Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

1。楽器の準備と作業溶液<ol><li>魚の水溶液を調製する。蒸留水50ml中の海塩「インスタントオーシャン」の2グラムを溶解することにより保存溶液を作る。 （最終濃度60μg/ mlの海の塩）魚の水を使用する準備ができて準備する1リットルの蒸留水に株式魚の水の1.5ミリリットルを追加します。使用法の前に魚の水を使用する準備ができてオートクレーブ。この溶液を、ゼブラフィッシュ胚培地として使用される。 </li><li>胚マウント用メチルセルロースを準備します。滅菌魚の水50ml中に1.5gのメチルセルロースを溶解する。撹拌プレート上の磁石を使用して、溶解を容易にする。粉末が完全に溶解し、数時間が必要な場合があります。小さなチューブに透明度と分量のためのソリューションをご確認ください。ヶ月間-20℃で保存し、使用時に一定分量を解凍する。使用する前に、5分間950×gでメチルセルロースを遠心分離する。一定分量の凍結融解は避けてください。 </li><li>トリカイン/エチル3 - アミノ安息香mを50mlの調製を水100mlにトリカイン200mgの溶解し、トリス-HCl、1M液（pH 9）を用いてpHを7.0に調整することによってエタンスルホン酸塩（原液）。以上30日間、4℃で、この株式を保管してください。注意：トリカインは有毒である。適切な取り扱いのガイドラインに従って使用してください。 </li><li>ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスを誘導する<ol><li>一般的な酸化的ストレス誘導のための酸化剤溶液を調製する：H 2 O 2ストック溶液（過酸化水素;の100mM）を加えることにより、酸化剤溶液50mlを加え、魚の水。 2 mMおよび100μMの間の最終濃度のH 2 O 2を使用してください。直前の使用前に、この溶液を調製する。酸化剤溶液は、全載ROS検出および単一細胞ROS検出方法の両方に適用することができる。このソリューションを保管しないでください。注意：H 2 O 2は危険であり、吸入したり、飲み込むと有害。可燃性物質と接触すると火災の原因になります。ヒュームフードの下で処理し、適切な私信を着用onal保護具。 </li><li>ミトコンドリア由来の酸化的ストレス誘導のための酸化剤溶液を調製：ジメチルスルホキシド（DMSO）2mlにロテノン3.9mgの酸化剤を溶解することによってストック溶液（5ミリモル）を作る。暗所で室温でこの溶液を保管してください。 <ol><li>溶液を用いることができるようにするまでに、魚の水10ミリリットルにロテノン原液を溶解。 5〜50μMの濃度でロテノンを使用してください。 100μMのより高い濃度でロテノンを使用しないでください。適切な濃度で、この酸化剤溶液は、全載ROS検出および単一細胞ROS検出方法の両方に適用することができる。注意：ロテノンは有毒、有害である。適切な注意書きに従って処理します。 </li></ol></li><li>ノックダウン遺伝子によって酸化ストレスを誘発：ゼブラフィッシュ胚におけるノックダウンnrf2a遺伝子発現モルホリノマイクロインジェクションによって以前にTimme-Laragy A. らによって報告され、2012年38。 </li><li> OXIDを誘導組織損傷後のストレスをative：以前ニートハンマーら 、2009年39に記載されているように72 HPFのゼブラフィッシュ胚のテールフィンで巻きマージンを生成します。 </li></ol></li><li>単一セルのROS検出方法のため、ROS検出溶液の5ミリリットルを準備します。 <ol><li>一般的なROS検出のためのソリューション：作業溶液（：2.5-10μM濃度範囲）を作製するために、HBSS（ハンクス平衡塩溶液）の汎用のROSに敏感な分子プローブを溶かす。このソリューションは、使用直前に準備する必要があります。 </li><li>ミトコンドリアによって誘導された特異的な検出のROSのためのソリューション：使用直前にDMSOを5 mMの原液を作ると、ミトコンドリアのROS感受性プローブ​​を溶かす。ワーキング溶液（：2.5-10μM濃度範囲）を調製するために、HBSS中のストック溶液に溶解する。 注：ROS検出ワーキングソリューションとそれぞれのストック溶液の光と酸素曝露を避ける。使用して光からチューブを守るアルミホイル。格納またはHBSSに溶解し再利用プローブしないでください。月の-20℃で保存溶液を保管してください。 注意：適切なガイドラインに従って、ヒュームフードの下で分子プローブ及びDMSOを処理します。 </li></ol></li><li>ホールマウント、ROSの検出方法のため、ROS検出溶液の5ミリリットルを準備作業溶液（：2.5-5μM濃度範囲）を作製するために、HBSS中（DMSOに安定化された）の一般的なROS感受性プローブ​​原液を溶解する。光や酸素暴露を避ける。光からチューブを保護します。使用前に、この溶液を調製する。このソリューションを保存したり、再使用しないでください。注意：適切なガイドラインに従って、ヒュームフードの下に分子プローブを処理します。 </li><li> PBS 1Xの15ミリリットルにウシ胎児血清10ミリリットルを追加することにより、停止溶液25ミリリットルを加えます。滅菌溶液を保管してください。 4℃で、このソリューションを保存するROS検出法 - このソリューションは、単一のセルに必要とされる。 </li><li> 28 AT＆ゼブラフィッシュ空気インキュベーターを設定＃176;で</li><li>単一セルのROS検出法、4℃で遠心分離器を設定します。 </li></ol> 2。成人魚の交配やゼブラフィッシュ胚の選択<ol><li>セットアップ大人のゼブラフィッシュのペアは、標準的なプロトコル40によると交差する。具体的な実験のニーズに応じた適切なトランスジェニック系統を選択します。 </li><li>卵を収集し、魚の水/胚培地で90-mmディッシュに入れます。胚が開発し、目的の発達段階に成長するまで、28℃で卵を保つ（ 例えば 、48 HPF、72 HPF、HPF：時間後に受精）。 </li><li>胚を開発するための画面が表示されます。すべての未受精卵または未発達の胚を除外します。 </li><li> 50ミリリットル魚の水にトリカインの1ミリリットル（ストック溶液）を添加することにより胚を麻酔。 </li><li>実体顕微鏡下でのTg蛍光胚を選択します。 </li></ol>酸化剤エージェントと胚の3。治療<ol><li> 48時間の間に少なくとも30の胚を使うPFと異なる条件ごとに72 HPF。トリカインを除去するために、新鮮な魚の水で2回、胚を洗浄します。 </li><li> 3皿に蛍光胚を分割します。これ以上の30以上の胚/皿を置く。 </li><li>洗浄溶液を除去し、対照溶液等の酸化剤溶液10ml又は魚10mlの水を加える。 </li><li> 28℃で1時間に10分間胚をインキュベートインキュベーション期間は、特定の組織において誘導される酸化的ストレスのレベルによって左右される。酸化ストレスの影響を受けた細胞が徐々に細胞死を受けるように短い期間は最高です。 </li><li> HBSSを含む新しい皿に胚を移し、回転させることによって胚を洗う。 28℃でのプレ暖かいHBSS </li></ol> 4。ホールマウントROS検出手法<ol><li>酸化剤処理後の胚を収集し、小さな管には10以上の胚を置く。可能な限りHBSSで洗浄します。アルミ箔を使用した光からチューブを保護します。 </li><li>のため、ROS検出溶液の1ミリリットルを追加各チューブ。 </li><li>光の露出を避けるために、28℃で15分間、暗所で胚を培養する。 </li><li>インキュベーション時間の間、全胚分析用のガラススライドを準備します。 「うつ病」スライドガラス上にメチルセルロースを300μlを入れ、ピペットチップでガラス面の上に敷い。メチルセルロースを放出しながら泡を避けてください。 </li><li>インキュベーション時間の終了時に、直ちにROS検出溶液を除去し、HBSS 2mlで二回洗浄する。チューブを数回転倒胚を洗浄します。ピペットまたはボルテックスしないでください。 </li><li>ガラスパスツールピペットに吸引胚まで。ピペットの開口部に近​​い、静かに位置胚をメチルセルロースにそれらを取り出す。細いナイロンラインと適切に胚を配向。 </li><li>治療の胚と対照胚の蛍光を比較してください。すべての胚が同じものを使用して画像化されるように、別の方法として、蛍光実体顕微鏡や共焦点顕微鏡のパラメータを修正イメージングの設定。 </li></ol> 5。単一細胞のROS-検出法<ol><li> 3.5：ステップから始める。各条件について、少なくとも35の胚を持っていることを確認します。 </li><li>新しい皿に胚を移す。可能な限り魚の水を除去する。氷冷PBS 1Xの10ミリリットルを加え、プロテアーゼ阻害剤カクテル400μlの。手動鉗子で胚をdechorionate、細かい針で卵黄袋を取り外します。注意：卵黄袋を削除すると、次のFACS分析のためにクリーンなサンプルを保証します。このステップは、FACS装置によれば回避することができる。 </li><li>転送デyolked 24穴マルチウェルプレートに胚（15胚/ウェル）は、すべての魚の水を除去する。 </li><li>各ウェル中のHBSS300μL、30μlのコラゲナーゼP、50μlのトリプシン-EDTAを追加します。 </li><li>優しく厳しいピペットチップ（1,000μL）を上下にピペッティングして胚を均質化する。 </li><li> 20分間28℃でインキュベートし、5分毎にピペッティングすることにより、サンプルを均質化する。 </li><li>組織DISRを確認してください複合顕微鏡でのホモジネートのアリコートを観察することによってuption。ピペッティングにより単一細胞懸濁液を容易にする。 30分以上のための胚をインキュベートしないでください。 </li><li>停止溶液200μlを添加して反応を停止させます。静かにピペッティングして混合します。 </li><li>タイトなボトムであらかじめ冷却チューブに細胞懸濁液を転送します。チューブを氷上に維持し、光の露出を避けてください。 </li><li> 4℃で250×gで5分間遠心</li><li>優しくピペッティングして氷冷HBSSで上相と再懸濁細胞を除去。 </li><li>細胞をカウントして、あなたのすべてのサンプル中の細胞の数が同じであることを確認してください。未満2×10 6個の細胞を使用しないでください。 </li><li> 4℃で250×gで5分間遠心細胞</li><li>上清を除去し、ROS感受性プローブ​​を含む氷で冷やしたHBSS 1mlでペレットを中断。 </li><li>暗闇の中で3分間室温で静置する。酸化ストレスのレベルに応じて、インキュベーション時間を変化させ、tに彼プローブの感度は。 </li><li> FACSチューブに細胞を移す。氷上でチューブを保持し、FACS分析の前に光の露出を避けてください。 </li><li>蛍光活性化セルソーター（FACS）を用いて細胞をソートする。 Tgが組織蛍光（ 例えば 、GFP）及びROSの検出（ 例えば 、特定のミトコンドリアのROSに敏感なプローブ、一般的なROS敏感なプローブ）のために使用される分子プローブの励起/発光スペクトルに応じて設定波長。 </li><li>各条件について、同じFACS設定を適用することによって、同じ実験セッション内のすべてのサンプルを測定します。異なる生物学的反復の平均値としての蛍光細胞の割合を計算します。各条件のための少なくとも2つの複製を分析する。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

