この作業は、部分的にJM - MにNIHの助成金K99EB009096 - 01A1によってサポートされていました。

1。準備<ol><li> EGM - 2培地（500mL）を行う <ul><li>内皮基礎培地395 mLの（EBM - 2）にウシ胎児血清100mLの（FBS）を追加します。 </li><li> 100倍グルタミン - ペニシリン - ストレプトマイシン溶液（GPS）5 mLを追加します。 </li><li>ヒドロコルチゾン（すなわち、VEGF、hFGF - B、R - IGF - 1、hEGF、ヘパリン、アスコルビン酸、およびGA - 1000）を除くすべてのEGM - 2 SingleQuotsのサプリメントを追加。 </li><li> 0.2 -μmの孔径の真空フィルタで滅菌フィルター。 </li></ul></li><li> MSCGMの培地（500 mL）を行う <ul><li>間葉系幹細胞基礎培地（MSCBM）440 mLに100倍GPSの5 mLを追加します。 </li><li> MSCGM SingleQuotsキットの全内容を追加します。 </li><li> EGM - 2 SingleQuotsサプリメントからhFGF - Bのアリコートを追加。 </li><li> 0.2 -μmの孔径の真空フィルタで滅菌フィルター。 </li></ul></li><li> DMEM培地（500 mL）を行う <ul><li> 1 ×高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）440 mLにウシ胎児血清を50 mLの（FBS）を追加します。 </li><li> 100倍GPSの5 mLを追加します。 </li><li>非必須アミノ酸溶液5mlを追加。 </li><li> 0.2 -μmの孔径の真空フィルタで滅菌フィルター。 </li></ul></li><li> コラーゲン/フィブロネクチンソリューションを行う（3.6 mLを、注射の同じ日に行われた） <ul><li>蒸留H 2 Oを150μLに10倍DMEM 0.4 mlを追加する</li><li> 1M HEPES（最終の25 mM）100μLを加える。 </li><li>慎重に、ウシコラーゲンの2.4mLの（5 mg / mLの株、3 mg / mLの最終的な）を追加し、氷上で軽く混ぜる。 </li><li> 1N NaOH溶液（約30μL）を添加することにより、中性のpHを調整する。 </li><li>中性pHを評価するために、フェノールレッドのインジケータを使用して、代わりに、pHを監視するためにpH試験紙を使用してください。 </li><li>ヒトフィブロネクチンの120μL（;最後の30μg/ mLの1 mg / mLのストック）を追加する</li><li> FBS 0.4mLの（最後の10％）を追加する</li><li>使用するまで氷上で解決策を保つ。 </li></ul></li><li> フィブリノーゲン溶液を加える（1 mLを、注射の同じ日に行われた） <ul><li> 0.9N塩化ナトリウム液（pH7.4）溶液（30 mg / mLの最終的な）を1 mLに粉末フィブリノーゲン30mgを追加します。 </li><li>使用前に、37フィブリノーゲン溶液℃で30分間インキュベートする。 </li><li>前のコラーゲン/フィブロネクチンゲルへの添加、ボルテックスすることなく、穏やかに混合する。 </li></ul></li><li> トロンビン溶液（200mL）を行う <ul><li> 0.9％のNaCl生理食塩水（50 U / mL）を200mlに粉トロンビンの1 KUを追加。 </li><li>使用するまで-20 ° Cで0.2μmの孔径のシリンジフィルターとストアとの滅菌フィルター。 </li><li>使用前に、10 U / mlの最終濃度0.9％のNaCl生理食塩水で希釈する。 </li></ul></li><li> 1％ゼラチン溶液（500 mL）を行う <ul><li>ダルベッコのリン酸塩の500mLに粉ゼラチン5gを追加するには、緩衝食塩水（PBS）。 </li><li> 121℃で30分間オートクレーブ。 </li><li> 0.2 -μmの孔径の真空フィルタで滅菌フィルター。 </li></ul></li><li> 1％ゼラチンコーティング液でコーティング 100 - mm組織培養プレート<ul><li>各100 mm組織培養プレートに1％ゼラチン溶液10 mLを追加。 </li><li> 37プレートをインキュベート° Cで60分間。 </li><li>使用前に、ゼラチン溶液を除去し、PBSで一回プレートを洗浄。 </li></ul></li></ol> 2。ヒト臍帯血由来内皮コロニー形成細胞（ECFCs）の文化このプロトコルは、ECFCの凍結バイアルは、この実験前に実験室で利用できると仮定しています。 ECFCは、以前は次の7を説明するように臍帯血または成人末梢血のどちらかの単核細胞分画から単離することができる。 <ol><li> ECFCsの融解1バイアル（通常は凍結培地1 mLの0.5 × 10 6細胞）は、液体窒素貯蔵タンクから採取し、直ちにDMEM培地10 mLを含む15 mLコニカルチューブにその内容を希釈する。 5分間1200rpmでスピン。上清を取り出し、冷めないようにEGM - 2培地10mLで細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>ゼラチンでコーティングされた100 - mm組織培養プレートに1つの1には％ECFC懸濁液10mlを追加。 37℃、5％CO 2の加湿インキュベーターでプレートを置きます。次の日、穏やかに結合していない細胞と培地を吸引除去し、新鮮なEGM - 2培地10mLで結合した細胞を養う。 </li><li> EGM - 2培地で毎年2〜3日プレートを養う。細胞がプレートがコンフルエント細胞の単層によって覆われるように拡張することができます。合流点に、次のように細胞を継代培養： </li><li>培地を吸引し、PBS 10 mLで細胞を洗浄。 </li><li> PBSを削除し、それぞれ100 mmプレートにトリプシン- EDTA溶液2 mlを加え。ゆっくりと均等にトリプシン- EDTA溶液を分散させるプレートを揺らし。 37 ° C、5％3〜5分のためのCO 2。静かに倒立顕微鏡下で懸濁液中の分離された細胞を確認するためにプレートをタップします。 </li><li>細胞が完全にデタッチすると、EGM - 2培地を8mLを追加し、セルのソリューショ収集15 mLコニカルチューブに組み込んで。 haemocytometerで細胞をカウントし、採取された細胞の総数を動作するように10μLを取る。 </li><li> EGM - 2培地を用いてプレート5000細胞/ cmの播種密度で1％ゼラチンコート組織培養プレート中の細胞2。インキュベーターでプレートを配置し、EGM - 2培地ですべての2〜3日、それらを養う。 </li></ol>その後の継代に対して、この手順を繰り返します。細胞集団が展開されるように通路の数を追跡します。 ECFCsは通路4から8の間で使用されます。 3。ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（MSC）の文化このプロトコルは、人間のMSCの凍結バイアルは、この実験前に実験室で利用できると仮定しています。 MSCは、骨髄から単離することができるとして、以前に11を説明する吸引。 <ol><li> MSCの融解1バイアル（1mLの凍結のメディアで、通常、0.50〜1 × 10 6細胞）は、液体窒素貯蔵タンクから採取し、直ちにDMEM培地10 mLを含む15 mLコニカルチューブにその内容を希釈する。 5分間1200rpmでスピン。上清を取り出し、冷めないようにMSCGMの培地10mlに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> oneコーティングされていない100 - mm組織培養プレートにMSCの懸濁液10mlを追加。 37℃、5％CO 2の加湿インキュベーターでプレートを置きます。次の日、穏やかに結合していない細胞と培地を吸引除去し、新鮮なMSCGMの培地の10mLで結合した細胞を養う。 </li><li> MSCGM培地ですべての2〜3日プレートを養う。細胞がプレートにコンフルエント細胞の単層の80％に達するように拡張することができます。 80％コンフルエントで、次のようにして細胞を継代培養： </li><li>培地を吸引し、PBS 10 mLで細胞を洗浄。 </li><li> PBSを削除し、それぞれ100 mmプレートにトリプシン- EDTA溶液2 mlを加え。ゆっくりと均等にトリプシン- EDTA溶液を分散させるプレートを揺らし。 37 ° C、5％3〜5分のCO2。静かに倒立顕微鏡下で懸濁液中の分離された細胞を確認するためにプレートをタップします。 </li><li>細胞が完全にデタッチすると、MSCGMの培地8 mLを加え、15 mLのコニカルチューブに細胞溶液を収集する。 haemocytometerで細胞をカウントし、採取された細胞の総数を動作するように10μLを取る。 </li><li>プレート10,000細胞/ cm 2と MSCGMの培地を用いての播種密度でコーティングされていない組織培養プレート中の細胞。インキュベーターでプレートを置き、MSCGM培地ですべての2〜3日、それらを養う。 </li></ol>その後の継代に対して、この手順を繰り返します。細胞集団が展開されるように通路の数を追跡します。 MSCは、通路4から8の間で使用されます。 4。コラーゲン/フィブロネクチン/フィブリノーゲン溶液中の細胞の再懸濁（0日） 実験に先立って、文化の中で十分なECFCsとMSCがあることを確認してください。0.8 × 10 6 ECFCsと1.2x10 6 MSCを各インプラントとマウスが必要とされる。 <ol><li>各培養プレートの培地を吸引し、PBS 10 mLで細胞を洗浄。 PBSを削除し、それぞれ100 mmプレートにトリプシン- EDTA溶液2 mlを加え。ゆっくりと均等にトリプシン- EDTA溶液を分散させるプレートを揺らし。 3〜5分間インキュベートする。静かに倒立顕微鏡下で懸濁液中の分離された細胞を確認するためにプレートをタップします。 </li><li>細胞が完全にデタッチすると、DMEM培地8mlを追加し、15 mLコニカルチューブに細胞溶液を収集する。 haemocytometerで細胞をカウントし、収穫ECFCsとMSCの合計数を動作するように10μLを取る。 </li><li>転送型4x10 6 ECFCs（5 × 0.8 × 10 6個の細胞）と、単一の50 - mLコニカルチューブに一緒に6 × 6のMPC（5 × 1.2x10 6個の細胞）。これは、5つの個々のインプラントやマウスに必要な細胞の総量です。 1200rpmで遠心し上清を取り除く。 </li><li>優しく、コラーゲン/フィブロネクチン溶液（3 mg / mLの最終フィブリノーゲン濃度）の0.9 mLにフィブリノーゲン溶液の100μLのを追加し、氷上で混合物を保持する。 </li><li>氷冷コラーゲン/フィブロネクチン/フィブリノーゲン溶液1 mLに細胞ペレットを再懸濁し、泡を避けるために非常に穏やかに細胞を混合。 1 mLの滅菌注射器に混合物をロードし、シリンジの先端にはキャップで26ゲージの針を配置。注射まで氷上でロードされた注射器を保管してください。 </li></ol> 5。免疫不全ヌードマウスへの注射（0日） 全ての動物実験は、6週齢無胸腺ヌード（NU / NU）マウスを用いて実施されます。 <ol><li>注入前に、イソフルラン提供するガス室にそれらを置くことによって、免疫不全マウスを麻酔。彼らは（検査によってそれらの心拍を監視）麻酔とつま先のピンチに反応しなくなるまで、マウスは約2分間イソフルランを吸入することができます。 </li><li>それぞれのマウスの場合は、皮下26ゲージの針を使用して、上部背側領域にトロンビン溶液50μL（10 U / mL）を注入する。 </li><li&gt;トロンビンを注入したのと同じ場所では、26ゲージ針を用いて細胞の混合物200μLを注入。コラーゲンはゲルを37℃で、フィブリノーゲンは、トロンビンの存在下でフィブリンゲルを形成することになるでしょう。その結果、インプラントは、小さな、しかしかなりを形成すべき皮膚の下にバンプ。 </li><li>注入後は、快適さと暖かさのためにガーゼの層の上にマウスを置き、彼らは歩けるようになるまでそれらを観察。それから後、最初の3日間は毎日マウスを観察。 </li></ol> 6。収穫（7日目） <ol><li>一週間注射後に、圧縮されたCO 2ガスを供給ガス室にそれらを置くことによって、マウスを安楽死させる。 </li><li>かつて安楽死させた、注射のエリア付近の皮膚を切開すると外科的ゲルプラグを取り外します。規模と取得したゲルプラグのデジタル写真をお勧めします。 </li><li>組織学的カセットと10％中性にそれらを深いに収穫されたゲルプラグを置くことは、室温で一晩緩衝ホルマリン。 </li><li>固定後、ニュートラルは蒸留H 2 Oと離れて緩衝ホルマリン10％を洗浄し、4℃組織カセットを配置° PBSでCまでの組織学的評価を。 </li></ol> 7。