著者らは、有用入力に対してリサデイリーに感謝したいと思います。 この作品は、国立衛生研究所（ES013611とHL095163）からの補助金によって支えられて、フライトアテンダント医学研究所（FAMRI）、および環境保護庁（CR83346301）とは、利害の衝突を宣言していません。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。この資料に記載された研究は、ノースカロライナ州チャペルヒル大学の環境医学、喘息および肺生物学センターとの協力協定のCR83346301を通じて、米国環境保護庁（EPA）によって部分的に資金を供給してきたが、それが施されていない代理店の必要なピアおよび政策見直し、したがって必然的に機関の見解を反映するものではない、と公式承認は一切関係ありません。 O言及Fの商号または市販品を使用するために承認または推奨するものではありません。ロレッタ·ミュラーは、個人的な補助金とスイス国立科学財団によってサポートされています。

1。プラスチックの構造を準備します。コートプレート<ol><li> 12ウェルプレートの各ウェルに500μlのPureCol（滅菌水で希釈1:100）を添加する。 </li><li> 30分間インキュベーター内で37℃でインキュベート、PureColを削除し、細胞をプレートに添加する前にHBSS権で洗い流し（以下のステップ3.1を参照）。 </li></ol> 2。取得と人間NECのの前処理生検<ol><li>鼻掻き生検<ol><li>鏡（モデル21700）を持つオペレーティング·オトスコープに9ミリメートル、再利用可能なポリプロピレン製鼻鏡（モデル22009）を通して直視下鼻甲介の内側を覆う表面的なECのを入手します。このデバイスは、鼻甲介と運動の柔軟性の最適な可視化を提供します。 </li><li>わずかに後方に傾いたり診察台に仰臥位で横たわって頭をまっすぐにバックアップされた椅子に直立座っ対象で生検を行う。 </li><li>鼻孔と劣っturbiに耳鏡の鏡を挿入しますネイトは、照明で可視化した。 </li><li>鼻甲介の奥まで遠位延長先で鏡を通して無菌熱可塑キューレットを挿入します。 </li><li>鼻甲介の下面に穏やかな圧力を使用して、キューレットは、粘膜表面5X渡って描かれ後退する。毛細管現象によって保持粘膜細胞の正常な取得は、キューレットのカップには明らかであろう。 </li></ol></li><li>のRPMI 1640の8ミリリットル、氷上輸送を含む15ミリリットルコニカルチューブにサンプルを配置します。 </li><li> 、プローブを取得するために鉗子を使用して、P-1000ピペットでRhinoのプローブから組織を取り除く、プローブを破棄</li><li>遠心分離機、上清を吸引し（注意：ペレットを吸引しないように注意してください）​​を（4℃、400×gで、5分間）ペレット化する。 </li><li> 100X DNアーゼ1の10μlで1ミリリットルBEGMでペレットを再懸濁します。 </li><li>室温で20分間インキュベートする。 </li><li>遠心分離機（4℃、400×gで、5分）、上清を吸引しないでください！ </li></ol> 3。 Sプラスチック上EED細胞（0日目） <ol><li>プレートからPureColを削除し、HBSSで洗い流し（も1.2ステップ参照）。 </li><li> （メディアのメニスカスがウェルの中央に表示されるまで、80〜100μL）塗装板の（生検サイズに応じて）1-4ウェルにBEGM +メディアの最小容積を追加します。 </li><li>慎重にあまりにも多くのメディアを吸引することなく、チューブから生検組織のペレットを除去するために、P-1000ピペットを使用してください。 </li><li> 、井戸の中央にペレットを移し、細胞のクラスタとして一緒に生検を維持し、単一細胞懸濁液を作るために別れるません。播種することができる4つのウェルまでの良好な生検が得られます。組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2、&gt; 90％相対湿度）中にプレートを置く。 </li><li> （メニスカスを乱すことなく）十分なメディアがあることを保証するために、2時間後に確認してください。 </li><li> 1日目は、24時間後に播種：すべてのウェルのすべての非接着細胞を回収（ティルトプレートとP-1000のセルでメディアを集めて、C1.5ミリリットルの遠心管中のすべてのウェルollect）。 </li><li>遠心分離（4℃、400×gで、5分間）。 </li><li>細胞懸濁液を遠心分離しながら：0日目に播種した細胞にBEGM + +とBEGM +メディア混合物を250μlの約250μLを加える。 </li><li>繰り返し、非接着細胞用3.1から3.5を繰り返します。 </li><li>日2-5：毎日の細胞の変化媒体; BEGM +メディア段階的に（播種後2日目の量減らし、各ウェルに500μlのメディアを追加します。125μLBEGM +プラス375μLBEGM +、播種後3日目と次の日：73 μLBEGM +プラス427μLBEGM +）。 </li></ol> 4。フラスコ中の細胞を増殖<ol><li>日々のセルを監視、彼らは80〜90％の集密度に達すると（彼らは時間がかかる場合には、通常5〜7日の生検後、彼らが正常に成長しない）リフト細胞以下のとおりです。慎重に培地を吸引し、0.25％トリプシン500μlのを追加細胞が剥離するまで、ウェル毎に、（それは通常は2〜3分かかります）、37℃で保管してください。 </li><li>必要性を準備する15mlチューブ中の大豆トリプシンインヒビター（SBTI）（1ミリリットル当たりトリプシン750μL）のEDの音量。 </li><li>繰り返しピペッティングトリプシン溶液ダウンによって細胞を取り除く。SBTIで15ミリリットルコニカルチューブを剥離した細胞を移す。 </li><li>細胞とチューブにHBSSを追加、合計1ミリリットルHBSS中で全てのウェルを洗浄します。 </li><li> 、（4℃、400×gで、5分間）ペレットメディアを吸引し、1ミリリットルBEGM +メディアに再懸濁し、チューブを渦に遠心します。 </li><li>ペレットサイズに応じて、T25やT75フラスコ中の細胞を展開します（これはP1である。約2集密ウェルが1 T75フラスコに入り、1集密よく1、T25には十分ですが、通常は2融合性ウェルは1 T75）を得た。 <ol><li> （T75のための5ミリリットルごとに、T25のための3ミリリットルずつ）フラスコにBEGM +を追加します。 </li><li>フラスコに細胞懸濁液を追加します。組織培養インキュベーターにフラスコを転送します。 </li></ol></li><li> 24時間後にフラスコ播種：フラスコ（T75とT25に3ミリリットル、10ミリリットル）に追加BEGM +メディアを追加します。 </li><li><stroNG&gt;フラスコ中の細胞を維持する：（5 ml/T25、20 ml/T75）メディア（角から吸引）を取り外し、BEGM +メディアを追加します。メディアは、2〜3日ごとに変更する必要があります。彼らは約80％コンフルエントになるまでフラスコ中の細胞を維持する（集密度でも全体のフラスコを通してできない場合があり、通常、これは7〜10日間を要する。彼らは、彼らが正常に成長しない10日後にコンフルエントされていない場合）。 </li></ol> 5。組織培養インサート上で細胞を播種<ol><li>フラスコから培地を除去し、トリプシン（T25用3ミリリットル、T75フラスコのための4ミリリットル）を追加します。 </li><li>細胞が剥離するまで、37℃でインキュベートする（約2〜3分）。 </li><li> 15ミリリットルチューブにSBTI（T25用1ミリリットルのトリプシン&gt; 2.25ミリリットル、T75のための3ミリリットル当たり750μl）を準備します。 </li><li>ダウンフラスコをテーピングし、ピペッティングにより細胞を取り除くとSBTIとコニカルチューブに移す。 </li><li> 15mlチューブにHBSSを加え、HBSS（T25、T75のための2ミリリットルのための1ミリリットル）でフラスコを洗浄します。 </li><li>遠心分離機（4℃、400×gで、5分間）ペレットにし、上清を注意深く除去します。 </li><li>プレートを準備します。シードされたことを行っているか多くのプレートを決定し、サンプルコードや番号、継代数（ すなわち P2）と日付でプレートにラベルを付ける。基底室に700μLBEGM +メディアを追加します。 </li><li>チューブをボルテックスで1ミリリットルBEGM ALI培地で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> （T25は通常、約4万個の細胞を生産、T75は、島によっては最大20万個の細胞を持つことができます。1 12ウェルプレートのための細胞の1から2000000を使用してください）​​、血球計数器で細胞をカウントして細胞懸濁液を希釈（プレート当たり2.5ミリリットルのメディアに1.2×10 6細胞）を播種する必要があり、プレートの量のために必要な総容量BEGM ALIメディア（注：細胞の一部を凍結する場合は、チューブにラベルを付け、細胞を除去ここに：我々は通常、メディアの凍結の2ミリリットル中の2×10 6個の細胞を凍結する） </li><li>各コーティングされていないコーニング12well細胞の頂端側に200μlの細胞懸濁液を追加挿入（&gt;これは約80,000〜150,000個/挿入されます。0.4ミクロンの細孔のポリエステル（ポリエチレンテレフタレート（PET））メンブレンインサート付き12mmのトランスウェル）は、組織培養インキュベーターに移す。 </li><li> 24時間後、頂端メディア（200μlの増殖培地）を変更。 </li><li> 細胞培養の維持：（BEGM ALI媒体、700μlの基底外側および200μlの頂端）メディアを変更日おきに。インサートは、細胞が（単層に穴が見えない）、完全にコンフルエントになるまで水没維持されなければならない。それは、細胞が最も可能性の高い実行可能ではありません長い時間がかかる場合は、細胞数に依存し、これは通常、2〜6の間で日かかります。 </li></ol> 6。エア·液界面を確立する（トランスウェル上の細胞が完全にコンフルエントのとき）一度細胞が完全にコンフルエント<ol><li>細胞が完全にコンフルエントになったら48時間500nMのレチノイン酸を補給しBEGM ALIメディアの両方先端および基底外側のメディアを交換してください。 </li><li>レチノイン酸を添加した後の48時間はBEGM ALIメディアを補足：PneumaCult-ALI 維持培地（以下、メーカーの説明書）を準備します（基礎コンパートメントの通常8.5ミリリットル1版用）に必要な媒体の体積を計算し、1ミリリットルあたりの追加完全基礎培地をPneumaCult ： 10μLPneumaCult 100X保守サプリメント （2 mg / mlの保存溶液）2μlのヘパリン （96μL/ mlの保存溶液）5μLヒドロコルチゾン。 </li><li>すべてのメディアを削除し、基底外側のみ（頂端側の無培地）に700μlのPneumaCult-ALI保守メディアを追加。 </li><li> ALIで4週間の細胞培養を維持する。 <ol><li> （月曜日、水曜日と金曜日のスケジュールは私たちのためにうまく動作します）一日おきにメディアを変更。 </li><li> ALIの1週間後、一週間（水曜日）、一度先端表面を洗浄されています慎重に吸引し、培養器で10分のためにそれらを保つため、頂端側に200μlのHBSSを追加HBSSを（HBSSをオフに吸引するピペットの先端に200μLのヒントを使用して、生物学的安全キャビネット内の真空トラップに付着したガラスピペット内の9を使用します）。 </li></ol></li></ol>注意：変更板間のヒントだけでなく、側底対頂端面から行くときのヒントを変更する。 ALIで約2週間後、細胞は分化し始めると、繊毛が表示される。細胞培養は、ALIで約4週間後に完全な差別化を達成。