重要なステップ本明細書に記載されるゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスを検出するための手順は、2つの異なる方法を含む。単一細胞ROS検出方法（ 図1）のより具体的な定量的測定を可能にしながら、ホールマウントROS検出方法は、主にROS検出のための定性的なアッセイである。どちらの方法も、ゼブラフィッシュ胚に、生体内のROS検出を評価す...

酸化ストレスは、特にアンバランス細胞のレドックス状態から生じる状態と定義される。日常の内側の細胞を発生する複雑な酸化還元反応は、細胞の酸化還元状態を決定する。酸化還元反応は、分子の還元および酸化を生産する生物学的分子の原子間の電子の移動で構成され、全ての化学反応（ すなわち酸化還元反応）で構成されています。これらの反応は極端な構造的な不安定性や近隣の生体分子と交換するアンバランスな電子の自然活性化を特徴としている電子的に活性種（ すなわち酸化促進種）によって触媒される。これらの不規則な反応は、DNA損傷、タンパク質カルボキシル化、および脂質酸化にもたらし、最終的に細胞死をもたらす1。酸化ストレスのレベルの増加は、加齢と異なる病態2の進行と関連している。酸化ストレスはあります糖尿病や心血管疾患3,4の血管の変化の原因であることが報告されて。それはまた、アルツハイマー病における神経変性に重要な役割を果たしており、パーキンソン病5。さらに、酸化ストレスは、癌の進行および転移性事象6,7を支配する重要な要因として実証されている。加えて、炎症および免疫応答を惹起し、さらに酸化ストレス8をサポートすることができる。 または窒素（RNS、反応性窒素種）、生きた細胞において、酸化促進種は、酸素（活性酸素種ROS）に由来する。 （OH）（O 2 - ）、過酸化水素（H 2 O 2）ROSは、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオンが挙げられる。主なRNSは亜酸化窒素（NO）である。二次反応種の一連のbetwee自発的相互作用によって生成することができるROS及びRNSまたはフリーの金属イオンが9 N。 H 2 O 2は、Fe 2 +、ヒドロキシルラジカルを生成すると反応しながら、 -例えば、スーパーオキシドアニオンはperoxynitrate（ONOO）を形成する亜酸化窒素と反応する。いくつかの生体分子と反応する能力のために、ROS及びRNSは、生理的な酸化還元状態10を維持するために危険な脅威と考えられている。酸化還元状態の細胞を維持するために抗酸化分子や酵素を解毒する一連のを完備しています。 11 -スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）は、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼおよびペルオキシレドキシンは、本質的にH 2 O 2、OH及びOONO含む酸化促進種からの細胞の保護を提供する抗酸化酵素-武器を構成する。また、ビタミンCおよびE、ポリフェノールおよびコエンザイムQ10（コエンザイムQ10）のような抗酸化分子がROSとその危険な脱をクエンチする非常に重要である12,13 rivatives。しかし、ROS及びRNSの過剰産生、または抗酸化系における機能不全は、酸化ストレス14に向かって細胞の酸化還元状態に移行する。 彼らの否定的な意味合いのほかに、ROSは、異なる起源の細胞では、様々な生理的役割を再生することができます。細胞は通常、宿主防御および創傷修復の15〜17などの通常の生物学的事象を仲介するシグナル伝達分子として、ROSを生成する。反応種は、通常、シグナル伝達因子、成長因子、およびカルシウムレベル18,19の細胞内変動に応答してそのようなNOX（NADPHオキシダーゼ）およびXO（キサンチンオキシダーゼ）のような細胞内酵素により細胞内で産生される。これは、ROSを差動例えばATM-キナーゼなどのp53または細胞成分、DNA損傷に応答し20のマスター調節因子として重要な核因子の活性を調節し得ることが報告されている。同様にROSは強く目を媒介することによって細胞内シグナル伝達に影響を与える電子酸化及びシグナル伝達21の重要な調節因子として確立されているタンパク質チロシンホスファターゼ（PTP）の不活性化。また、プロテオミクスベースの方法論は、RNSは、分子シグナリングの特定のタンパク質の修正および変更に責任があることを示している。 RNSは、S-nitrothiols（SNO）にそれらを変更し、このような炎症性疾患および自己免疫疾患などの病理学的状態22,23に付随する分子経路を誘発システインチオール基と反応する。 細胞培養実験は、部分的にのみインビボで作用する多数の因子を再現するので、動物モデル24,25レドックス研究を行うために非常に興味深い。これを達成するために、ゼブラフィッシュは、酸化ストレスのダイナミクス26を研究するために適切な脊椎動物動物モデルと考えられてきた。ゼブラフィッシュは、脊椎動物のDEV間、細胞および遺伝的事象を研究するいくつかの利点を付与する新たなモデル系であるelopmentと病気。胚の大きなクラスターが生成され、実験的なニーズのために毎週利用可能することができる。また、ゼブラフィッシュ胚の異常な光学的透明性だけでなく、その小さなサイズは、全生物27の単一細胞イメージングと動的トラッキングを可能にします。過去10年間では、ゼブラフィッシュ変異体の相当数は、癌や遺伝病28〜31のようなヒトの病的状態をモデル化するために生成されました。最も重要なことには、多数のトランスジェニック系統は、遺伝的および生物学的操作32の大規模な機会を可能にするように製造されている。例えば、トランスジェニック組織特異的なゼブラフィッシュ系統を定期的にin vivo研究のために利用される。これらの線は、インビボで単一細胞を同定する能力、ならびにそれらが含む解剖学的構造を提供する、選択されたプロモーターの制御下で蛍光タンパク質を発現する。 いくつかの毒物学的研究は、すでにTを使用していた彼は、創薬および酸化ストレス33-35のフィールドのための動物モデルとして、この脊椎動物の適合性を示唆し、酸化還元ホメオスタシスに対する化学物質のインビボ効果を評価するためにゼブラフィッシュ。いくつかの蛍光プローブは、ゼブラフィッシュの幼虫36,37における酸化ストレスを監視するために試験されているにもかかわらず、ゼブラフィッシュ組織および生体細胞内の酸化的ストレスのレベルを検出および測定するための確立されたアッセイは存在しない。ここでは、ゼブラフィッシュ胚の生細胞における酸化ストレスのin vivo定量化のための手順を記述している。イメージングツール、FACSソーティング、蛍光プローブおよび酸化促進条件が全てゼブラフィッシュ胚および組織中の酸化種の検出および定量のための単純な検定を生成するために組み合わされる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1261">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:285px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:528px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">516813</td>
