMのケースのために標準化されて以来、塊の大きさや周波数に影響を与えない強力な結合親和性ゆえ減少血小板濃度が表示されます。 貧血小板血漿の調製1.2（PPP） <ol><li> PPPを入手するには、10分間1500 xgで上記で得られたPRPの一部を遠心。血小板の大部分はチューブの底にペレット化する。 </li><li> PRPとPPPの両方が、最大2週間のために4℃で保存することができます。理想的には、凝集アッセイのために新鮮な血小板を使用しています。 8-10日後最も血小板のは非アクティブ、おそらく集約である可能性が高い。 </li></ol> 2。パラスITE文化<ol><li> 5分間370×gで遠心分離することにより5〜10ミリリットルRPMI 1640でペレット化PRBC 3回洗浄する。 注：このプロトコルですべての文化は、約1ミリリットルパック細胞容積（PCV）から開始し、5％のヘマトクリット値で維持。培養物は、所望のヘマトクリット値に到達するPRBCのいずれPCVから始まり、非感染RBC及びメディアに応じて調整することができる。 </li><li>の25mM HEPES、5％Albumax IIまたは血清、10％と5％のヘマトクリット値を達成するために、40μgの/ mlのゲンタマイシンを添加したRPMI 1640の標準的なマラリアの培養培地で培養フラスコとサプリメントでPRBCを置きます。 </li><li>シーリングとインキュベートする前に、92.5％の窒素、酸素2.5％、5％二酸化炭素の混合物で培養フラスコに浸透。あるいは、トレガ-ジェンセンの気密キャンドルジャー方法を用いることができる。 </li><li> PRBCは、患者から直接得られるために、成熟した寄生虫を取得するには、5％CO 2で37℃のインキュベーター内で24-36時間、彼らの培養フラスコをインキュベート。 注：MOST研究室と文化適応ラインは、標準的な条件下で培養中に維持するために非常に簡単です。成長率を維持するために、異なる寄生虫段を同期させることができ、後述する単純な技術がある。 </li><li>以下のように薄い血液塗抹標本を準備し、光学顕微鏡下で寄生虫の成熟を調べます。 </li></ol> 3。薄い血フィルムスライドの準備<ol><li>平らな面に載ってすりガラスのスライドの一端に血液の約10〜15μLを置きます。 </li><li>血液が均等に第二スライドの端に分散されるまで、第二スライドの端との血の一滴をタッチします。 </li><li> 45°の角度で二スライドを保持しながら、迅速かつ慎重に、最初のスライドにあまりにも多くの圧力を与えることなく、均等に分散されて、血液の薄膜を作成する最初のスライド全体に血をスライドさせます。乾燥した空気。 </li><li> 10秒間メタノールでスライドを浸します。乾燥した空気。 </li><li> 2％ギムザセントでスライドを浸し少なくとも10分間AIN。水がきれいに実行されるまで、広範囲にすすいでください。乾燥した空気。 </li><li>光学顕微鏡で90-100xの油エマルジョンレンズを使用してスライドを調べる</li></ol> 4。無性段階の精製と同期成熟したPの浄化熱帯熱 PRBCは凝集アッセイに必要なステップです。確かに、唯一の成熟寄生虫は、それが関連するリガンドを発現し、感染赤血球の表面から突出していることを、このライフサイクル段階にあるように血小板受容体に結合することができる。 Pの無性段階を浄化し、同期させる方法はいくつかあります熱帯熱マラリア原虫 ：後期無性段階はパーコール勾配19により濃縮することができる、20をソートまたはゼラチン沈降21プロトコルを用いた磁気セルは、ここで説明する。ソルビトール同期は（無nのリングは、成熟段階を得るために24-26時間培養した後、リング·ステージ22のために選択されます）ゼラチン浮揚を実行するEED。 