著者は、子供や大人の血漿ドナー、および医学研究のパプアニューギニア研究所のスタッフを認識したい。著者らは、この技術の開発への貢献のためにアマンディーヌB Carmagnac、キャサリンQニエ、ダニー·W·ウィルソン、イヴォミューラーとダイアナSハンセンに感謝したいし、血液、血清パックのオーストラリア赤十字に感謝だろう。この作品は、ビクトリア朝の州政府運用インフラストラクチャのサポートおよびオーストラリア政府NHMRC IRIISSによって可能になりました。この作品は、国立保健医療研究評議会によってサポートされていました＃1031212および＃637406を付与し、国立衛生研究所は、＃AI089686を付与します。

注：すべてのステップは、遠心分離およびフローサイトメトリーに加えて、無菌性を維持するために、層流フード内で行われるべきである。適切な予防措置がヒトのサンプルの取り扱いに関する取られることを確認してください。アッセイは、血漿の少量のために非常に敏感である。パプアニューギニア（PNG）から半免疫子供からプラズマで78％ - 提供希釈を5に至るまでの応答を解決するために最適である。最適な希釈は、プラズマセットがテストされていると異なる場合がありますので、それがプラズマは、各アプリケーションのための実験条件を決定するために調べられることをお奨めします。 2陰性コントロール血漿の非存在下でのメロゾイトを用いたTHP-1細胞の混入を確認してください。およびメロゾイトを用いたTHP-1細胞は、マラリアナイーブ個体からの血漿のプールでオプソニン化。これは、THP-1細胞へのメロゾイトの遵守のための制御を可能にし、食作用のイベントの厳密なフローサイトメトリーティングを可能にする。 PNG血漿試料を用いた医学研究諮問委員会、パプアニューギニア保健省、ウォルターとエリザホール研究所ヒューマン研究倫理委員会（プロジェクト番号4月4日）で承認されました。書面による同意は、すべての参加者の両親/保護者から得られた。 1。THP-1培養<ol><li> 5％CO 2加湿インキュベーター中、10％ウシ胎児血清（FCS）、55μM2 - mercapthoethanol（THP-1培地）を補充したRPMI-1640培地中で37℃でのヒト単球細胞株THP-1を維持する。 </li><li> 5×10 5細胞/ ml以下の濃度で細胞を維持する。注：過成長付着細胞へとダウンレギュレーションのFc受容体の分化になります。細胞が約10回継代された後、細胞表現型を維持するために新しいバイアルを解凍。 </li></ol> 2。抗体サンプル調製と希釈<ol><li> 56℃でインキュベートすることによってテストされ、マラリアナイーブ管理血漿ことへの熱不活性化プラズマ; 30分間C </li><li>直列THP-1培地中で1/2、000に、血漿試料を希釈する。 </li><li> -20℃で保存希釈した血漿</li></ol>高度同期Pの3。文化熱帯マラリア 注：GFP発現寄生虫ラインD10-PfPHG 27が原因寄生虫の同期とE64添加の制御されたタイミングをアシストする、その48時間のライフサイクルに利用された。この行は、細胞質ゾル中のGFPを発現しているためさらに、この行は、GFPのフローサイトメトリー検出によって寄生虫で無料のメロゾイトの検出を可能にする。しかし、GFPの蛍光強度がTHP-1細胞内で視覚化を提供するのに十分ではないため、メロゾイトはエチジウムブロマイド（EtBrを）で対比されている。他の寄生虫株は、タイトな同期が達成可能であることを条件として、利用することができる。侵入15を阻害するために成熟型28とヘパリンを溶解し、ソルビトール、治療の組み合わせを使用して、寄生虫を同期させる</sアップ&gt;。 <ol><li> Pを維持25 mg / mlのHEPES、50μg/ mlのヒポキサンチン、10％プールヒト血清、2 mg / mlの重炭酸ナトリウムを補充したRPMI-1640培地（pH7.4）中3％のヘマトクリットにおけるO +ヒト赤血球（RBC）中の熱帯熱マラリア原虫 、および20μg/ mlのゲンタマイシン（寄生虫培地）。 GFP +寄生虫を選択するために培養液に5 mg / mlのブラストサイジンS塩酸塩を追加します。 </li><li> 1％O 2、4％CO 2及び95％N 2の雰囲気下で37℃で気密ボックスまたは代替的に密封された二重培養フラスコ中で培養物をインキュベートする。 </li><li>寄生虫血をモニターするために10分間リン酸緩衝液（ギムザ溶液）6.7 mMの液（pH7.1）中で調製し、薄い塗抹スライドを、10秒間100％メタノールで固定し、10％ギムザ液で染色する。染色後、水と空気乾燥でスライドをすすぐ。 100倍油浸レンズを用いて寄生虫を評価する。 </li><li>文化を分割し、感染していない追加することにより、5パーセント感染RBC以下の寄生虫の寄生虫の文化を維持する必要に応じて、RBC。 </li><li>ヘパリンと同期するように、リング段階の培養に医療グレードのヘパリン20 IU / mLを加え。 </li><li>寄生虫の大半は分裂の段階にある場合には、5分間300×gでペレット細胞は、分裂の破裂およびメロゾイト侵入を可能にするために寄生虫の培地中のヘパリン含有培地で再懸濁を削除します。 </li><li> 4時間後、それ以上のメロゾイト侵入をブロックし、バックの文化に20 IU / mlのヘパリンを追加します。 NOTE：寄生虫が十分に同期される前に、ソルビトールおよびヘパリン治療のいくつかのサイクルが必要とされ得る。 