			<td>DO NOT STORE DILUITIONS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture</td>
			<td style="width:147px;">INSTANT OCEAN</td>
			<td style="width:285px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Cgeneric ROS-sensitive probe:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CellROX Deep Red Reagent</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX&#160;</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">M36008</td>
			<td>dissolve one vial with 13&#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydroethidine</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">D23107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">R8875</td>
			<td>Prepare 5mM stock solution in DMSO.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine</td>
			<td style="width:147px;">EnzoLifeScience</td>
			<td>BML-EI395</td>
			<td>dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Propidium Iodide&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">7-aminoactinomycin D (7-AAD)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Nrf2a Morpholino</td>
			<td style="width:147px;">GeneTools</td>
			<td style="width:285px;">5&#39;-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3&#39;</td>
			<td>Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td>11213857001</td>
			<td>Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td>Dissolve one tablet in 1ml of water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">15400-054</td>
			<td>Prepare 1X working solution before usage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Compound microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereo microscope with fluorescent illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:285px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">camera&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">AxioCamMRm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">software for fluorescence image acquisition</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">ZEN 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td style="width:147px;">BD FACSCalibur</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:285px;">5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:147px;">BD</td>
			<td>342065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell Plate&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Sterilized, non treated Petri dishes 90mm</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:285px;">391-1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:285px;">Leica SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of oxidative stress in zebrafish embryos