評価：組織学（H＆E）と免疫組織化学（hCD31） <ol><li>組織学的評価のために、インプラントは標準的な組織学的手順を用いてパラフィンと切片（7μmの厚さのセクション）に埋め込まれています。 </li><li>インプラントの中央部から採取したヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色した切片の評価によって微小血管密度を定量化する 。 H＆E染色のための標準プロトコルは、他の場所で見つけることができます。血管は赤血球を含む内腔構造として識別することができます。容器/ mm 2のように分析し、発現の分野からの赤血球で満たされた血管の平均数などのレポート微小血管密度。 </li><li>微小血管、取得されたインプラントのセクションの人間性を実証するために免疫組織学的にヒト特異的CD31（hCD31）標準の染色プロトコールを用いて抗体で染色されるべきである。 1:100希釈で、我々は、DakoCytomation（猫＃M0823。クローンJC70A）からモノクローナルマウス抗ヒトCD31抗体を使用することをお勧めします。この抗体のヒトの特異性は、並列7,11で染色したマウスの組織切片の多様性で得られた負の反応によって確認されています。注目すべきは、マウスの血管は、しばしば（特に国境付近）インプラントの内部に見られるが、マウスの血管は、この抗体で陽性染色されません。さらに、人間のMSCの存在は、CD90またはα-平滑筋アクチン（α- SMA）に対するヒト特異的抗体による免疫組織化学的染色によって検出することができます。人間のMSCは、両方とも新しく形成された血管の血管周辺部で発見し、interstitiallyインプラント11に配置されています。 </li></ol> 8。代表的な結果<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig1.jpg" /> 図1。 ECFCとMSCの文化の典型的な外観 。位相差顕微鏡写真は、文化のECFCsとMSCの典型的な外観を表示。内皮細胞の特徴的な敷石石の形態を表示する臍帯血由来ECFCsの（A）コンフルエントな単層。 （B）人間の骨の紡錘形の形態を表示し、MSCを骨髄由来。スケーラーのバー、200ええと。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig2.jpg" /> 図2。 7日目での植プラグの外観 。ヒト臍帯血由来の骨髄由来MSCのECFCsと骨はコラーゲン/フィブロネクチン/フィブリンゲルに埋め込まれ、テキストで説明されているようにヌードマウスに皮下移植した。 （A）7日後、マウスを安楽死された後、注入のエリア付近の皮膚を切開すると皮膚を反転させる細胞/ゲルプラグを公開。 （B）プラグインの外観は、外科的にマウスとホルマリン固定前から削除されます。インプラントの赤い色は血管新生の指標です。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig3.jpg" /> 図3。外植プラグの血管網の組織学的同定 。ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色した切片は、外植プラグの中央部から採取。 （A）周囲の宿主組織のコンテキスト（すなわち、脂肪組織や骨格筋）でインプラントを（黄色の破線で示す）が表示さ低倍率（10倍）顕微鏡写真。 （B）高倍率（40倍）プラグ内部の顕微鏡写真表示、複数の微小血管（黄色の矢印は、そのうちのいくつかを指す）、微小血管は赤血球を含む内腔構造として識別することができます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig4.jpg" /> 図4。人間の免疫組織化学的同定ルーメン。植プラグの中央部から採取した免疫組織化学的染色切片。 1:100希釈で、染色がDakoCytomation（猫＃M0823。クローンJC70A）;からモノクローナルマウス抗ヒトCD31（hCD31）抗体を用いて実施された細胞核をヘマトキシリン​​で対比染色した。宿主組織を周囲の文脈でインプラントを（黒の破線で線引き）を表示する（A）低倍率（10倍）顕微鏡写真。人間固有の、CD3​​1陽性の血管は、茶色（ペルオキシダーゼ染色）で染色されています。 （B）高倍率（40倍）顕微鏡写真は、プラグイン内で複数の人間の血管（黒い矢印がいくつかhCD31陽性ルーメンを指す）を表示します。

