著者らは、我々のデータ解析のためのそれらのコンピューティング·クラスタの使用のために子供のマーシー病院や診療所で博士スティーブンKingsmoreと小児ゲノム医学センターに感謝したいと思い、イルミナのフィールドサービスチーム（エリザベス·ボワイエ、スコット·クッ​​ク、マーク·クック）と技術彼らの迅速な対応と次世代DNAシーケンシング楽器、HiScanSQ、およびデータ品質分析の実行に関する有用な提案のためのコンサルタントチーム。この作品は、子供のマーシー病院や診療所の健康グラントHL080042（SQY）とスタートアップ資金や寄付金の国立研究所、カンザスシティ、ミズーリ大学（SQYへ）によって部分的にサポートされていました。

<html>このプロトコルを概説するフローチャートを図1に表示されます。 1。トロンビン、RNA単離、RNAの品質評価と定量で細胞を処理する<ol><li> 5％のFBS、成長因子および抗生物質によるEGM-2培地で6ウェルプレートで90〜100％コンフルエントまで培養ヒト肺微小血管内皮細胞（HMVEC-LBL）（Lonza社、カタログ番号CC-3202）。 </li><li>飢餓·メディア（0％FBS）を30分トロンビンによる治療に先立って、メディアを変更してください。 </li><li> 0.05 U / mlのトロンビンを用いて細胞を治療したり、℃、5％CO 2、37℃で6時間のコントロールとして未処理のままにしておきます。 </li><li>メーカーの指示に従ってアンビオンミールヴァナキットを使用して処理した細胞および対照細胞から全RNAを単離する。 </li><li> Experionの自動電気泳動Station上の標準プロトコルに従ってExperionのStdSense真核生物RNAチップを搭載したRNAの品質を評価する（= &quot;_blank&quot;&gt; www.bio-rad.com）。 </li><li>標準分光光度法を用いてRNAを定量化する。 </li></ol> 2。ライブラリーの構築とシーケン<ol><li>出発原料として、サンプルあたり高品質のtotal RNA 1μgを使用します。 </li><li>ライブラリーを構築するために、イルミナ（プロトコル＃15008136 Rev. A翻訳版）からの標準的な手順に従ってください。このプロトコルでは、ポリ2ラウンドの（）を含むmRNAの選択は、rRNAの塩基配列決定を最小限に抑えるためにrRNAを除去するために行われている。 </li><li> Experionの自動電気泳動駅（上の標準プロトコルに従ってExperionのDNAを1Kチップを使用してライブラリの品質評価<a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.comを</a> ）。 </li><li>定量PCRを使用してライブラリを定量化：以前に標準曲線とライゲーションアダプターに特異的なプライマーとして、配列決定されたライブラリを使用してください。未知のライブラリ（ すなわち 1:100、1:500および1:1000）の希釈液の範囲を使用します。 qPCRにアコを実行SyberGreen MMプロトコルにrding、各ライブラリの元の原液濃度を計算します。 </li><li>クラスタフローセルへの準備が整うまで、-20℃で10 nMおよびストアにライブラリの株式を希釈します。 </li><li>ときに、クラスタフローセルをする準備ができて、水浴中CBOT試薬プレートを解凍します。 CBOTは、クラスタの生成プロセスを合理化するために使用されるイルミナ楽器です。 </li><li> CBOT楽器を洗う。 </li><li>ライブラリを変性：13μlの1×TEと6μlの10μMのライブラリを組み合わせると、チューブの側面に、1μlの1NのNaOHを（イルミナ社によって提供される）を追加します。渦は、スピンダウンし、室温で5分間インキュベートし、氷上で変性したライブラリを配置。 </li><li>ライブラリを希釈：12 PMの最終濃度996μlのHT1と4μlの変性ライブラリを組み合わせることにより予冷ハイブリダイゼーション緩衝液（HT1、イルミナによって提供される）で変性したライブラリを希釈します。氷上の変性および希薄化ライブラリを配置します。 </li><li> 、CBOTプレートの管のそれぞれの行を反転すべての試薬は融解していることを保証します。プレートをスピンダウンし、/パンク箔シールを取り外して、CBOTにロード。 </li><li>ストリップチューブに希釈し、変性したライブラリのアリコートを120μlは、1から8までのラベルが付いた。制御スパイクのように各試験管に1.2μlの希釈、変性PHIX制御ライブラリ（イルミナ）を追加します。ボルテックスし、チューブをスピンダウンして、正しい向きでCBOT（右にチューブ＃1）上にロードします。 </li><li> CBOTにフローセルとマニホールドをロードします。 </li><li>フローチェックを完了し、クラスタリングの実行を開始します。 </li><li>実行が完了したら、すべてのレーンを横切っ試薬送達を確認してください。異常をメモしておきます。どちら4℃で直ちにシーケン実行を開始またはチューブ中でフローセルを保存</li><li>シーケンシング合成による（SBS、イルミナ）の試薬を解凍します。 </li><li>切断ミックスに触れた後、他の試薬に触れないように確認しながら、試薬トレイ上の適切な箇所に試薬をロードします。 </li><li> NOを使用N-シークエンスフローセル（ つまり以前に配列決定した1）、プライム試薬ラインを2回押します。 </li><li> 70％エタノールとレンズペーパーに続いて70％エタノールとキムワイプとシーケンスフローセルを、徹底的に清掃してください。どんなスジ用フローセルを点検してください。必要に応じて再清掃してください。 </li><li>シーケンサーにフローセルをロードして、マニホールドとフローセルの間のシールがタイトであることを保証するためにチェックフローを実行します。 </li><li>シーケンスの実行を開始します。 </li><li>彼らは実行時 ​​に利用可能になると品質メトリクス（クラスタの密度を例えば 、フィルタを通過するクラスタ、Q30、強度）を評価する。 </li><li>ラン全体で強度を監視します。 </li><li> 101サイクルが完了すると、2番目の読み出し完了するターンアラウンド化学を実行します。ペアリングエンド試薬及び第2のリード定款バッファ（ICBは、SBSの試薬の成分、イルミナ）を解凍し、試薬をロードします。 </li><li>第2 回は、強度、Q30読ん評価、シーケン実行を継続ランの進行状況としてND他の品質メトリクス。 </li></ol> 3。データ解析<ol><li>ベースコール·ファイル（。BCL）ファイルに変換するCASAVAの最新バージョン（イルミナ、現在は1.8.2）を使用します。fastqファイルは、各サンプルのシングルfastqファイルの作成を確実にするために0にfastq-クラスタカウントを設定する。下流解析用fastqファイルを解凍します。 </li><li>超高スループット短い読み取りのアライナ（ボウタイ、0.12.7）6およびSAMtools（0.1を用いて哺乳動物サイズのゲノムを読み取ったRNA-seqを揃えトップハットの最新バージョン（1.4.1）5を使用してペアリング終了アライメントを実行します。 17）7。 SAMtoolsは、SAM形式で後処理アライメントを行なうための各種ユーティリティが実装されています。参照ヒトトランスクリプトームはiGenomes（からダウンロードすることができます<a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a> ）。トップハットを実行している、我々はFR-unstranded（デフォルト）などのライブラリ·タイプ·オプションを含む、すべてのデフォルトのパラメータ設定を使用していました。 </li><li>私達8ソフトウェアパッケージプログラムCuffDiff、カフスの部分（1.3.0）ING、人間の基準に基づいて、トランスクリプトーム、前者で差次的に発現する遺伝子の転写産物を選別するためのコントロール細胞にトロンビン処理した細胞を比較します。この比較は、既知の転写産物の発現差を検出します。表形式で結果を可視化するには、Microsoft Excelを使用します。カフス·プログラムを実行して、我々は、すべてのデフォルトパラメータの設定を使用しました。 FPKMとのそれらの遺伝子転写産物は&lt;0.05、P&gt; 0.05は除外されます。 </li><li>小説アイソフォームを検出するために、基準のトランスクリプトームなしでカフスを実行します。 Cuffcompareを使用して、リファレンスゲノムにサンプルトランスクリプト·ファイルを比較し、1分析用リファレンスゲノムと第二の分析のための基準ゲノムとして合成制御トランスクリプトファイルとして結合されたトロンビントランスクリプト·ファイルを使用してCuffdiffを備えた差動式をテストします。表形式で結果を可視化するには、Microsoft Excelを使用します。再び、thosの電子遺伝子転写FPKMと&lt;0.05およびp&gt; 0.05は除外されます。このステップの後、捜査官は、UCSCゲノムブラウザのホームページ（に新たに報告された成績証明書のリストをアップロードすることを選ぶことができ<a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a>手動検査によりその妥当性を確認するため）。 </li><li>工夫パスウェイ解析（IPAに発現差のある遺伝子のリストを提出<a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a>トロンビン処理によって影響を受ける遺伝子および経路の特徴づけのために）。このステップでは、捜査官は、カマーバンド（使用することを選ぶかもしれ<a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a>視覚化、管理を支援するために）、カフス、RNA-seqの出力を分析する作業を支援し、簡素化するように設計されているRパッケージを、とCuffdiff分析によって生成されたデータのすべてを統合します。 </li></ol> 4。定量的リアルタイムリポによるRNA-seqの結果の検証lymerase連鎖反応（QRT-PCR） <ol><li>制御およびトロンビ​​ン処理HMVEC-LBLセル、ステップ1.6から1.4に記載されたRNAの品質評価およびRNA定量からのtotal RNA抽出を行います。 </li><li>メーカーの指示（インビトロジェン社、18080から051）に続いてのSuperScript IIIファーストストランド合成システムRTのキットと、各サンプル1μgの全RNAから相補的DNAを生成します。 </li><li> CUGBP、Elav-likefamilymember1（CELF1、Hs00198069_m1）、Fanconianemia、complementationgroupD2（FANDCD2、Hs00276992_m1）、TNFreceptorの検出のためのTaqmanアッセイオンデマンドに設計されたオリゴヌクレオチドを​​用いて、Applied Biosystemsの第VIIa 7リアルタイムPCRシステムで定量RT-PCR解析を実行関連因子1（TRAF1、Hs01090170_m1）、およびβ-アクチン（ACTB、Hs99999903_m1）。各サンプルは、トータルRNAの5 ngに相当するテンプレートを持っていた。 DDCt法を用いて定量を測定し、β-アクチンに正規化する。各アッセイは複製され、少なくとも3生物を越えて行った。 </li></ol>