4.1原形質ゲルの浮選原形質ゲル浮選は低体重が密リングフォームやロゼットが底に沈むしながら溶液中に残存する赤血球をこぶのあるを選択するために、ゼラチンのようなソリューションを使用しています。この技術は成熟期に感染した赤血球の純度90％まで提供し、フィールド実験に分離株の両方に使用することができる。しかし、前述のように、原形質ゲル浮選はロゼットPRBCだけでなく、高ロゼット周波数にこれらのサンプル中の還元凝集周波数につながる可能性が未熟な段階を削除します。凝集は、血小板によってpRBCsバインディング媒介している間ロゼットがPRBCと非感染赤血球の相互作用であるので、原形質ゲル浮選後ロゼットPRBCの不在は、凝集アッセイに影響を与えないだろう。これら二つの形質に関わるリガンドは異なります。主にロゼットを仲介する非感染赤血球のレセプターCR-1を補完すると。<ol><li> ℃の水浴中で37〜Prewarm Gelofusine液及び血清/ Albumax IIを含まない培地。 </li><li> 5分間370×gで室温で遠心分離することによりクリーンな滅菌を15mlチューブ、ペレット細胞に文化を転送します。 </li><li>慎重に等しいGelofusineの量とタンパク質を含まない培地中でペレットを再懸濁した細胞を邪魔しないように上清を吸引除去する。 </li><li>滅菌を15mlチューブに混合物を移し、明確な境界は、上部と下部のレベルの間で見ることができるようになるまで37℃のインキュベーター内で15〜20分間、または放置する。 </li><li>慎重に新鮮な滅菌を15mlチューブに上位層を転送し、新鮮なRPMI 10mlのを追加します。 </li><li> 5分間370×gで遠心し、注意深く上清を捨てる。 </li><li>薄い血液塗抹標本で寄生虫と発達段階を評価し、4章で説明したように光学顕微鏡下で調べる。 </li></ol>注：感染赤血球dependi 60〜90％の間で成熟しPRBC範囲文化の初期の寄生虫にNG。成熟した寄生虫の割合が高いために、≥10％の初期寄生虫と文化を使用しています。 5。アッセイを凝集<ol><li> ×10 8 PRBC /μlの1に原形質ゲル浮揚後に得られたPRBCサスペンションをカウントし、調整するノイバウアーのhaematocytometerを使用してください。 </li><li>新しい1.5 mlチューブ、5％ヘマトクリットで再懸PRBC、アクリジンオレンジ20μgの/ mlの最終濃度とPRPでの総容量の10％である。 代わりに、アクリジンオレンジ、寄生虫培養物は、使用前に5分間、25μgの/ mlのエチジウムブロマイドで染色することができる。 200μlの反応混合物の場合例えば、10μlの成熟したPRBC、健康なドナーまたは150×10 3血小板/ SM患者および無タンパク質培地170μLからμLからPRP用/μlの300×10 3血小板20μlのを追加します。 注：血小板の比率：PRBC最終反応では、午後8時01分です。格言ができているので、これは重要です。ウム試料の凝集周波数が決定される。少ない血小板がコントロールで追加された場合、すべての凝集pRBCsは塊にチャンスがあるかもしれません。 </li><li>凝集pRBCsで血小板の役割を確認するために非感染赤血球とPRPとPPPとPRBC、同様に次のコントロールを用意しております。 </li><li> 1.5〜2.0ミリリットルコニカルスクリューキャップバイアルにサスペンションを移す。 </li><li>室温で10-12 rpmで圧延して穏やかに撹拌下にバイアルを置きます。 </li><li>スライドガラス、ガラススリップ、蛍光下調べるとカバーのPRBC±血小板ミックス10μlのピペッティングすることにより調製ウェットスライドによって塊の形成を確認してください。 </li><li>サンプリングは、120分の合計15〜20分間隔で行うことができます。塊は、3つ以上の感染赤血球の集合体として考えられている。 </li></ol>

