この作品は、ドイツとイスラエルのプロジェクト協力（DIP）の枠組みの中で、ドイツ学術振興協会（DFG）によるイスラエル科学財団（グラント11分の399）によって、との研究のためのラパポートファミリー研究所（部分的に）サポートされていました医科学。

1。誘導性細胞株の作製<ol><li>実験1の前に、目的の細胞株の調製のために使用されるすべての細胞を死滅させる薬剤G418の最小濃度を見つける必要があります。この目的のために、プレートの実験中に使用し、G418の濃度を増加させ（ml当たり0〜1,000μg）を追加する培地中でコンフルエント70％でいくつか重複してプレートで選択したセル。効率的に細胞を死滅させる最小限のG418濃度を決定するために、毎日細胞を監視します。細胞死は3-7日以内に観察される。 </li><li>それはshRNAを発現するプラスミドは研究対象の遺伝子のある程度式に減らすことができることを一過性トランスフェクションアッセイによって確認することが推奨された細胞株の世代の前に。これは、効率的にトランスフェクトすることができる任意のセルラインで行うことができる。 </li><li>プレート10パーセントテトSYを含むDMEM培地（8mlに10cmプレートあたり約5×10 6細胞の密度でT-REX-293細胞ステムが承認したFBS、2mM L-グルタミン、mlペニシリンおよびストレプトマイシンあたり0.1mg、ミリリットルブラストあたり5μg当たり100単位）。 37℃で一晩プレート℃、5％CO 2でインキュベートする 。 </li><li>翌日、トランスフェクションの前に8ミリリットル新鮮な培地に変更します。 </li><li>テトラサイクリン誘導性H1プロモーター、ならびにGFPと融合および構成PGKプロモーターによって駆動されるネオマイシン耐性遺伝子によって駆動pSuperior.neo + GFPプラスミド（ 図1）エンコーディングAcf1またはSNF2h shRNAの10μgを用いて細胞をトランスフェクトする。 150mMのNaClを500μlにDNAを追加。 μgのDNAあたり2μlの時150mM NaClを500μlの別のアリコートにjetPIE試薬を追加します。 DNAにjetPIE溶液を加え、ボルテックスでよく混和する。室温で15分間インキュベートする。穏やかに70から80パーセントコンフルエントの細胞を含む10cmプレート上にDNA複合体をピペット。インキュベーターにプレートを返す。 </li><li>翌日は、選択培地（DMEM培地などでメディアを交換）mlのG418あたりの追加500μgを含有する上記。 </li><li>コロニーが現れると顕微鏡なしに可視化することができるようになるまで3〜4日ごとに次の2週間のために細胞を監視して、似たような新鮮な培地と選択培地を交換してください。 </li><li>コロニーの単離の前に、選択培地を用いて、24ウェルプレートを準備します。 </li><li>目でコロニーを識別し、着色されたマーカーを用いて、プレートの下部にその位置をマークします。コロニーがよく分離されていることを顕微​​鏡で確認します。 </li><li>無菌フードでは、優しく温かいPBSで洗い、よく、すべての残りの液体を吸引し、プレートから培地を吸引除去する。プレート上の1つのコロニーを0.25％トリプシン/ EDTAを3μlを追加します。細胞が剥離し、24ウェルプレート中のウェルの1つに追加するまで繰り返してトリプシンをピペット。皿の上に他のいくつかのコロニーのためにこれを繰り返します。 </li><li>彼らは十分に埋めるまで、37℃、5％CO 2で細胞を成長させる。その後に由来する細胞を分割3つのウェルに、元植民地、独立した12ウェルプレートの各それぞれ、一晩インキュベートする。 </li><li>翌日、ダブル蒸留水（ml当たり1から5ミリグラム）で調製した原液からドキシサイクリンミリリットル当たり1μgを含む培地で1プレートに培地を交換してください。ドキシサイクリンを含まない培地でコントロールプレート内の培地を交換してください。 37℃で72時間細胞をインキュベート℃、5％CO 2で 。 </li><li> Acf1またはSNF2hノックダウンの効率を決定するために処理したものとタンパク質抽出およびウエスタンブロット分析の準備のため、各細胞クローンの井戸未処理1から細胞を回収する。ローディングコントロールとして機能するだけでなく、α-チューブリンに対する抗体としてAcf1またはSNF2hに対する抗体を使用してください。よく第三中の細胞を使用し、ドキシサイクリンの添加は、研究対象のタンパク質のレベルで少なくとも50％の削減につながっている選択された細胞クローンの拡大のため、放置。さらなる使用のための90％のFBS、10％DMSO中でこれらの細胞のアリコートをフリーズします。 </li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 2。ノックダウンとトランスフェクションの誘導<ol><li> 10cmプレートで選択培地中で細胞をプレート。 2分の1プレートにミリリットルあたり1μgにドキシサイクリンを追加し、37℃、48〜72時間（ 図4を参照）を、5％CO 2。 </li><li> 48から72時間後、ドキシサイクリンの有無にかかわらず、同じ培地で数を数える、細胞の各グループから細胞をトリプシン処理し、プレート6cmのプレート当たり1.5×10 6個の細胞。 37℃、5％CO 2で一晩細胞をインキュベートします。セクション2.1からのプレートの各グループは、各ポイントのDAPIのアッセイのための2つの重複だけでなく、各サンプルのウェスタンブロット分析のために一枚の板を含む12 6cmのプレート（ 図4参照）のために細胞を提供するように計画します。 </li><li>ベクトル4μgのと一緒に、空のプラスミド1μgのプラスミドまたはエンコーディングE4orf4の同一量：翌日のプラスミドは、以下の組み合わせで6cmのプレートで細胞をトランスフェクトAcf1-GFPまたはSNF2h-GFPを発現するサイレント突然変異、または対応する空のベクトルと1μgのプラスミドGFP発現（ 図4）3μgの導入による細胞クローンにおけるshRNAのに耐性がレンダリングされます。トランスフェクション混合物を調製するために上記のようjetPIE試薬（5μgのDNAあたり10μl）を使用します。各サンプルについて、3つのプレートのためのトランスフェクション混合物を準備します。 </li><li>室温でjetPIE試薬とDNAの15分間のインキュベーションの後、穏やかに3 6cmのプレートにそれぞれトランスフェクション混合物からDNA複合体の等量をピペットで、37℃、5％CO 2で一晩インキュベートする。 </li></ol> 3。トランスフェクトされた細胞におけるDAPIアッセイ<ol><li>翌日、Acf1またはSNF2hが効率的にノックダウンされていることとE4orf4が異なる試料でも同様に発現していることを決定するためにウェスタンブロット分析のためのサンプルあたり1つのプレートからタンパク質を抽出します。 </li><li> DAPIのために意図プレートから培地を吸引するアッセイ、PBSで穏やかにプレートを洗浄し、細胞をカバーするためにPBS中で調製し、4％パラホルムアルデヒドの1 mlを加える。この化学物質と細胞のパラホルムアルデヒド溶液と治療の調製化学フード内で行われるべきである。振とうせずに室温で15分間インキュベートする。 </li><li>パラホルムアルデヒドを吸引除去し、PBSで3回洗浄し、5分毎に時間室温でロッキング。少なくとも1時間、-20℃〜-20℃で、インキュベートに保ち、80％エタノールを加える。プレートは、彼らはエタノールの蒸発·乾燥を防ぐために十分に密封されている限り、数日間、-20℃でエタノール下に保つことができる。 </li><li>エタノールを吸引除去し、PBSで細胞を2回洗浄し、PBSで一度-BT（PBS中0.5％BSAおよび0.05％Tween-20を含む）と、5分毎に時間室温でロッキング。 </li><li>室温で揺らしながら非特異的抗体の結合を防止するために、20分間、10％ヤギ血清を含む1mlのPBS-BTバッファに細胞をブロック。次にトンを洗うPBS-BTの二回、彼はセル、各5分間洗浄。 </li><li>室温で揺らしながら1時間、1mlのPBS-BTの一次抗体（私たちの場合はE4orf4特異的抗体）で細胞をインキュベートする。