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著者らは、開示することは何もありません。

呼吸のECは、外因性の刺激20から人体を保護するだけでなく、可溶性メディエーターまたは直接受容体-リガンドの細胞-細胞相互作用の分泌を介して開始し、呼吸器、免疫防御応答を1-3に調節するための配電盤として作用する物理的障壁だけを提供する。さらに、免疫応答におけるECの役割を研究するための病気の集団からの電気部品間の電位差を調べるために、又は電気部品?...

技術の目的気道上皮細胞（EC）を直接このような病原体、アレルゲンまたは大気汚染物質などの吸入環境ストレスにさらされる最初の部位の一つである。 ECの構造的障壁を超えている：彼らは可溶性メディエーター4-6とそのsurfac 7-9上のリガンド/受容体の発現の解放を経由して、呼吸器、免疫応答1-3を開始し、制御する交換機として機能します。不死化細胞株は、インビトロでのEC呼吸を研究するためのモデルとして使用することができるが、それらはin vivoで観察されるものと同様の偏極繊毛および粘液産生細胞からなる不均一な細胞集団に分化することができない。 in vivoで観察気道上皮の重要な特性を再現するために、一次気道のECを使用することができる。そのため、私たちの目標は、鼻のEC（NECの）を利用し、本手法を最適化することであったヒトボランティアから得た。 NECのは、インビボで見られる鼻上皮の特徴の多くを模倣するNECの分化の細胞培養モデルを得、 インビトロで増殖培養する。 論理的根拠 生体内の状況に模倣ヒト初代のEC を用いたin vitroモデルの使用は、 -この研究で説明したように- 、病気ECの具体的な違いが、気道上皮に関連する生理的パラメータ、またはECおよび他の細胞型間の相互作用を研究するユニークな可能性を提供しますこのような樹状細胞10、ナチュラルキラー細胞11やマクロファージなど。いくつかの既存の方法はbronchoscopies中に、またはそうでなければ廃棄された肺組織から12-17ブラシ生検を介して、侵襲的に得ることができる気管支電気部品を利用する。また、完全に分化したヒト気道上皮細胞培養物を得るための商業的供給源はマテック、アッシュ、MA、Clonetics社から（EpiAirwayモデルが存在調査官は異なるドナーから選択することができますロンザ、バーゼル、スイス、Epithelix SARS、スイスのジュネーブからMucilAir）から。しかし、市販されている上皮細胞の限られたプール、パラメータの限定されたまたは所定の設定、市販の一次ヒト気道のEC、そして廃棄肺組織または新たに採取したヒト気管支生検組織への限定的なアクセスを取得することで、コストの多くの研究者を禁止する完全に分化したヒト気道のECでの研究を行うから。したがって、我々は1）非侵襲的に得られたヒトNECのを利用する技術を開発するために着手し、2）分化したヒト気道上皮の文化をもたらしプロトコルを提供し、3）既存の組織培養インフラのほとんどのラボ設定で、再現性がある。 既存の技術/モデルに比べて利点気管支や末梢気道のECに比べて、はるかに少ない侵襲的であるように、新鮮なNECの入手方法は、個々のS重大な副作用が複数回の生検することができ、表面的な鼻掻き生検は、そうでなければ、研究関連のbronchoscopiesの対象とならないだろう、罹患集団で行うことができる。 NECのを得るための非侵襲的な表面的な掻き生検は、研究者が達成される研究目的に合わせて年齢 、性別、疾患の状態を含め、 先験的ドナーの仕様を設定することができます。調査研究を設計する際にこのようにして、研究者は、商用ベンダー、またはデザイン侵襲的な気管支鏡検査の研究から、高価な分化した細胞培養モデルを購入し、臨床的に利用可能な組織/上皮試料によって限定されるものではない。また、NECの使いやすさを得るためには、観察された所見の統計的な妥当性を増強する異なるドナーからの細胞で実験を実施する能力を、増加させる。最後に、鼻に空気中のストレッサーの任意の種類に露出された最初のサイトの一つである。このように、 内器官を生成する鼻上皮を模倣するインビトロ培養系は、容易にこの細胞培養系を使用することによって達成することができるウイルス粒子、汚染物質、アレルゲン、又はガスの吸入を研究するために有用である。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nasal speculum</td>
 <td>Welch Allyn</td>
 <td>Model 22009</td>
 <td>9 mm, reusable polyproylene</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating otoscope</td>
 <td>Welch Allyn</td>
 <td>Model 21700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rhino probe cell cuvette</td>
 <td>Arlington Scientific</td>
 <td>SY-96-092</td>
 <td>bend the head of the cuvette a little more</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-well culture plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3512</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transwell membrane cell culture inserts</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3460</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture flask </td>
 <td>Corning</td>
 <td>430639 and 430641</td>
 <td>T25 and T75 vented flask</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 media (with L-Glutamine)</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11875</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium</td>
 <td>Cell applications</td>
 <td>511-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-3170</td>
 <td>This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25080</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NuSerum</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>355104</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAMBANKER freezing media</td>
 <td>BAMBANKER</td>
 <td>302-14681</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoolCell </td>
 <td>Biocision</td>
 <td>HTBCS-136</td>
 <td>(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureCol</td>
 <td>AdvancedBioMatrix</td>
 <td>5005-B</td>
 <td>dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 &mu;l/well of a 12-well plate</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS with Ca2 and Mg2+</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse 1</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>DN25</td>
 <td>Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 &mu;l to each ml of media</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25200-056</td>
 <td>Use at it is</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T6522</td>
 <td>Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retinoic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R7632</td>
 <td>Make it up 100 &mu;M stock solution (see below), dilute to 10 &mu;M with absolute alcohol, take 5 &mu;l of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). 
 