5％の寄生虫 - メロゾイトの適切な数を生成するには、3から寄生虫の文化の150ミリリットルを用意。 </li></ol>後期Pの4。分離熱帯熱マラリア栄養型<ol><li>三十六時間の培養液にヘパリンを戻した後、5分間300×gで培養した細胞をペレット化し、25％のヘマトクリットで寄生虫培地中でペレットを再懸濁。 </li><li>大型磁気カラム（6.3のマトリックス容積を添付ml）を磁石にし、全ての気泡が除去されることを確認しながら、寄生虫媒体でカラムを平衡化させます。 </li><li>再懸 ​​濁Pを追加熱帯熱マラリアの列に文化、毎秒1滴に流量を調整します。 </li><li>文化がカラムを通過した後、フロースルーが明確実行されるまで、寄生虫媒体でカラムを洗浄。 </li><li> 37℃の寄生虫培地30ミリリットルの列から寄生虫を溶出する。 </li><li> 、寄生虫の薄汚れを準備し10秒間100％メタノールで固定し、3分間のギムザ液で染色。顕微鏡下でスライドを調べ、寄生虫はほとんどの赤血球を埋めていることを確認し、初期の分裂段階にあるように見える。寄生虫は、適切な成熟段階に達していない場合は、適切に開発されるまで、1％O 2、4％CO 2及び95％N 2の雰囲気下、37℃のインキュベーターに精製された寄生虫を返す。 NOTE：90％以上の感染した赤血球の純度はRを確実にするために必要とされるBCSがメロゾイト準備を汚染しない。 </li><li> 。10μMのE64 6（エポキシスクシニル-L-leucylamido（4 - グアニジノ）ブタン（E64）で孤立シゾントを扱う - 10時間注：E64とのより長いインキュベーション時間が可能であり、しかし、生産メロゾイトはもはや侵襲的なことはありません。 </li></ol> Pの5。分離熱帯熱マラリア原虫メロゾイト<ol><li> E64とのインキュベーション後、100％メタノールで細胞を固定し、膜に囲まれたメロゾイトの形成を評価するためのギムザ溶液で染色、寄生虫を汚す。注：寄生虫の50％より多くが膜囲まメロゾイトを形成している場合は、メロゾイトの良好な収率が得られる。 </li><li> 8分間1900×gでペレットE64処理シゾント。残りのヒト血清を除去するために25 mg / mlのHEPES、50μg/ mlのヒポキサン​​チン、2 mg / mlの重炭酸ナトリウム、および20μg/ mlのゲンタマイシン（洗浄媒質）を補充したRT RPMI-1640培地（pH7.4）を50mlで洗浄する。 </li><li>洗浄培地2mlにペレットを再懸濁。注：FCS含有THP-1メディアは濾過中に泡立ちが生成されます使用する。 </li><li>再懸濁したE64-シゾント2mlの1.2μm/32ミリメートルシリンジフィルターでろ過する。 10ミリリットルチューブにろ液を集める。注：ろ液をフィルターに集め、未破裂シゾントや破片で、メロゾイトおよびヘモゾイン結晶が含まれています。 </li><li>磁石に小さな磁気カラムを取り付け、500μlのTHP-1培地で平衡化させます。 </li><li>磁気カラムにろ液を渡します。フロースルーを収集します。注：メロゾイトは通過するヘモゾインは、カラムに結合します。 </li><li>毎回通る流れを集め、ヘモゾインを除去してカラムに2回以上、フロースルーを渡す。 </li><li>残りのメロゾイトを収集するために、RT、THP-1培地2mlでカラムを洗浄します。 </li><li> 10μg/ mlの（最終濃度）で処理し、室温で30分間染色でのEtBrを追加します。光退色を防止するために、光から保護してください。注：すべてのEtBrを汚染ていることを確認した液体とpラスチック廃棄物は、細胞毒性化学物質に適した方法で処分される。メロゾイトは、このインキュベーション後に、もはや侵襲的ではありません。 </li><li> 10分間4000×gでメロゾイトをスピンダウン。 </li><li>適切な廃棄容器に上清を捨てる。 </li><li> 4ミリリットルTHP-1培地でメロゾイトペレットを再懸濁し、10分間4000×gでスピンダウン。 </li><li> 15ミリリットルの容量にしたTHP-1培地を追加し、光から保護します。 </li></ol>フローサイトメトリーによる6。定量化メロゾイト濃度<ol><li> RTにカウントビーズを持参してください。 </li><li>メロゾイトを希釈するため、0.5％BSAを含むPBSを準備します。 </li><li> 3希釈でメロゾイトを数える。 100中1; 50と25での1の1はそれぞれ、PBS +0.5％BSAを940、930および910μlの3 FACSチューブを準備します。それぞれ、チューブあたり精製されたメロゾイトの10、20および40を添加する。 </li><li>渦は30秒間ビーズをカウントし、希釈されたメロゾイトを含むFACSチューブあたりのビーズの50μlを加える。 </li><li> 3 DILを実行488nmレーザーを備えたフローサイトメーターでサンプルをメロゾイトuted。 EtBrをおよびGFP蛍光のデュアル蛍光に基づいてメロゾイトの厳しいゲートを設定し、ゲートが別々のチャンネルで蛍光によってビーズを数える。 2000ビーズが収集されるまでのイベントを取得する。注：これらの命令は、EtBrで対比染色されたカウントのGFP +メロゾイトを参照してください。寄生虫GFP発現を利用しない場合には、側方散乱とのEtBrの蛍光に基づいてメロゾイトゲートを設定します。 </li><li> 2000カウントのビーズイベントによってメロゾイトイベントの数で除してビーズ、各希釈用の比率を計算します。