次いでPBS-BTで二度洗浄し、PBSで一度に0.1％のBSA、各5分間洗浄を含む。 </li><li>暗闇の中で、室温で揺らしながら適切な二次蛍光標識された抗体と40分間、DAPI mlの最終濃度あたり0.5μgを含有するPBS-0.1％BSAを1mlの細胞をインキュベートします。その後、5分間PBSで洗浄し、吸引によりよく乾燥させ、完全な乾燥を実現するために一晩にさらに1時間プレートを逆さまにしておく。その後Fluoromount™を-G溶液を用いて、細胞にカバースライドをマウントします。 4でプレートを保つ℃を暗闇の中でアポトーシス核をカウントする準備ができるまで。 </li><li>公平な方法で行うことができますので、様々な試料にアポトーシス核を数えて、新しい番号で様々なプレートを識別するために、同僚に依頼してください。 </li><li> uの下の細胞を可視化する400X（空気中）または630×（浸油中）の倍率でpright蛍光顕微鏡。各サンプルで表現様々なタンパク質を染色し、トランスフェクトされた細胞集団内のDAPI染色により可視凝縮や断片化した核の数を数えるトランスフェクトされた細胞を識別します。いくつかのフィールドを監視し、少なくとも200トランスフェクトされた細胞の総数をカウントします。 </li><li>トランスフェクトされた細胞集団内のアポトーシス形態と核の割合を計算します。様々なサンプルの間の変化の統計的有意性を計算するために、重複して、2〜3回の実験を繰り返してください。 </li></ol> 4。代表的な結果遺伝子発現のノックダウン条件が成功されたコロニーを得る効率が​​関与する遺伝子に応じて、変数です。我々の手で、私たちはSNF2hため​​Acf1及び18のうち6のテスト12のうち7成功したコロニーを得た。 図2は、sh選択された細胞クローンの代表的なプレート（ 図2A）と同様に、単一のコロニー（ 図2B）を OWS。 図3は、72時間ドキシサイクリンの存在下または非存在下で増殖させた種々のクローンの細胞から抽出したタンパク質を用いて調製代表ブロットを示す。ブロットは、ローディングコントロールとして、SNF2hへとα-チューブリンに対する抗体で染色した。クローンのうちの2つ（番号4および5）ドキシサイクリン誘導時SNF2hレベルの大幅な減少を示した。それはpSuperior.neo + GFP細胞株の生成のために使用される（ 図1）プラスミドはネオ-GFP融合タンパク質をコードしているものの、安定細胞株における緑色蛍光が非常に低く、他のGFP融合タンパク質の発現に留意すべきであるこれらの細胞に一過性に導入が簡単に背景の上に緑色蛍光を検出することができた。 実験の概略図は、MEAに細胞クローンで実施確かAcf1またはE4orf4誘導される細胞死に対するSNF2hノックダウンの影響をFig。 4。ドキシサイクリン治療によって遺伝子発現のノックダウンに要する時間はレベルが低減すべきタンパク質の安定性に応じて変えることができる。 Acf1とSNF2hについては、72時間処理は、タンパク質レベルでの効率的なノックダウンのために必要であった。 図5は、E4orf4とGFPを発現し、凝縮や断片化形態を有するDAPI染色核の出現によって明らかにされた細胞死を起こしている細胞の一例を、 図6は、ドキシサイクリン誘起Acf1ノックダウンにつながったことを示している代表的な実験の結果を示していますE4orf4刺激された細胞死の増加（ 図6A）。この増加はE4orf4レベル（ 図6B）の増加に起因していませんでした。さらに、ドキシサイクリン誘導細胞へAcf1の回復はレベルにE4orf4毒性の増加を減少<html>非誘導細胞（ 図6）で観察された。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1highres.jpg"/> 図1。プラスミドpSuperior.neo + GFPの地図。マップは、shRNA発現とneo-GFP融合タンパク質のPGKプロモーター駆動発現を駆動するテトラサイクリン誘導性H1プロモーターを示しています。マップはOligoEngine pSuperiorマニュアルから脚色したものです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig2.jpg" /> 図2。ネオマイシン耐性コロニーの同定。コロニーを含むプレートの画像（）および単一コロニーの（B）が表示されます。コロニーは、ネオマイシンを含む選択培地で培養することにより、14日間の細胞を得た。 YS &quot;&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig3.jpg" /> 図3。選択したコロニーでのノックダウン効率の検討。ネオマイシンの存在下で選択されたいくつかのコロニーの細胞が重複したウェルで播種した。各試料の1つのウェルは、ドキシサイクリンによって誘導された（+）と1はよく未処理のまま放置されました（ - ）。タンパク質は、72時間後に誘導を抽出し、SDS-PAGE上でクロマトグラフィーした。ウエスタンブロット法を用いて、SNF2hへとα-チューブリン（ローディングコントロールとして機能する）に対する抗体で染色し、順次誘導およびコントロール細胞におけるSNF2hレベルを示した。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig4.jpg" /> 図4。典型的なノックダウン-DAPIアッセイ実験を計画している。実験の連続ステップがAcf1またはSNF2hノックダウン、Acf1またはSNF2h発現を回復したり、EMPを導入するトランスフェクションを達成するためのドキシサイクリン治療などが示されているtyはベクトルと細胞にE4orf4またはそれに対応する空のベクターを導入すること、および結果の分析。ドキシサイクリン処理プレートは赤で表示されます（DOX）とコントロールプレートが青色で記されています。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4442/4442fig4large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig5.jpg" /> 図5。 DAPIアッセイによるE4orf4誘導細胞死の検出図4で説明した様々な治療を受けた細胞は、トランスフェクトされた細胞の核を可視化するために固定されており、E4orf4特異的抗体およびDAPIで染色した。この具​​体的な絵はE4orf4と制御GFPタンパク質を含むサンプルから取られました。 （）GFP。 （B）はE4orf4。 （C）はDAPI。 （D）がマージされた画像。白い矢印マーク、GFPとアポトーシス形態と核を含むE4orf4-トランスフェクトされた細胞。赤い矢印アポトーシス核としてカウントされません不規則な形状の核をマーク。ただ分けているアスタリスクマーク分裂核または核。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig6.jpg" /> 図6。 Acf1ノックダウンはE4orf4誘導される細胞死を増強する。（A）はテトラサイクリン誘導プロモーターからAcf1-shRNAを発現するT-REX-293由来細胞株由来の細胞をドキシサイクリン（+ DOX）または放置（-DOX）で誘導した。三日後、細胞を、空ベクトルまたはサイレントの導入によりshRNAのに耐性がレンダリングされた発現プラスミドGFPタグAcf1、一緒E4orf4（+ E4orf4）または空のベクトルを（-E4orf4）を発現するプラスミドでトランスフェクトした突然変異。細胞は二十四時間E4orf4に対する抗体を用いたトランスフェクションとステンド後、DAPIで修正されました。細胞死の誘導は、上記のDAPIアッセイおよびパーセンテージoによって測定された凝縮された、または断片化した核を持つFトランスフェクトした細胞を決定した。 3を持つ代表的な実験が示されている複製され、エラーバーは標準偏差を表す。 （B）は、平行板からの細胞は、ウェスタンブロット分析のために採取した。ブロットはE4orf4、GFPとAcf1に対する抗体で染色した。内因Acf1とAcf1-GFPは、2つの別々のパネルに示されている。