活性酸素種（ROS）高レベルの酸化ストレス状態に向かって細胞の酸化還元状態の変化を引き起こすことがある。この状況は、分子（脂質、DNA、蛋白質）の酸化を引き起こし、細胞死に至る。酸化ストレスにも影響、糖尿病、網膜症、神経変性、および癌などのいくつかの病理学的状態の進行。これにより、単一細胞のレベルではなく、生物全体との関連においてのみならず、酸化ストレス状態を調査するためのツールを定義することが重要である。ここでは、そのような研究を行い、in vivoでの酸化ストレスを測定するためのプロトコルを提供するように、インビボ系において有用であるとゼブラフィッシュ胚を考える。 &quot;i）の酸化ストレスの定性的測定のための「全胚ROS検出法」およびii）A：蛍光ROSプローブ及びゼブラフィッシュトランスジェニック蛍光線を利用して、我々は、 生体内で酸化ストレスを測定するための2つの異なる方法を開発単一細胞ROS酸化ストレスの定量的測定のための検出方法 &quot;。ここで、我々は、酸化剤および生理学的または遺伝的方法によって、組織における酸化ストレスを増加させることによって、これらの手順の有効性を実証する。このプロトコルは、フォワード遺伝子スクリーニングのために適している、それはそのような神経疾患や癌などの酸化ストレスに関連する病状の動物モデルにおけるROSのアドレス因果関係を支援します。

ここに記載された方法を適用することによって、我々は簡単にゼブラフィッシュ胚組織における酸化ストレス（ROS及びレベル）を測定し、検出することができる。大人のゼブラフィッシュを横断した後、卵を回収し、72時間後に受精（HPF）に28℃で開発することが許可されています。強い酸化促進試薬との胚の1）の処置または2）組織損傷後のROS形成を促進する酸化的ストレスを誘導するため?...

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Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

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JoVE Journal

Biology

36.9K ビュー.  University of Torino. Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses. 

ビデオ: Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

生物学

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

活性化カスパーゼ3を検出するために、ホールマウント免疫蛍光法によりゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスの分析

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

半数ゼブラフィッシュ胚の生成により<em&gt;体外</em&gt;受精

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

の酸化ストレス抵抗を測定<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; 96ウェルのマイクロタイタープレート中

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

全身酸化ストレスの間接的な指標として、コメットアッセイ

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...