メロゾイトの比率を決定する。チューブ毎に添加ビーズ50μlのビーズの数を決定するために、計数ビーズバッチの仕様を使用してください。 </li><li>希釈係数をとメロゾイトで50μlのビーズの数を掛ける：その希釈倍率のためのビーズの比率を。この数は、1mlあたりメロゾイトの濃度に相当します。目を実行する各希釈するためのステップをESE。 </li><li> 3希釈液の両端で測定メロゾイト濃度を平均する。 50で100、1で1のために測定された濃度が10％を超える標準偏差を、そして1 25内の希釈液を、カウントのサンプルを作成する際に、技術的に不適切な記述を示します。注意して​​ください。 </li><li> THP-1細胞あたり4メロゾイトの最終比を確保するために、THP-1培地中に8×10 6メロゾイト/ mlで再懸濁メロゾイト。 NOTE：THP-1比率に対する他のメロゾイトを使用してもよく、および濃度に応じて修正すべきである。 </li></ol> 7。食作用アッセイ<ol><li> 96ウェルU底プレートのウェルあたりの熱非アクティブのFCS 200μl加え、プレートをブロックするために、RT、O / Nで去る。インキュベーションに続いて、FCSを削除し、200μlの滅菌PBSで2回、ウェルを洗う。必要になるまで4℃で、PBSと店舗プレートを取り外します。 </li><li> 1×10で試料あたり三連のウェルを可能にする、血漿サンプルおよびコントロールをテストするために必要なTHP​​-1細胞の数を計算する<suP&gt; 5 THP-1細胞ウェルあたり。 </li><li>血球計スライド上に文化の10μlをロードすることによって、THP-1培養濃度を測定。顕微鏡下で血球計の16の角の正方形の4組の中に存在する細胞の数をカウントし、カウントを平均する。ミリリットル当たりの細胞の数を計算するために万で平均回数を掛けます。 </li><li> 5分間500×gでTHP-1細胞の必要数をスピンダウンし、そしてTHP-1培地中の6.7×10 5細胞/ mlで再懸濁する。 </li><li> 10 5細胞/ウェルで、その結果、FCSでブロックされた96ウェルU底プレートにウェル当たりのTHP-1培地中のTHP-1細胞を150μlを加える。テストされる試料あたり3ウェルを準備します。メロゾイトを追加する準備ができるまで、インキュベーターにプレートを返します。 </li><li>よく別々のFCSでブロックされた96ウェルU底プレートに8×10 6 / ml当たりのメロゾイト準備150μlのを追加します。テストサンプルあたり1をよく準備する</li><li> tに、ウェルごとに調製した希釈血漿サンプルを10μlを追加彼はメロゾイトが含まれているプレートと、均一な溶液を確保するために、よく混ぜる。 </li><li>インキュベーターからのTHP-1プレートを取り外し、よく血漿サンプルあたり三連ウェルで、THP-1細胞を含むあたりのメロゾイト/血漿溶液50μlを加える。 </li><li>よく混ぜて、5％CO 2、40分間加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートする。光から保護するためにホイルでカバーしています。 </li><li> 40分後、4℃、500×gで5分間遠心分離サンプルが食作用を逮捕する遠心機を予備冷却。 </li><li>上清を除去し、氷冷PBS +0.5％BSA 2のEDTA（FACS緩衝液）中で細胞を2回洗浄します。 NOTE：EDTA、フローサイトメトリー分析のための単一細胞懸濁液を維持するのが容易になる。 </li><li> PBS中の2％パラホルムアルデヒド（PFA）+0.5％BSA 2のEDTA（FACS固定液）の90μLで細胞を固定します。光から保護して取得、まで氷上のままにしておきます。 </li></ol> 8。フローサイトメトリー<ol><li>装備WIフローサイトメーターを用いて、サンプルを取得する488nmレーザー、高スループットプレートリーダーアタッチメントを番目。注：これは1メロゾイトの準備からテストされる400血漿サンプルまで可能になります。細胞はまた、マニュアルサンプルローディング用のチューブに転送することができます。 </li><li>前方および側方散乱によるゲート可能なTHP-1細胞。 </li><li>コントロールのメロゾイトなしプラズマを用いたTHP-1細胞のに基づいてEtBrを正のゲートを設定します。 </li><li>サンプルあたり10,000事象の最小値を取得する。 </li></ol> 9。データ解析<ol><li>解析ソフトにフローサイトメトリーを使用してデータを分析し、EtBrを正のイベントのために厳格なゲートを設定します。 </li><li>非免疫血漿を試料マイナス％陽性細胞についてのEtBr +細胞の％：各サンプルのパーセント食作用を計算します。 </li><li>三重全体の平均の結果。注：10％を超える三連の標準偏差は、実験的な不正確さを示している。いくつかの背景のEtBr陽性事象はmerozoiの結果として観察されることがあるTE THP-1細胞の表面への付着が、メロゾイトを含むすべてのサンプル間で一貫している必要があります。 「メロゾイトを用いたTHP-1細胞および無血漿 &#39;制御に基づいてゲートを設定し、[コントロール&#39;非免疫血漿を用いたTHP-1細胞のいずれかのバックグラウンドを差し引くことにより、内部化する蛍光を反射％の貪食になります/のみメロゾイトを貪食。 </li></ol>