<ol>
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Dis. 197, 72-78 (2008).</li><li>Mayor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+severe+malaria+outcomes+with+platelet-mediated+clumping+and+adhesion+to+a+novel+host+receptor.">Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor.</a> PLoS One. 6, e19422 (2011).</li><li>Arman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Mediated+Clumping+of+Plasmodium+falciparum+Infected+Erythrocytes+Is+Associated+with+High+Parasitemia+but+Not+Severe+Clinical+Manifestations+of+Malaria+in+African+Children.">Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children.</a> Am. J. Trop. Med. 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D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mature-stage+Plasmodium+falciparum+by+gelatine+flotation.">Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Chotivanich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+autoagglutination+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells+and+disease+severity+in+Thailand.">Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand.</a> J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).</li><li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+is+a+common+adhesive+phenotype+and+is+associated+with+severe+malaria.">Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).</li><li>Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-adrenergic+stimulation+of+phosphatidylinositol+synthesis+in+human+platelets+as+an+alpha-2+effect+secondary+to+platelet+aggregation.">Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation.</a> J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).</li><li>Zhou, L., Schmaier, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregation+testing+in+platelet-rich+plasma:+description+of+procedures+with+the+aim+to+develop+standards+in+the+field.">Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field.</a> Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

我々は、直接フィールドに臨床分離株でPRBCを研究するために使用さ血小板媒介凝集アッセイを記載している。血小板媒介凝集、P.に特徴的な挙動熱帯熱マラリアの臨床分離株は、CD36結合分離12,23-24で頻繁に、明確な接着表現型として同定されている。我々は3つの主要なポイントを識別するために、このアッセイを使用している：1）in vitroで強いPの表現型を凝集熱帯熱マラリアは、疾患の重症度と診断2）CD36、3と共に血小板の凝集小説受容体P-セレクチンmediaties）CMの患者に存在する血小板減少症の程度と関連しているマラウイの子どもたちから分離することで PRBC塊のさらなる形成を制限するのに十分である試験管 12。塊形成における血小板の関与はセクション6で説明したように湿式スライド製剤を調べることによって実証される。血小板を高速で遠心分離によりPRPから単離することができる血液型抗原反応を最小限にするために、しかし、我々は、過度の取り扱いから、高速遠心分離から時期尚早血小板活性化を最小限にするために、全体のPRPを使用した。血小板活性が弱い血小板アゴニスト、エピネフリンまたは26に記載のアデノシン二リン酸（ADP）25を用いて血小板凝集試験により測定することができる。 以前に不十分特徴付けられているアッセイのいくつかの態様は、アッセイの結果にPRPソースおよび血液グループ抗原の効果を選ぶことの重要性であるそのうちの一つがある。我々はグループOの血液だった個体からPRPを用意+と一部の医薬品が血小板の挙動に影響を与えることができるように血が描画される前の最後の7-10日に任意の薬を取っていなかった。 凝集の成功に影響を及ぼす可能性のある他の要因がPRBCヘマトクリット、寄生虫レベルと凝集アッセイの長さが含まれています。高いヘマトクリット値及び血小板の共同使用UNT、クラスタが本当に塊またはそれらが密集しているので、あまりにも多くの細胞は単に15を一緒に座っているかどうかであるかどうかを見分けるのは難しいだろう。凝集はまた、一般的により長いインキュベーション時間とともに増加する。これらは、凝集の研究を設計する際に考慮されるべきであるすべての有用なガイドラインです。 我々は、異なる臨床グループからのサンプルは、それがそうすることが可能であれば並列同じドナーからPRPを使用して分析することができるが、このようなフィールドサイトなどの限られたリソースの設定に輸血プールが一般に限られていることがわかる。これは、アッセイを標準化するために単一のO +供与体を有することが困難である。したがって、我々は可能な限り血液適合性を確保するために、いくつかのO +ドナーを同定した。献血の負担は1つだけ、個々の上に落下しないように、複数のドナーを使用すると、大規模なサンプルサイズの場合に便利です。 単一のpeの場合15〜20分でサンプリング点がはるかに実現可能であるrsonぬれたスライドの準備を可能と重複サンプリング時間なしでアッセイ動態を行い、検定を行っています。微視的データの大部分は、視覚的かつ幾分目的であるため、細胞計数は、複数の人によって確認されたことが重要である。その場合には、一度に一つのサンプルを処理することは個人的な効率に応じて三時五十七試料日の完全な分析を可能にすることができる。 血小板凝集媒介性は、臨床および実験分離株の両方を用いて行うことができる。実験線のためには、CD36結合寄生虫が凝集周波数を最大化するために使用されることをお勧めします。アッセイは、例えばロゼット又はPRBC結合、この表現のほとんど理解され、検査面を媒介し得る血小板上の受容体の研究を可能にする阻害アッセイの凝集に用いられるような他の凝集アッセイと結合することができる。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