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin.">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li><li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+pathway+analysis:+current+approaches+and+outstanding+challenges.">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+RNA.">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data.">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li><li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq.">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

主な手順 RNAの取り扱い：RNaseがあっても、最も高品質のRNAを低下させます従ってケアはRNAを10の分離、貯蔵及び使用時に注意が必要です。手袋は常に人間の手で発見のRNaseの混入を防ぐために着用されています。手袋は、特に皮膚、ドアノブや他の共通の表面に触れた後、頻繁に変更する必要があります。ピペットのセットは、単に仕事をRNAに専念すべ?...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> 試薬や機器 </td><td width="85"> 会社 </td><td width="185"> カタログ番号 </td><td width="359"> 注釈 </td></tr><tr><td>ヒト肺微小血管内皮細胞</td><td>ロンザ</td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td>ロンザ、Bulletのキット</td><td>ロンザ</td><td> CC-3202 </td><td> EGM-2、FBS、成長因子や抗生物質が含まれています</td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>シグマ</td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td>アンビオンミールヴァナキット</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td>のRNaseザップ</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> ExperionのStdSens RNA </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNAの調製キット</td><td>イルミナ</td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> AMPureXPビーズ</td><td>ベックマン·コールター</td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td>スーパースクリプトII逆転写酵素</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> ExperionのDNAの1K </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td>のQuantiTect SyberGreen </td><td>キアゲン</td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PEのクラスタ生成キット</td><td>イルミナ</td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PHIXコントロールキット</td><td>イルミナ</td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200サイクルSBSキット</td><td>イルミナ</td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td>イルミナ</td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td>イルミナ</td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td>定量PCRマシン - Viia7 </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>モデル＃VIIA7 /機器＃10631261 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> Experionのシステム</td><td>バイオラッド</td><td> 7007001 </td><td>バイオアナライザは、代替システムである</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>バイオテック</td><td>エポックマイクロプレート分光光度計</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>遠心分離機 - ソーバルレジェンドXTR </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 75004521 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>マグネットスタンド</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェルサーモ</td><td>一般的なラボサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表3主な試薬のリストとEメジャーquipment。 *、ビデオでは、代わりにHiScanSQのHiSeq1000が実証された。 </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