<ol>
	<li>Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-globulin+and+acquired+immunity+to+human+malaria.">Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria.</a> Nature. 192, 733-737 (1961).</li><li>Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G., Medicine, P. L. o. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+anti-merozoite+antibodies+and+incidence+of+Plasmodium+falciparum+malaria:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Medicine. 7, (2010).</li><li>Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+protect+humans+against+Plasmodium+falciparum+blood+stages+do+not+on+their+own+inhibit+parasite+growth+and+invasion+in+vitro,+but+act+in+cooperation+with+monocytes.">Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).</li><li>Jafarshad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+mechanism+involved+in+defense+against+malaria+requires+costimulation+of+monocytes+FcgammaRII+and+FcgammaRIII.">A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII.</a> Journal of immunology. 178, 3099-3106 (1950).</li><li>Genton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+blood-stage+malaria+vaccine+reduces+Plasmodium+falciparum+density+and+exerts+selective+pressure+on+parasite+populations+in+a+phase+1-2b+trial+in+Papua+New+Guinea.">A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea.</a> The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).</li><li>Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+MSP3+candidate+vaccine.">Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine.</a> The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).</li><li>Llewellyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+antibody-dependent+respiratory+burst+activity+from+mouse+neutrophils+on+Plasmodium+yoelii+malaria+challenge+outcome.">Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome.</a> Journal of leukocyte biology. , (2013).</li><li>McIntosh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+human+FcgammaRI+in+mediating+protection+to+malaria.">The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria.</a> PLoS pathogens. 3, 72 (2007).</li><li>Pleass, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antimalarial+antibodies+highlight+the+importance+of+the+antibody+Fc+region+in+mediating+protection.">Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection.</a> Blood. 102, 4424-4430 (2003).</li><li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonizing+Antibodies+to+P.+falciparum+Merozoites+Associated+with+Immunity+to+Clinical+Malaria.">Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Joos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Protection+from+Falciparum+Malaria+Correlates+with+Neutrophil+Respiratory+Bursts+Induced+by+Merozoites+Opsonized+with+Human+Serum+Antibodies.">Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonization+and+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+merozoites+measured+by+flow+cytometry.">Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).</li><li>Richards, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Prioritization+of+Merozoite+Antigens+as+Targets+of+Protective+Human+Immunity+to+Plasmodium+falciparum+Malaria+for+Vaccine+and+Biomarker+Development.">Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development.</a> The Journal of Immunology. , (2013).</li><li>Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+parasite+exit+from+the+host+erythrocyte:+a+two-step+process+requiring+extraerythrocytic+proteolysis.">Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).</li><li>Boyle, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+viable+Plasmodium+falciparum+merozoites+to+define+erythrocyte+invasion+events+and+advance+vaccine+and+drug+development.">Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).</li><li>Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+timing+of+action+of+anti-malarial+drugs+against+Plasmodium+falciparum.">Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).</li><li>Angrisano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Localisation+of+Actin+Filaments+across+Developmental+Stages+of+the+Malaria+Parasite.">Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+dissection+of+coordinated+events+during+malaria+parasite+invasion+of+the+human+erythrocyte.">Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte.</a> Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).</li><li>Zuccala, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcompartmentalisation+of+Proteins+in+the+Rhoptries+Correlates+with+Ordered+Events+of+Erythrocyte+Invasion+by+the+Blood+Stage+Malaria+Parasite.">Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Marapana, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+Parasite+Signal+Peptide+Peptidase+is+an+ER-Resident+Protease+Required+for+Growth+but+not+for+Invasion.">Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion.</a> Traffic. 13, 1457-1465 (2012).</li><li>Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+effect+of+monocytes+with+Papua+New+Guinea+sera+on+Plasmodium+falciparum+in+culture.">Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture.</a> International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).</li><li>Schofield, L., Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+immunity+to+malaria.">Clinical immunity to malaria.</a> Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).</li><li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+of+opsonizing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+merozoites.">Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+Improved+Phagocytosis+Assay+to+Evaluate+the+Effect+of+HIV+on+Specific+Antibodies+to+Pregnancy-Associated+Malaria.">Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fluorescent+Plasmodium+falciparum+for+in+vitro+growth+inhibition+assays.">Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays.</a> Malar J. 9, 152 (2010).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+proteolytic+activity+of+a+membrane+protein+in+Plasmodium+falciparum+by+phosphatidyl+inositol-specific+phospholipase.">Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase.</a> C. Nature. 332, 457-459 (1988).</li><li>Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemozoin+induces+macrophage+chemokine+expression+through+oxidative+stress-dependent+and+-independent+mechanisms.">Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms.</a> J Immunol. 174, 475-484 (2005).</li><li>Schofield, L., Tachado, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+host+cell+function+by+glycosylphosphatidylinositols+of+the+parasitic+protozoa.">Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa.</a> Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).</li><li>Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Plasmodium+falciparum+merozoite+phagocytosis+by+monocytes+from+immune+individuals.">Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals.</a> Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).</li><li>Lunov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+uptake+of+functionalized+polystyrene+nanoparticles+by+human+macrophages+and+a+monocytic+cell+line.">Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line.</a> ACS. 5, 1657-1669 (2011).</li><li>Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro.">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li><li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonopsonic+monocyte/macrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes:+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance.">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