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利害の衝突は宣言されません。

これは、生体工学、人間の血管のネットワークの実験的なモデルです。このモデルの主な特徴は次のとおりである：1）微小血管が出生後の組織（すなわち、血液と骨髄）から単離されたヒト細胞から形成される、2）血管が成体動物に形成されている、3）微小血管は、事前から発生していない-既存の（ホスト）の船舶ではなく、それらが適切なゲルに懸濁された単一細胞から、 デノボ 、形成される。 マウス血管系への接続が赤血球で満たされた容器、このアッセイの読み出し機能の一つを達成するために必要とされているため、血管新生は、このアッセイにおいて重要な役割を担っている。さらに、ホストの骨髄細胞は初期の日後の移植でインプラントに動員される、と彼らは新たな血管床12を形成するために必要です。 この実験モデルは、in vivoでヒト血管網の出生後の形成を研究するために、汎用性の定量化、および比較的単純なモデル系を提供しています。さらに、このアッセイは、実行するために簡単であり、切開や手術を必要としません。モデルは、ヒト内皮および血管周囲細胞の異なるソースのvasculogenic可能性を研究するために使用することができる。モデルは、抗および/またはプロvasculogenic化合物のスクリーニングに使用することができる。最後に、モデルは人間の内皮から構成される血管網の形成と機能における特定の遺伝子の役割（複数可）を研究するために使用することができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>内皮基礎培地、EBM - 2 </td><td>ロンザ</td><td> CC - 3156 </td><td></td></tr><tr><td> EGM - 2 SingleQuotサプリメント</td><td>ロンザ</td><td> CC - 3162 </td><td></td></tr><tr><td>グルタミン - ペニシリン - ストレプトマイシン溶液、100倍GPS </td><td> Mediatech、（株） </td><td> 30から009 - CI </td><td></td></tr><tr><td>間葉系幹細胞増殖培地のBulletKit、MSCBM / MSCGM </td><td>ロンザ</td><td> PT - 3001 </td><td></td></tr><tr><td>高グルコースダルベッコ改変イーグル培地、1X DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸溶液を、100倍NEAA </td><td>インビトロジェン</td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td>高グルコースダルベッコ変法イーグル、粉末DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 12100-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES緩衝液</td><td>インビトロジェン</td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> CultrexウシコラーゲンI溶液</td><td> Trevigen </td><td> 3442-050-01 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrexヒトフィブロネクチン</td><td> Trevigen </td><td> 3420-001-01 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血漿からフィブリノゲン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F8630 - 1G </td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>フィッシャー</td><td> DF0143 - 17から9 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、PBSバッファ付き</td><td>インビトロジェン</td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン- EDTA溶液、1 × </td><td>インビトロジェン</td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td>吸入のための液体、イソフルラン</td><td> Buxterヘルスケア株式会社</td><td> NDC 10019-360-40 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血漿からのトロンビン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T4648 - 1,000個</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン溶液、ニュートラルはバッファ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td>モノクローナルマウス抗ヒトCD31抗体</td><td> DakoCytomation </td><td> M0823 </td><td>クローンJC70A </td></tr></tbody></table>

bioengineering human microvascular networks in immunodeficient mice

組織工学や組織再生のための細胞ベースの治療の未来は可能性が生体内で機能的な血管網を生成するために我々の能力に依存します。この点では、生体内で血管のネットワークを構築するための実験モデルの検索では、最も重要な1である。 in vivoでの生物工学の微小血管のネットワークの実現可能性は、最初のヒト組織由来の成熟内皮細胞（ECS）2-4を用いて示されたが、そのような自家内皮細胞広く臨床使用のための本問題は、彼らが十分な量で入手し、必要とすることが困難であるため、既存の血管か​​ら採取する。これらの制限は、ECの他の情報源の検索を扇動している。血液中の内皮コロニー形成細胞（ECFCs）の同定非侵襲的に取得する機会が提示さ5-7 ECは。我々と他の著者は、成人および臍帯血由来ECFCs は in vivo 7-11 で機能的な血管網を形成する能力を持っていることが示されている。重要なことは、これらの研究はまた、安定的かつ耐久性のある血管のネットワークを取得することが示されている、ECFCsは血管周囲の細胞と共移植を必要とする。我々はここで説明するアッセイは、この概念を示しています：我々は機能的な人間を形成するコラーゲン/フィブロネクチン/フィブリノーゲンゲル内の単一の細胞懸濁液として、骨髄由来の間葉系幹細胞（MSC）と組み合わせることができる方法のヒト臍帯血由来ECFCs表示免疫不全マウスに移植後7日以内に血管網。ホストの赤血球を含むヒトECFCライニング管腔の存在のみならず血管ネットワークの形成（ デノボ ）だけでなく、ホストの循環系との機能的吻合の発達を示すインプラントを通して見ることができます。遺伝子組み換えヒト血管ネットワークのこのマウスモデルは、理想的に人間の血管ネットワーク形成の細胞および分子メカニズムの研究のためにと設計された組織を血管が発達するための戦略の開発に適しています。

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Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