 All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its' dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 &deg;C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media.
 Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11995</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Pituitary Extract</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>13028-014</td>
 <td>Used for BEGM ALI media.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nystatin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N4014-50 mg</td>
 <td>Make up a solution of 3.3 mg/ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1600-100</td>
 <td>Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PneumaCult-ALI media</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>5001</td>
 <td>This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrocortisone </td>
 <td>StemCell</td>
 <td>7904</td>
 <td>Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>7980</td>
 <td>Use at it is. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter flasks (500 ml)</td>
 <td>Corning</td>
 <td>431097</td>
 <td>0.22 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter tubes (50 ml)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>SCGP00525</td>
 <td>Steriflip, 0.22 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipette tips - ART Barrier Tips</td>
 <td>Molecular Bioproducts</td>
 <td>2139RI, 2069RI, 2179RI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ddH2O, absolute ethanol, ice</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 incubator</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>refrigerated centrifuge</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>biological safety cabinet</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>gloves</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>lab coat with tight cuffs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Media and solutions used:</td>
 <td>Recipe</td>
 <td>Used for</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">General remark: always warm the media to room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="2">BEGM media</td>
 <td><ul><li> 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid</li></ul> </td>
 <td>(mix them half-half and filter )</td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements </li></ul></td>
 <td><ul><li> digestion of the biopsy</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">BEGM+ media</td>
 <td><ul><li> 50 ml BEGM media </li></ul></td>
 <td><ul><li> maintaining cells on plastic in the plates (passage0) </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l retinoic acid (working solution)</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding cells in the flask (passage1; partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td><ul><li> maintain the cells in the flask </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">BEGM++ media</td>
 <td><ul><li> 50 ml Lonza's BEGM media with supplements</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding fresh cells in 12-well plate on plastic</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 1 ml Sodium BiCarb</li></ul> </td>
 <td><ul><li> maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2.5 ml NuSerum</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding cells in the flask (passage1; partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="5">BEGM ALI media</td>
 <td><ul><li> 250 ml DMEM-H </li></ul></td>
 <td rowspan="5"><ul><li> Maintaining cells on the transwell before they go ALI</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 250 ml BEGM including supplements</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 75 &mu;l BSA (10 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="5">200X Hydrocortisone Stock Solution (96 &mu;l/ml solution)</td>
 <td><ul><li> 200 &mu;l dissolved hydrocortisone</li></ul> </td>
 <td rowspan="5"><ul><li> As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 4250 &mu;l dissolved sodium chloride </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 540 &mu;l ddH2O</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l absolute ethanol</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter solution through 0.22 &mu;m filter, aliquot solution and store at -20 &deg;C, avoid additional freeze/thaw cycles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">PneumaCult-ALI Complete Base Media</td>
 <td><ul><li> 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium</li></ul> </td>
 <td><ul><li> Base medium for all three PneumaCult-ALI media </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 50 ml PneumaCult 10x Supplement </li></ul></td>
 <td><ul><li> The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(this is stable for 2 weeks at 2-8 &deg;C or for up to 6 months at -20 &deg;C)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="4">PneumaCult-ALI Maintenance Medium</td>
 <td>Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add:</td>
 <td rowspan="4">ALI culture on inserts</td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l PneumaCult 100x Maintenance Supplement </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2 &mu;l Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 5 &mu;l Hydrocortisone (of a 96 &mu;l/ml stock solution) </li></ul></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface