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	<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+suppression+of+tumorigenicity+by+virus-mediated+RNA+interference.">Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.</a> Cancer. 2, 243-247 (2002).</li><li>Czauderna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+shRNA+expression+for+application+in+a+prostate+cancer+mouse+model.">Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model.</a> Nucleic acids research. 31, e127 (2003).</li><li>Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditional+vectors+for+hairpin+siRNA+knockdowns.">Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns.</a> Nucleic acids research. 31, e77 (2003).</li><li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+suppression+of+cellular+genes:+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference.">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> Journal of. 77, 8957-8961 (2003).</li><li>Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+targets+PP2A+to+the+ACF+chromatin-remodeling+factor+and+induces+cell+death+through+regulation+of+SNF2h-containing+complexes.">The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes.</a> Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).</li><li>Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+by+adenovirus+E4orf4+protein+is+cell+line-specific+and+is+mediated+by+the+death+receptor+pathway.">Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway.</a> J. Virol. 75, 789-798 (2001).</li><li>Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+type+5+E4+open+reading+frame+4+protein+induces+apoptosis+in+transformed+cells.">Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells.</a> J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).</li><li>Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4orf4+protein+interacts+with+both+Ba+and+B'+subunits+of+protein+phosphatase+2A,+but+E4orf4-induced+apoptosis+is+mediated+only+by+the+interaction+with+Ba.">Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba.</a> Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E4orf4,+a+novel+adenovirus+death+factor+that+induces+p53-independent+apoptosis+by+a+pathway+that+is+not+inhibited+by+zVAD-fmk.">E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk.</a> J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).</li><li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+induces+growth+arrest+and+mitotic+catastrophe+in+H1299+human+lung+carcinoma+cells.">The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells.</a> Oncogene. 28, 390-400 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4+open+reading+frame+4-induced+apoptosis+involves+dysregulation+of+Src+family+kinases.">Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases.</a> J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