mRNAレベルの測定を介して細胞内での遺伝子発現の特性は、細胞の転写機構を外部信号（ 例えば、薬物治療）、またはどのように細胞が健康な状態と病気の状態の間で異なることによりどのような影響を受けるかを決定するのに有用なツールです。次世代DNAシーケンシング技術の出現と連続洗練された、RNAシーケンシング（RNA-seq）は、転写物の全ての種をカタログ化するすべての発現している遺伝子の転写構造を決定するために、定量化するトランスクリプトーム解析のますます普及している方法となっている与えられた細胞、組織または生物1,2における転写産物の全体集合の変化の発現レベル。 RNA-seqは徐々にそれが完全なトランスクリプトームのプロファイリングの利点を持っているので、トランスクリプトーム解析のための好ましい方法として、DNAマイクロアレイを交換するデジタルdatum型（任意の転写物のコピー数）を提供すると、任意の既知のゲノムシーケンシャルに頼っていませんCE 3。 ここでは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞のトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqを適用するための完全かつ詳細なプロトコルを提示。このプロトコルは、と題する我々の最近発表された研究に基づいている我々は正常ヒト肺微小血管内皮細胞の最初の完全なトランスクリプトーム解析を行っている4 &quot;RNA-seqはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞における遺伝子およびそのアイソフォームの新規トランスクリプトームを明らかにする&quot; RNA-seqを使用してトロンビンで処理した。これは、炎症状態、癌、糖尿病、冠状動脈性心臓病の病因におけるトロンビン媒介内皮機能不全の分子機構についての洞察を得るためにさらなる実験のための前例のない資源をもたらし、これらの疾患に対する治療ターゲットの潜在的な新規のリードを提供しています。 このプロトコルの記述テキスト4つの部分に分かれています。最初の部分は、トロンビンおよびRNAの単離、品質分析と定量化したヒト肺微小血管内皮細胞の治療について説明しています。第二部では、ライブラリーの構築およびシーケンシングを説明しています。第三部は、データ分析を説明しています。 4番目の部分は、RT-PCR検証アッセイを記載する。いくつかの重要な手順の代表的な結果が表示されます。重要なステップでの成功を後押しするための有用なヒントや注意事項は、ディスカッション·セクションで提供されています。このプロトコルはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞を使用していますが、それは哺乳類と非哺乳類細胞の両方で、さまざまな刺激または阻害剤で処理した組織内のプロファイル·トランスクリプトームに一般化することができる、または健康状態の間の細胞または組織にトランスクリプトームを比較する疾病状態。

ステップ1：28S：18S比は伝統的にRNA分解の指標として用いられる。理想的には、28Sのピークは18歳のバンド（2の比）の約2倍の面積を持つ必要がありますが、この理想的な比率は、しばしば、実際には見られません。さらに、28S：分光光度法から得られた18S比はRNAの分解量を過小評価することができます。より正確に劣化、したがって、RNAサンプルの品質を定量化するために、Exper...

Watch this Scientific Journal Video about RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

このプロトコルは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞にトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqの、強力な次世代DNAシーケンシング技術を適用するための完全かつ詳細な手順を示します。このプロトコルは、異なる試薬又は病気の状態によって影響を受ける様々な細胞や組織に一般化できる。

RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

rna-seq-analysis-transcriptomes-thrombin-treated-control-human

Research

JoVE Journal

Biology

21.8K ビュー.  Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City. このプロトコルは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞にトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqの、強力な次世代DNAシーケンシング技術を適用するための完全かつ詳細な手順を示します。このプロトコルは、異なる試薬又は病気の状態によって影響を受ける様々な細胞や組織に一般化できる。

ビデオ: RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

ヒト臍帯静脈内皮細胞の単離（HUVEC）

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

生物学

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

免疫不全マウスにおける生体工学ヒト微小血管ネットワーク

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

エア·液界面での人間の鼻上皮細胞の培養

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

マウス抵抗動脈から毛細血管内皮の管の隔離

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

無傷の動脈の内皮層における一酸化窒素とスーパーオキシドのエン顔検出

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.