in vitroモデルヒト初代上皮細胞を用いて、微生物感染または吸入薬のコンテキストで気道上皮の主要な機能を理解する上で不可欠です。病気の集団から得られた細胞の直接比較は、私たちは異なる表現型を特徴づけるし、上皮細胞の機能の変化を仲介する根本的なメカニズムを分析することができます。ヒト気管気管支領域からの上皮細胞を培養することは、十分に文書化されているが、気管支ブラシ生検の取得と関連するヒト肺組織または侵襲性の利用可能性によって制限される。鼻上皮細胞ははるかに低侵襲性表在性鼻擦り生検を介して得られ、被験者は、有意な副作用を複数回生検することができる。さらに、鼻呼吸器系へのエントリポイントであり、したがってそのような抗菌剤として空気中のストレッサーの任意の種類に露出される最初の部位、のいずれか、汚染物質、またはアレルゲン。 簡潔には、ヒトボランティアから得た鼻上皮細胞は、コーティングされた組織培養プレート上に展開し、次に細胞培養インサート上に転写される。コンフルエンシーに達すると、細胞は、より生理学的に関連する条件を作り出す数週間、例えば、気液界面（ALI）で培養され続ける。 ALI培養条件は繊毛と細胞を産生する粘液の両方で、人間の鼻上皮と同様の形態学的および機能的な特徴を示す差別化上皮につながる定義されたメディアを使用しています。分化した鼻上皮細胞と組織培養インサートは研究課題（薬理学的薬剤による治療、レンチウイルスベクター、ガスへの曝露、又は微生物剤の感染による形質導入）に応じて様々な方法で操作さに至るまで、多数の異なるエンドポイントのために分析することができる細胞および分子経路、機能的CHアンジェス、形態など 分化したヒトの鼻上皮細胞の試験管内モデルでは 、主に、生体内で鼻上皮を模倣器官実験モデルを使用して新規で重要な研究課題に対処するために研究者を可能にします。

NECのは、ここで説明するプロトコルは、生体内の状況（ 図1）を表す繊毛と非繊毛細胞から構成されるECの異質層に再差別次培養した。差別化NECののいくつかは、（AB / PAS、 図1Bを用いた青色に染色細胞）を産生する粘液である。ここで紹介するプロトコルが最適化されるにもかかわらず、全体的な分化は、細胞集団（：粘液産生細胞：繊毛細胞、すなわち<...

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Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

ヒトボランティアの表面掻き取り、生検により得られた鼻上皮細胞は、組織培養インサートに展開され、転送される。コンフルエントに達したら、細胞は、繊毛および非繊毛細胞の培養物を得、空気液体界面で成長させる。差別化された鼻の上皮細胞培養物は、呼吸器粘膜を研究するための実行可能な実験モデルを提供する。

エア·液界面での人間の鼻上皮細胞の培養

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

culturing-of-human-nasal-epithelial-cells-at-the-air-liquid-interface

Research

JoVE Journal

Biology

36.7K ビュー.  The University of North Carolina at Chapel Hill. ヒトボランティアの表面掻き取り、生検により得られた鼻上皮細胞は、組織培養インサートに展開され、転送される。コンフルエントに達したら、細胞は、繊毛および非繊毛細胞の培養物を得、空気液体界面で成長させる。差別化された鼻の上皮細胞培養物は、呼吸器粘膜を研究するための実行可能な実験モデルを提供する。 

ビデオ: Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

イモリのレンズ再生を研究するために培養虹彩色素上皮細胞のためのシステム

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

生物学

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

比色金ナノ粒子アッセイに適用される構造スイッチングアプタマーを選択するための方法

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

インフィールドアプリケーションの設計およびアプタマー金ナノ粒子基づく比色アッセイの開発

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid acquisition require assessing mouthpart structure and function relationships; however, fluid uptake mechanisms are historically inferred from observations of structural architecture, sometimes unaccompanied with experimental evidence. Here, we report a novel method for assessing fluid-uptake abilities with butterflies (Lepidoptera) and flies (Diptera) using small amounts of liquids. Insects are fed with a 20% sucrose solution mixed with fluorescent, magnetic nanoparticles from filter papers of specific pore sizes. The crop (internal structure used for storing fluids) is removed from the insect and placed on a confocal microscope. A magnet is waved by the crop to determine the presence of nanoparticles, which indicate if the insects are able to ingest fluids. This methodology is used to reveal a widespread feeding mechanism (capillary action and liquid bridge formation) that is potentially shared among Lepidoptera and Diptera when feeding from porous surfaces. In addition, this method can be used for studies of feeding mechanisms among a variety of fluid-feeding insects, including those important in disease transmission and biomimetics, and potentially other studies that involve nano- or micro-sized conduits where liquid transport requires verification.

Fluid-feeding insects have the ability to acquire minute quantities of liquids from porous surfaces. This protocol describes a method to directly determine the ability for insects to ingest liquids from porous surfaces using feeding solutions with fluorescent, magnetic nanoparticles.