メロゾイト食作用を測定するために、2技術の習熟が必要です。メロゾイトおよびTHP-1食作用アッセイの精製を。これら2つの手法を組み合わせるための最も重要なステップは次のとおりです。1）高同期さ寄生虫; 2）膜囲まメロゾイトを得る正しい時刻にE64を追加する。 3）凝集を避けるために、ヘモゾインの取り外し;フローサイトメトリーによる4）正確メロゾイトカウント; 5）使用されるプラズマの希釈;および6）低細胞密度およびTHP-1細胞の継代数を維持する。これらの重要な側面を慎重に検討、堅牢な貪食応答が観察されるようになります。 ここで説明したが食作用を評価するためのメロゾイトの調製は、技術は、広範囲の用途に利用することができる。にかかわらず、下流の方法論、最適なメロゾイト準備が正しくメロゾイトを生成するために、E64のほか、タイミングに依存しています。ここで説明する方法は、E64 yに示されている侵入イベントおよび薬剤感受性アッセイ、15〜20の高解像度顕微鏡で使用するための侵襲性のメロゾイトをield。メロゾイト生存率は食作用に必須ではないが、メロゾイト表面被膜の完全性が要求される。したがって、ここで説明E64の方法は、高品質のメロゾイト表面コートに抗体応答を評価するために生成されることを可能にする。 E64があまりに早く添加されるか、または遅すぎる膜封入メロゾイトが形成されていない場合は、 図1に概説される。この理由のために、高度に同期寄生虫培養物が必要とされる。ここで、緊密にソルビトールおよびヘパリン治療の使用は、2時間のウィンドウにD10-GFP寄生虫培養物を同期化について説明する。ヘパリンは、他の研究室の分離株でgametocytogenesisを促進することができ、従って慎重に使用する必要があります。例えば、アラニンのような代替の同期方法はまた、緊密に同期した寄生虫が29を産生していることを条件として、使用することができる。 E64非同期寄生虫に追加された場合、下側支柱膜に囲まれたメロゾイトのortionが生成され、残りの寄生虫に感染した赤血球は通常、破裂、異常な形態を開発するのどちらか。メンブレン囲まメロゾイトに発展していない寄生虫の存在は、フィルタの目詰まりが生じ、大幅に得メロゾイト収量が減少します。 膜に囲まれたメロゾイトの濾過中、ヘモゾインは、消化液胞から遊離され、溶液中の遊離結晶として存在している。ヘモゾインは非常に炎症誘発性であり、単球およびマクロファージの食作用の応答30,31を調節することが報告されている。 図2に示すように、食作用を調節することに加えて、ヘモゾインは、溶液中メロゾイトを有する凝集体を形成することができる。 THP-1細胞は、これらの凝集体を貪食することができるように、これは抗体媒介性食作用を解決するための主要な交絡因子であることができる。そのため、ヘモゾインの除去はAVにこのアッセイで必要となる食細胞生物学にヘモゾインのOIDさらに複雑。メロゾイト定量化が必要とされる場合に特に、他の用途のための自由なメロゾイトを生成するためにこの技術を使用する場合に加えて、ヘモゾインを削除するという失敗も有害であり得る。 図4に概説したように、メロゾイトの数はTHP-1細胞による食作用の程度に影響を与えることができるアッセイに加えた。フローサイトメトリーは、メロゾイト濃度の列挙を可能にする慎重なピペット操作およびメロゾイトの数を複製するものの、精度を向上させるために必要である。複数の寄生線が並んで試験される場合、これは特に重要である。それは、以前の応答が23を辞退する前に、PNGから半免疫子供からプラズマを大幅に希釈することができることが実証されている。 phagocytの大規模な範囲を生産し12歳のPNG子供 - 5のコホートのためのプラズマの最適な希釈（1/120、血漿の000最終希釈）が、ここで説明した（ - 19％、20から39パーセント、40から59パーセントと60 - 0〜79％の食作用） を図5に記載されてOSIS応答は、この範囲は、4つのグループに応答の層別に許可され、回帰モデリングはオプソニン応答が関連していたことを明らかにしたそれはTHP-1細胞による食作用が飽和または検出レベル以下れないように血漿希釈を調整する必要があり得る異なるコホート研究のために臨床的疾患及び高密度寄生虫10からの保護。 フローサイトメトリー顕微鏡よりも改善された精度で、迅速かつ定量化可能な食作用を可能にする。このプロトコルは、高スループット、自然に獲得した体液性免疫を研究する96ウェルプレートのプレートベースで自動化された買収である。この方法は、しかしながら、そのような代替SYBRGREEN、DAPIおよびプロピジウムヨウ素などのDNAの汚れ、膜の汚れやタンパク質汚れを利用することができる、エチジウムブロマイドでメロゾイトの染色を必要とする。このアッセイは、primarの影響を受けやすいだろうY単球または好中球、および食細胞またはFcRは生物学に関心があった場合に適応させることができた。 PMAとインビトロで分化初代細胞またはTHP-1細胞は、マラリアおよび他の病原体12、32-34に食作用を研究するために使用することができる。これらの細胞は接着性であり、また非抗体媒介貪食35を表示しかし初代細胞を使用することは困難な場合があります。また、純度、生存率および機能性の変動は、主食細胞の使用にいくつかの重要な制限があります。メロゾイト食作用に関与するFc受容体は、特徴付けされていないままであり、したがって、特定のFc受容体への遮断抗体を使用すると、食作用をメロゾイトする各FC受容体の寄与を明らかにできた。 THP-1食作用のFcR依存しているように、これは観測され、食作用の直接的な解釈を可能にします。このアッセイはまた、utilにすることによって達成することができるオプソニン抗体の抗原特異性に対処に役立つメロゾイト表面抗原にノックアウト寄生虫izing、または表面タンパク質をメロゾイトするアフィニティー精製されたヒト抗体を使用する。また、深さメロゾイト食作用、以下のサイトカイン応答の研究が欠けており、このアッセイを用いて達成することができる。 これらの2つの技術は、官能antimerozoite抗体の研究に相当な進歩を構成する。高品質のメロゾイトの精製は、凍結保存メロゾイト、またはメロゾイト抗原でコーティングされた蛍光ミクロスフェアを使用することが有利である。このアッセイは、自然に獲得免疫を評価するためのツールと​​して使用されてきたが、ワクチン接種に応答して、免疫の獲得に対処するための重要なツールを証明することができる。それは最近、食作用またはオプソニン化メロゾイトは、臨床マラリアからの保護と関連していることが示されたが、 インビボ phagocytoにインビトロ THP-1食作用から直接結論を引き出すことは不可能であるこのアッセイにおいて、食作用などのメロゾイトのSISは、静的な条件の下で、赤血球を、競合が存在しない場合に発生します。このアッセイの潜在的な適応は、したがってマラリアおよびメロゾイト食作用のさらなる理解のための多目的ツールを提供することができる。