ここで、我々は、ヒト臍帯血由来内皮コロニー形成細胞（ECFCs）と皮下免疫不全マウスへのコラーゲン/フィブロネクチンゲルに埋め込まれている骨髄由来間葉系幹細胞（MSCs）を、、実現する方法論を説明します。このセル/ゲルの組み合わせは、マウスの血管系に接続する人間の血管ネットワークを生成します。

免疫不全マウスにおける生体工学ヒト微小血管ネットワーク

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

bioengineering-human-microvascular-networks-in-immunodeficient-mice

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K ビュー.  Harvard Medical School. ここで、我々は、ヒト臍帯血由来内皮コロニー形成細胞（ECFCs）と皮下免疫不全マウスへのコラーゲン/フィブロネクチンゲルに埋め込まれている骨髄由来間葉系幹細胞（MSCs）を、、実現する方法論を説明します。このセル/ゲルの組み合わせは、マウスの血管系に接続する人間の血管ネットワークを生成します。

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Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

診断ツールを開発するマイクロエレクト​​ロメカニカルシステム（MEMS）の使用

生物学

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + Tリンパ球キャプチャHIVのための使い捨てマイクロ流体チップを用いた

Title Cell Encapsulation by Droplets

滴タイトルセルのカプセル化

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

組織工学のための3Dハイドロゲルの細胞のカプセル化

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

マウスにおけるカハール（ICC）ネットワークの間質細胞の可視化

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are pluripotent, thus having the potential to differentiate into multiple lineages. Such properties make ESCs extremely attractive for cell based therapy and regenerative treatment applications 1. However for its full potential to be realized the cells have to be differentiated into mature and functional phenotypes, which is a daunting task. A promising approach in inducing cellular differentiation is to closely mimic the path of organogenesis in the in vitro setting. Pancreatic development is known to occur in specific stages 2, starting with endoderm, which can develop into several organs, including liver and pancreas. Endoderm induction can be achieved by modulation of the nodal pathway through addition of Activin A 3 in combination with several growth factors 4-7. Definitive endoderm cells then undergo pancreatic commitment by inhibition of sonic hedgehog inhibition, which can be achieved in vitro by addition of cyclopamine 8. Pancreatic maturation is mediated by several parallel events including inhibition of notch signaling; aggregation of pancreatic progenitors into 3-dimentional clusters; induction of vascularization; to name a few. By far the most successful in vitro maturation of ESC derived pancreatic progenitor cells have been achieved through inhibition of notch signaling by DAPT supplementation 9. Although successful, this results in low yield of the mature phenotype with reduced functionality. A less studied area is the effect of endothelial cell signaling in pancreatic maturation, which is increasingly being appreciated as an important contributing factor in in-vivo pancreatic islet maturation 10,11.
The current study explores such effect of endothelial cell signaling in maturation of human ESC derived pancreatic progenitor cells into insulin producing islet-like cells. We report a multi-stage directed differentiation protocol where the human ESCs are first induced towards endoderm by Activin A along with inhibition of PI3K pathway. Pancreatic specification of endoderm cells is achieved by inhibition of sonic hedgehog signaling by Cyclopamine along with retinoid induction by addition of Retinoic Acid. The final stage of maturation is induced by endothelial cell signaling achieved by a co-culture configuration. While several endothelial cells have been tested in the co-culture, herein we present our data with rat heart microvascular endothelial Cells (RHMVEC), primarily for the ease of analysis.

The current study describes a directed differentiation approach in inducing pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Of great significance is the finding that endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell derived pancreatic progenitors into insulin expressing cells.

監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in mammals. However, humans cannot oxidize cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid to cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid due to a primary exon deletion of the CMAH gene. To understand the effects and implications of the lack of CMAH activity in more detail, a Cmah knock-out model in mice is of keen interest in basic and applied research. The analysis method to determine the phenotype of this mouse model is herein described in detail, and is based on the detection of both N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in the liver and milk of wild-type and Cmah knock-out mice. Endogenous sialic acids are released and derivatized with o-phenylenediamine to generate fluorogenic derivatives, which can be subsequently analyzed by HPLC. The presented protocol can be also applied for the analysis of milk and tissue samples from various other origins, and may be of use to investigate the nutritional and health effects of N-glycolylneuraminic acid.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

We describe a HPLC-based method for the determination of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in mouse liver and milk.

野生型および肝臓の肝臓試料および牛乳試料中のシアル酸の定量<em&gt; CMAH</em&gt;ノックアウトマウス。

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...