蛍光灯、摂取昆虫における流体吸収能力を決定するための磁気ナノ粒子

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful in cases of attenuated, oligo- or mono-symptomatic forms of CF usually diagnosed later in life, and of CF-related disorders such as congenital bilateral absence of vas deferens, idiopathic chronic pancreatitis, allergic bronchopulmonary aspergillosis, and bronchiectasis. In both clinical and preclinical settings, the test has been used as a biomarker to quantify responses to targeted therapeutic strategies for CF. Adapting the test to a mouse is challenging and can entail an associated mortality. This paper describes the adequate depth of anesthesia required to maintain a nasal catheter in situ for continuous perfusion. It lists measures to avoid broncho-aspiration of solutions perfused in the nose. It also describes the animal care at the end of the test, including administration of a combination of antidotes of the anesthetic drugs, leading to rapidly reversing the anesthesia with full recovery of the animals. Representative data obtained from a CF and a wild-type mouse show that the test discriminates between CF and non-CF. Altogether, the protocol described here allows reliable measurements of the functional status of trans-epithelial chloride and sodium transporters in spontaneously breathing mice, as well as multiple tests in the same animal while reducing test-related mortality.

Here, we present a protocol to measure nasal potential difference in mice. The test quantifies the function of transmembrane ion transporters such as the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the epithelial sodium channel. It is valuable to evaluate the efficacy of novel therapies for cystic fibrosis.

マウスにおける上皮細胞のイオン輸送を定量化する鼻の潜在的な違い

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic exposure conditions. This puts specific demands on the cell culture models. Many cell types are negatively affected by exposure to air (e.g., drying out) and only remain viable for a few days. This limits the exposure conditions that can be used in these models: usually relatively high concentrations are applied as a cloud (i.e., droplets containing particles, which settle down rapidly) within a short period of time. Such experimental conditions do not reflect realistic long-term exposure to low concentrations of particles. To overcome these limitations the use of a human bronchial epithelial cell line, Calu-3 was investigated. These cells can be cultured at ALI conditions for several weeks while retaining a healthy morphology and a stable monolayer with tight junctions. In addition, this bronchial model is suitable for testing the effects of repeated exposures to low, realistic concentrations of airborne particles using an ALI exposure system. This system uses a continuous airflow in contrast to other ALI exposure systems that use a single nebulization producing a cloud. Therefore, the continuous flow system is suitable for repeated and prolonged exposure to airborne particles while continuously monitoring the particle characteristics, exposure concentration, and delivered dose. Taken together, this bronchial model, in combination with the continuous flow exposure system, is able to mimic realistic, repeated inhalation exposure conditions that can be used for toxicity testing.

Described is the cell culture and exposure method of an in vitro bronchial model for realistic, repeated inhalation exposure to particles for toxicity testing.

毒性試験のための空気中の粒子への現実的な反復吸入暴露のための気管支上皮モデル

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was performed on the day of DF harvest. The DF was washed three times with DPBS and then dissected with tissue scissors until the tissue had a pulpy or squishy consistency. Single-cell populations were pelleted by centrifugation and washed with keratinocyte serum-free medium. Heterogeneous cell populations were distributed in a culture dish. Keratinocyte serum-free medium was used to select the epithelial cells. The culture medium was changed daily until no floating debris or dead cells were observed. Epithelial cells appeared within 7-10 days after cell population distribution. Epithelial cells survived in serum-free medium, while &#945;-modification minimal essential medium supplemented with 10% fetal bovine serum allowed the proliferation of mesenchymal-type cells. The DF is a tissue source for the isolation of dental epithelial cells.
The purpose of this study was to establish a method for the isolation of epithelial cells from human DF. Periodontal ligament (PDL) was used for the isolation of human dental epithelial cells. Procuring epithelial cells from human PDL is not always successful due to the small tissue volume, leading to low numbers of epithelial cells. DF has a larger volume than PDL and contains more cells. DF can be a tissue source for the primary culture of human dental epithelial cells. This protocol is easier and more efficient than the isolation method using PDL. Procuring human dental epithelial cells may facilitate further studies of dental epithelial-mesenchymal interactions.

The dental follicle contains an epithelial population and mesenchymal cells. The epithelial population was selected from the heterogeneous dental follicle cell population by providing a distinct culture medium. Epithelial cells survived and formed colonies in a serum-free medium.

ヒト歯包からの上皮細胞の分離

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...