特定の遺伝子発現のノックダウンは調節経路へのタンパク質の寄与の捜査に重要なアプローチである。必須遺伝子の発現の構成的なノックダウンが否定的に細胞増殖に影響を与えるので、それらの研究では、一時的なsiRNAの導入や安定した条件付きノックダウンシステムのアプリケーションのいずれかを必要とするかもしれません。ここで説明するshRNAの薬物誘発性の発現のための容量を持つ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>高グルコースDMEM </td><td>ギブコ</td><td> 41965 </td><td></td></tr><tr><td> TETシステムが承認したFBS </td><td>クロンテック</td><td> 631106 </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>ギブコ</td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td>ペンのStrep </td><td>ギブコ</td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン-EDTA </td><td>ギブコ</td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> T-REX-293細胞</td><td>インビトロジェン</td><td> R710-07 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td>シグマ</td><td> A1720 </td><td></td></tr><tr><td>ブラストサイジン</td><td> Invitロゲン</td><td> R210-01 </td><td></td></tr><tr><td>プラスミドpSuperior.neo + GFP </td><td> OligoEngine </td><td> VEC-PBS-0007/0008 </td><td></td></tr><tr><td> jetPIE </td><td> Polyplusトランスフェクション</td><td> 101から40 </td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>シグマ</td><td> D9891 </td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI） </td><td>シグマ</td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoromount™を-G </td><td> SouthernBiotech </td><td> 0100から01 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of cell-lines for conditional knockdown of gene expression and measurement of the knockdown effects on e4orf4-induced cell death