熱帯熱マラリア原虫は、重度のマラリア感染の大半を引き起こす。脳マラリア（CM）の根底にある病態生理学的メカニズムは十分に理解されていない、いくつかの仮説がP.の微小血管の機械的閉塞を含めて、提唱されています熱帯熱マラリア 、寄生赤血球（PRBC）。実際には、そのライフサイクルの体内赤血球段階の間、P.熱帯熱マラリア原虫は赤血球膜上に接着性を変化させて表面抗原をエクスポートすることにより、感染した赤血球の表面を改質するためのユニークな能力を持っています。これは後の毛細血管細静脈1の微小血管の内側を覆う内皮細胞への接着によって、複数の組織や臓器にPRBCの隔離が可能になります。そうすることによって、寄生虫の成熟形態が変形感染赤血球の脾臓クリアランスを避ける2、より有利な低酸素圧力3に自分の環境を制限する。このSEQUESTの結果として配給は、それが末梢血中に検出することができる唯一の​​未熟無性生殖母細胞寄生虫である。 微小血管のベッド上に発現する多数のホスト受容体への成熟したPRBCの細胞接着と隔離は厳しいと合併症のない疾患で発生します。しかし、いくつかの証拠は、特定の表現型接着剤は、マラリアの深刻な病理学的転帰に関連付けられている可能性が高いことを示唆している。このような特定のホスト寄生虫の相互作用の一例は、特定の接着剤特性を有するPRBCの結合をサポートするために、細胞間接着分子-1の能力は4,5脳マラリアの開発にリンクされているインビトロで実証されている。胎盤はまた、コンドロイチン硫酸とその行メイン受容体6として胎盤絨毛スペースを合胞体に発現し、マラリアに感染した妊婦の優遇PRBC蓄積のサイトとして認識されています。 PRBCトンのロゼット補体レセプター1（CD35）7,8を経由して感染していないO赤血球も重篤な疾患9に関連付けられている。 最も最近記載P.の一つ熱帯熱マラリア原虫の細胞接着の表現型は、in vitroで血小板媒介塊を形成するPRBCの能力である。このようなPRBC塊の形成がCD36、血小板の表面に発現糖タンパク質を必要とします。内皮細胞および血小板を含む多様な細胞型上に発現別のヒト受容体、gC1qR/HABP1/p32も、塊10を形成するために、血小板にPRBC接着を促進することが示されている。凝集は、 生体内で発生したかどうかは不明なままであるが、それは、CM 11で死亡マラウイの子どもたちの脳の微小血管に記載されて血小板の著しい蓄積を占める可能性があります。また、in vitroで凝集に対する臨床分離株の培養物の能力は直接マラウイの12の病気の重症度にリンクされていた</sup&gt;とモザンビーク患者13、（ではないがマリ14）。 不十分特徴PRBC凝集表現型のいくつかの側面では、このテーマに関する現在の研究では、標準化された手順に従っていない。これは、アッセイ15に固有の既知の高い変動の重要な課題である。ここでは、P.のin vitro血小板媒介凝集のための方法を提示それは他のグループのために一貫した方法のためのプラットフォームを提供し、今後の研究では、この表現型を調査に限界の意識を高めることを期待した熱帯熱マラリア 。マラウイに基づいている、我々は新たに収集された臨床分離株は、凍結保存を必要とすることなく、表現型のために検査することができるという利点が、特に限定されたリソースの設定のために設計されたプロトコルを提供します。