熱帯熱マラリア原虫マラリアに対する免疫のための抗体の重要性は、高度免疫大人からの免疫グロブリンを受動的に緩和する疾患1、その結果重症マラリアに苦しむ子どもたちに移したとき、40年前に示された。その結果、かなりの努力は主にELISAによりペプチドまたは細菌で発現するタンパク質に対する抗体価を測定を通じて、保護マラリア免疫の標的を同定するために努めてきた。 ELISAに基づく血清学も研究間の非常に変化が証明されたし、抗体の機能2には対応していません。多くのマラリア抗原は細胞親和性IgG1およびIgG3抗体プロファイル、特にメロゾイト表面抗原3を誘導する。このサブクラスバイアスは、食細胞による抗体のFc受容体（FcRで）相互作用がantimerozoite抗体4をオプソニン化のエフェクター機能にとって重要であることを示唆している。開発中のいくつかのメロゾイト抗原ワクチンをするように設計されてい食細胞のエフェクター機能5,6を誘発し、齧歯類マラリアモデルにおける抗体のFcR相互作用の重要性のための重要な証拠が7-9が存在し、いくつかの最近の研究は、ヒトにおけるマラリアに対する免疫のための機能的抗体および食細胞のエフェクター機能の重要性を支持するものの10、11、この領域が不十分な研究されたままになります。メロゾイト特定のオプソニン抗体への研究は、2つの要因によって制限されていた。良質のメロゾイトを分離することが困難。初代細胞から、変数貪食応答。 最近まで、高速遠心分離又はパーコール密度勾配は、シゾント培養物を破裂の培養上清からのメロゾイトを単離するために利用された。これらのメロゾイトはほとんど生存可能であった、と多くの場合、さらに密度遠心分離によって操作し、複数のウォッシュアッセイで使用する前に12、または凍結保存11を繰り返します。これらのPROCessesは、潜在的にメロゾイト表面から多くの末梢に関連するタンパク質、マラリア免疫13の抗原性標的であることが知られているタンパク質を切り離す。最近、システインプロテアーゼ阻害剤トランス-エポキシスクシニル-L-leucylamido（4 - グアニジノ）ブタン（E64）は、生存可能なメロゾイトを生成するために使用されている。 E64は、生存メロゾイト15,16を遊離濾過によって破壊することができる膜封入メロゾイト14を生成する、シゾントの破裂を防止する。この手法は、赤血球侵入15、17〜19の間の多数のタンパク質の空間分解能につながったといくつかの抗マラリア薬16、20の段階特定の効果を明らかにした。しかし、実行可能なメロゾイトの生成は技術的に困難なままです。免疫の機能アッセイ、中の生存メロゾイト精製およびそれらの使用のための詳細なプロトコルには、この技術とアプリケーションの普及を支援するために抗体の標準化された機能アッセイ：オプソニン化および食作用における細胞の協力は、ここで説明されている。 この技術は、好中球呼吸バースト、抗体依存性細胞阻害（ADCI）、および代替メロゾイト食作用アッセイなどメロゾイトオプソニンの以前のin vitroアッセイ、上の有意な進歩を示しています。これらのアッセイは、寄生虫の入力の変化と主食細胞11、21の活性に再現性に乏しい。ヘモゾインを汚染することも深く食細胞機能22に影響を及ぼす可能性があります。最近報告された、堅牢で再現性のメロゾイト食作用アッセイ23は、前単球細胞株THP-1 24を利用しています。それは非接着性であり、特異的Fc受容体媒介性食作用25,26を実行するので、これはハイスループットフローサイトメトリーアッセイのための理想的な細胞型である。さらに複雑投資家間食作用をtigatingする食作用の程度は、THP-1細胞および血漿濃度に対してメロゾイトの数に依存することである。実験間の再現性を確保するために、メロゾイトが列挙されるべきであると規定された濃度を用いる。その小さなサイズのために、フローサイトメトリー定量化が必要とされる。 ここで説明する手順は、ヘモゾインが削除され、実行可能なメロゾイトを生成し、オプソニン化および食作用に続いてメロゾイトのフローサイトメトリーの列挙のためにこれらのメロゾイトの適用について説明します。技術的に要求が、説明された技術は、自然免疫を獲得し、ワクチンが誘導するメロゾイト表面特異的抗体応答の寄与を解明するのに有用であることを証明し得る。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">THP-1 cell line</td>
			<td style="width:225px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">TIB-202</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31800-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:225px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercapthoethanol&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td>Use in Fume Hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pen/Strep Solution (100x)</td>
			<td style="width:225px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">HEPES</td>
			<td style="width:225px;">SAFC</td>
			<td style="width:119px;">90909C</td>
			<td style="width:373px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hypoxanthine</td>
			<td style="width:225px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Human Serum&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Donation from Autralian Red Cross</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available commercially (i.e. Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.06329.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentamycin</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;">61022027</td>
			<td style="width:373px;">Injection Quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin Sodium BP (5000IU/mL)</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>procine origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S-hydrochloride</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-sorbitol</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">&#160;50-70-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E64 Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">98281-100G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4.2H20</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10383.4G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:317px;">Giemsa&#39;s azur eosin methylene blue solution</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1.09204.0500</td>
			<td style="width:373px;">1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrodisc Syringe Filters 1.2-&#956;m/32-mm</td>
			<td style="width:225px;">Pall Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">4656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">QuadroMACS Separator (for small column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td>Interchangeable with MidiMACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">VarioMACS Separator (for large columns)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-090-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Column (small magnetic column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">large magnetic column</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:225px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1510433</td>
			<td>Cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:225px;">Invitogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader</td>
			<td style="width:225px;">BD Biopsciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">FlowJo cytometry analysis software</td>
			<td style="width:225px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield purification of plasmodium falciparum merozoites for use in opsonizing antibody assays