哺乳動物細胞における遺伝子発現の機能的不活性化は、様々な経路1,2に、目的のタンパク質の寄与の研究にとって極めて重要である。構成的なノックダウンが時間3月5日の長い期間のための細胞によって許容されていない場合しかし、遺伝子発現のノックダウン条件は場合に必要です。ここでは、ACFのクロマチンリモデリング因子のサブユニットの条件付きノックダウンを可能にする細胞株を調製するためのプロトコルを記述します。これらの細胞株は、アデノウイルスE4orf4タンパク質6による細胞死の誘導へのACFの寄与の決定を容易にする。 ACFのクロマチンリモデリング因子のAcf1とSNF2hサブユニットに対する短いヘアピンRNAをコードする配列はまた、ネオマイシン耐性遺伝子の遺伝子を含むプラスミドでドキシサイクリン誘導性プロモーターの隣にクローン化した。ネオマイシン耐性細胞クローンは、G418と孤立の存在下で選択した。得られた細胞ラインはによって誘発されたドキシサイクリン治療は、一度Acf1またはSNF2h発現レベルが低下した、細胞をコードするプラスミドE4orf4または空ベクターでトランスフェクトした。 shRNAコンストラクトの具体的な効果を確認するために、Acf1またはSNF2hタンパク質レベルはサイレント変異を導入することにより、shRNAのに耐性がレンダリングされた発現プラスミドAcf1またはSNF2hと共トランスフェクションすることにより、WTのレベルに復元されました。様々な試料に細胞死を誘導するE4orf4の能力は、トランスフェクトされた細胞集団におけるアポトーシスの形態を有する核の出現頻度が7-9を測定されたDAPIのアッセイによって決定した。 構成的なノックダウン細胞が致死であるかもしれない場合、ここで説明プロトコルは場合に限り、そのタンパク質パートナーによる細胞死の誘導に種々のタンパク質の機能的貢献の決定に利用することができる。

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Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

E4orf4誘導細胞死へのACFのクロマチンリモデリング因子の寄与を測定した。プロトコルはドキシサイクリン治療がACFユニットAcf1とSNF2hの条件付きノックダウンを誘導し、誘導細胞株でE4orf4誘導される細胞死を測定するためのDAPIアッセイを使用した細胞クローンの選択が含まれています。

遺伝子発現とE4orf4誘発細胞死にノックダウン効果の測定のための条件付きノックダウン細胞株の作製

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

preparation-cell-lines-for-conditional-knockdown-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K ビュー.  Technion - Israel Institute of Technology. E4orf4誘導細胞死へのACFのクロマチンリモデリング因子の寄与を測定した。プロトコルはドキシサイクリン治療がACFユニットAcf1とSNF2hの条件付きノックダウンを誘導し、誘導細胞株でE4orf4誘導される細胞死を測定するためのDAPIアッセイを使用した細胞クローンの選択が含まれています。

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

生物学

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAiは、Necromenic虫にマイクロインジェクションによる遺伝子ノックダウンとトランスジェネシスを媒介 Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

テトラサイクリン誘導性（テトオン）shRNAまたはcDNA発現で安定ヒト細胞株の世代

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

大規模な遺伝子ノックダウン中<em&gt; C.虫</em&gt;堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsRNA摂食ライブラリの使用

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

マウスにおける急速な非侵襲腰椎髄腔内注射を経由して生体内 siRNAトランスフェクションと脊髄における遺伝子ノックダウン

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...