約70％のPの成熟段階を使用して血小板媒介塊アッセイの例原形質ゲル浮選による濃縮後の熱帯熱マラリア原虫は、 図2に示されている。塊は、3つ以上の感染赤血球の集合体である。アクリジンオレンジまたはエチジウムブロマイドで染色して蛍光顕微鏡で可視化することができる。エチジウムブロマイドは赤493 nmで励起極大およびローダミン色素と同様620 nmに発光極大を（持っていながら、アクリジンオレンジは、502 nmで励起極大と525 nmの（緑）の発光最大、フルオレセインとスペクトル類似しています）。それらは細胞凝集体として緑色または赤色の斑点としての蛍光の下に表示され、通常光の下でのように、アクリジンオレンジ又は臭化エチジウム染料で染色すると、図2に示すように、塊を容易に、それぞれ、顕微鏡下でスポットし（30分時点アクリジンオレンジを使用して）。塊より大きい、より大きなセル集合体は、国連が表示されますファンデ通常の光と緑色または赤色の下のスポットが大きく、それぞれの染料のために蛍光を発する。染料の標的DNA、したがって染色核、血小板および非感染赤血球は核の欠如により蛍光顕微鏡で検出されませんので。 4.7の小さなPRBC塊のランダム形成±1.6 pRBCs /塊は30分後に発生。塊のサイズが大幅に多数PRBC /視覚的にカウントすることができませんでした塊を含むいくつかの塊で120分間インキュベートした後、&gt; 15 PRBC /塊の平均に増加します。凝集表現型の周波数は、塊/複製アッセイにおいてカウント1,000感染細胞中に存在する感染した細胞の数として計算される。 <img alt="図1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> 図1。実験を凝集するための流れ作業。血小板RICHと血小板血漿（）とP.熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球培養物（B）を調製し、次いで凝集アッセイ（C）と組み合わされる。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> 図2。 P.によって感染赤血球の凝集熱帯熱マラリアの研究室では、分離します。時間0でHB3によって形成された塊、30および120多血小板血漿（）及び乏血小板血漿（B）の貧しい塊形成の分。 検定の制限特に血小板機能や影響の結果に影響を与え、これらのほとんどはすでにアルマンとロウ15によって強調された制限があります。ここでのdiffereで遭遇するかもしれない潜在的な問題のいくつかを言及アッセイのNT段階： <ol><li> in vitro培養におけるへの臨床分離株を適応することは、時にはより長い培養期間は塊の形成を可能にするために十分高い寄生虫を達成するために必要とされるように挑戦することができる。 P.の高い抗原変異率が熱帯熱マラリア 、文化適応寄生虫の接着表現型は、文化の中で長引く回後に元の感染寄生虫人口を反映しない可能性があります。 </li><li>血液型抗原に起因する非特異的凝集を避けるために、血小板ドナーは、同じアッセイに用いた臨床分離株と血液型抗原、またはユニバーサルドナーの血液抗原基O-用いるために一致すべきである。しかし、血液型を持つ人は、そのようなマラウイなどアフリカの現場で珍しいO-であり、したがって、一般的に使用される血小板は血液型O +ドナーから得られ、血液型にマッチしなければならない。 </li><li>ぬれたスライド準備に塊をカウントするCなどの画像キャプチャのために面倒かつ困難であるエルボは一定の動きである。通常、PRBCはカバースリップの端に蓄積したり、あるいは彼らは簡単に本物の塊と混同することができます &quot;false&quot;に塊を形成一緒に固執する傾向がある。細胞運動を低減するために、分析前に室温で15分間沈降に細胞を可能にする。 </li><li>凝集アッセイは時間に敏感であるため、唯一のサンプルが最適な精度のために一度に人あたり、分析することができます。二つの異なるサンプルの時間サンプリング点は、容易に同時に複数のサンプルを処理する場合、サンプル間のミスマッチのサンプリング時点で得られた、重なり合うことができる。このような状況では、洗練された定量的なソフトウェアは、クランプのサイズを計算することができるか、あるいは細胞特異的抗体は、凝集塊の組成を分析するために使用することができる。これらの技術は非常にデータの重要度を向上させることができながら、このアッセイが使用される可能性のある資源が乏しい設定で、このような技術および装置は、容易に入手できない。 </li></ol>

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A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

この方法は、血小板の媒介凝集表現型を調査<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</em臨床分離株における&gt;感染赤血球（PRBC）。これは、多血小板血漿とPRBCの懸濁液を分離し、共培養することにより行われる。

の血小板媒介クランピングのためのシンプルなプロトコル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</emリソース悪い設定で、&gt;感染した赤血球

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

a-simple-protocol-for-platelet-mediated-clumping-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

18.6K ビュー.  Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme. この方法は、血小板の媒介凝集表現型を調査熱帯熱マラリア原虫感染赤血球（PRBC）。これは、多血小板血漿とPRBCの懸濁液を分離し、共培養することにより行われる。

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

免疫・感染学

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

黄熱病の蚊から血球を収集し、染色のためのプロトコルネッタイシマカ</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコル<em&gt;ハマダラカ</em&gt;属。

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

の分離<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</em磁気手段によって&gt;後期感染赤血球

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

C型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

高収率の精製<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</emオプソニン抗体アッセイにおける使用のための&gt;メロゾイト

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

簡単かつ迅速なプロトコル非酵素的に浸潤リンパ球の分析のための新鮮なヒト組織を解離

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.