熱帯熱マラリア原虫のメロゾイト抗原は、潜在的なマラリアワクチンとして開発が進められている。マラリアに対する免疫の一態様は、貪食細胞による血液からの遊離メロゾイトの除去である。しかしメロゾイト特定オプソニン抗体の機能的有効性を評価することにより、メロゾイトの短い半減期および一次貪食細胞の変動に困難である。本明細書に詳細に記載プロ単球細胞株THP-1を用いてE64プロテアーゼ阻害剤を使用して実行可能なメロゾイトを生成するための方法、およびメロゾイトのアッセイオプソニン食作用に依存している。 E64は、治療シゾントの濾過によって放出されたメロゾイトの開発を可能にしながらシゾントの破裂を防止する。臭化エチジウム標識されたメロゾイトは、ヒト血漿試料でオプソニン化し、THP-1細胞に添加する。食作用は、標準化ハイスループットプロトコルによって評価される。実行可​​能なメロゾイトはNUMERを評価するための貴重な資源であるPの組織単位（OU）の側面免疫機能の評価に熱帯熱マラリア生物学。このアッセイで測定した抗体レベルが自然に暴露された個体におけるマラリアの臨床免疫と関連している。アッセイはまた、ワクチン誘発された抗体を評価するために有用であり得る。

前E64処理に寄生虫の成熟段階は、膜で囲まれたメロゾイトを生成するために重要である。 図1AIは E64を追加するためのシゾントの適切な成熟段階を示している。寄生虫が大きくなり、ほとんどの赤血球を埋める必要があります。ギムザ染色のまだら外観は卵片発生が開始されたことを示し、およびE64は膜で囲まれたメロゾイト（ 図1Aii）を得加えるべきである。 E64は、期寄生虫を栄養する前に追加された場合、膜囲まメロゾイトさえE64の12時間後に生成されていません。代わりに、寄生虫は、消化液胞（ 図1BIと1Bii）の拡大などの異常な形態を取ること、およびメロゾイトが形成されていない。 E64は、後にシゾントに追加された場合、膜に囲まれたメロゾイトはシゾントの破裂として生成されていない（ 図1CIと1Cii）使用禁止解除されます。寄生虫同期高いレベルが要求される、他の賢明記載された全ての3つの結果の範囲は、E64処理後に分かるであろう。 ヘモゾインの除去は、精製メロゾイトのためのもう一つの重要なステップです。メロゾイトはヘモゾインから精製されていない場合は、メロゾイト-ヘモゾインクラスタはピペッティングで外れできない形成している。これらの凝集体は、フローサイトメトリー（ 図2A）による不正確なメロゾイトカウントで、その結果、単一のメロゾイトは異なるフォワード散乱および側方散乱特性を持つとはいえ、一つのイベントとしてサイトメーター上で実行されます。 THP-1細胞はまた、ヘモゾインを貪食することができるように、これらのメロゾイト-ヘモゾインクラスターはまた、（ 図2B）を貪食することができる。彼らは複数のメロゾイトが含まれているように、これらの凝集体は、高度のEtBr蛍光性である。複数の個々のメロゾイトの食のために観察されたものと、THP-1のEtBr蛍光プロファイル換算で集計結果の貪食。ヘモゾインが除去されない場合は、したがって、THP-1細胞のEtBr蛍光はOであろうテストされているプラ​​ズマのためのオプソニン化ポテンシャルのverestimate。ヘモゾインも大幅に食細胞機能を変化させることが報告されている。 GFP陽性のメロゾイトは、カウンタTHP-1細胞による貪食メロゾイトの視覚化を高めるためにEtBrで染色する。このプロトコルに記載されている条件を使用して、すべてのGFP陽性メロゾイトは明るい蛍光強度（ 図3A）を有するEtBrで対比染色される。 EtBrを蛍光による食作用の評価は、GFP蛍光（ 図3B）よりもメロゾイト食作用の優れた分解能を可能にします。 アッセイに加えメロゾイトの数を観察し、食作用の量を調節します。このため、フローサイトメトリーによる正確なカウントが非常に重要です。メロゾイトの増加割合：THP-1は、血漿の非存在下でのTHP-1細胞（ 図4A）にメロゾイトの増加遵守になります。増加メロゾイト：THP-1の比率も増加してpHをもたらしメロゾイトが（ 図4B）オプソニンされたときの応答をagocytosis。 4時01メロゾイト：THP-1比率は、堅牢な食細胞の応答をお勧めします。この比、および示された血漿の希釈液を用いて、このアッセイは、抗体のオプソニン化、低、中および高レベルを解決することができる。 0〜78％の食作用の応答は、PNG血漿サンプルと記載された他の条件を用いて観察されている。このような応答は、最近、マラリア10に自然に獲得した臨床免疫に関連することが示されている。 図5は、PNG形式の個人からの貪食応答の4四分位数の例を示している。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> E64添加の図1。タイミング膜に囲まれたメロゾイトを生成するために重要である。 （A）適切なmaturatio。E64が未熟寄生虫に追加された場合、n個のI）の前にE64処理に寄生虫の段階と、ii）E64処置の6時間後に製造された膜で囲まれたメロゾイト（B）膜囲まメロゾイトは生成されません。 I）後期栄養型、およびE64は後半シゾントをセグメント化するために追加された場合II）E64の12時間後に（C）分裂破裂を阻害しない。 I）後期シゾントと、ii）E64の6時間後。スケールバーは10μmで表しています。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。ヘモゾイン除去がヘモゾインが磁気メロゾイトから分離されている場合を除きます。メロゾイト-ヘモゾインの凝集体は、膜囲まれたメロゾイトのろ過次の形式単細胞メロゾイトサスペンションを生成することが重要である。（A）メロゾイトの前方散乱及び側方散乱プロットでヘモゾイン削除そしてヘモゾインを保持していた（B）ヘモゾイン-メロゾイト凝集物がTHP-1細胞によって貪食することができる。 PNG血漿と共にインキュベートTHP-1細胞のディフクイック染色したインサイトスピンスライドをヘモゾインの有無にかかわらずメロゾイト調製物をオプソニン。スケールバーは10μmで表しています。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。ジウムブロマイド染色は、（A）GFP陽性メロゾイト上のゲーティングで精製されたメロゾイトのhistrogramフローサイトメトリー。D10-GFPを精製したメロゾイトは、蛍光強度を向上させるためにEtBrで対比されています。メロゾイト食作用の優れた分解能を可能にし、EtBrをを示すドットブロットこのゲート付きのGFP陽性集団内の蛍光（B）、GFPに対する前方散乱とGFPとのEtBrデュアル蛍光メロゾイトの貪食次のTHP-1細胞のEtBrを対前方散乱。ゲイツはDだった<html> rawnという形式メロゾイトなしプラズマ制御を用いたTHP-1細胞に基づく。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> 図4メロゾイト：THP-1比率は観察食作用の程度に影響を与えます。 （A）ファイブメロゾイト：THP-1比率が描かれている。 50:1 20:1 10:1、4:1、1:1である。細胞のみの対照は、THP-1細胞によるバックグラウンド蛍光を示す。各比率のためのTHP-1のEtBr蛍光は、（B）は、異なるメロゾイトのためのTHP-1細胞の平均蛍光強度のPNG血漿のプールに、または非免疫オーストラリアプラズマでオプソニンメロゾイトのために示されている：THP-1の比率、プールでオプソニンPNG形式の血漿または非免疫オーストラリアプラズマ（平均±SEM）の。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> ove_content「FO：キープtogether.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> 図5オプソニン抗体の大きな範囲を測定することができる。メロゾイトはPNG個体からの血漿でオプソニン化し、THP-1細胞と共にインキュベートした。 4つの代表的な食作用応答が示されている。ゲートはメロゾイトなしプラズマ制御を用いたTHP-1細胞に基づいて描かれた、と数字は非免疫プラズマ制御を用いたTHP-1細胞を差し引いた後％の食作用を示してた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays at JoVE.com

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

抗体機能を測定することは、 熱帯熱マラリア原虫マラリアに対する免疫を理解するうえで重要です。この方法は、生存可能なメロゾイトの精製を記載し、フローサイトメトリーによるオプソニン化依存性食作用を測定する。

高収率の精製<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</emオプソニン抗体アッセイにおける使用のための&gt;メロゾイト

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

high-yield-purification-plasmodium-falciparum-merozoites-for-use

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

22.7K ビュー.  Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. 抗体機能を測定することは、 熱帯熱マラリア原虫マラリアに対する免疫を理解するうえで重要です。この方法は、生存可能なメロゾイトの精製を記載し、フローサイトメトリーによるオプソニン化依存性食作用を測定する。 

ビデオ: High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

の選択熱帯熱マラリア原虫</em人間の脳内皮細胞へのCytoadhesion用>寄生虫

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

免疫・感染学

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

不定冠詞<em&gt;のin vitro</em研究する&gt;共同感染モデル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に&gt;-HIV-1の相互作用

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

の血小板媒介クランピングのためのシンプルなプロトコル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</emリソース悪い設定で、&gt;感染した赤血球

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

の分離<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</em磁気手段によって&gt;後期感染赤血球

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

試金を使用して SIAT1 MDCK 細胞のインフルエンザ a (h3n2) ウイルス中和によるひと血清中の抗体を中和することを測定

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

ヒトの膵島抗体の電気化学発光アッセイ

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

連鎖球菌変異体における高分子塊タンパク質の精製

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

ウイルスから離れた高収率細胞外小胞製剤の精製

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...