この作業は、p53lab (BMSI、A*STAR) および JCO VIP 認可 (A*STAR) からのコア予算によって支えられた。

HEK293細胞株はプロトコルに使用され、10%のウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、および100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベックコの修飾イーグル培地で培養された。細胞を加湿環境下で5%CO2 で37°Cで培養した。
1. eIF4E:eIF4G604-646 相補分析によるeIF4F複合破壊の定量的評価
<ol><li>eIF4Eの細胞培養と一過性トランスフェクション:eIF4G604-646 相補アッセイ<ol>
<li>すべての実験のために20の通過未満で解凍した細胞を使用してください。1 日目に、標準セル カウンタを使用してセル番号を決定し、Trypan blue 除外方法13を使用して生存可能なセルの総数をカウントします。</li>
		<li>標準成長培地の2 mLで1ウェルあたり0.9 -1.2 x 106 のHEK 293細胞を含む6ウェルプレートをシード。 注:上記の細胞株内で最高のトランスフェクション効率を達成するために、播種の翌日にメッキされた細胞が70〜90%コンフルエントであることを確認してください。</li>
		<li>2日目の朝、以下に説明する脂質系トランスフェクション試薬を用いたSubA-eIF4EおよびeIF4G604-646-SubBプラスミドを用いた細胞を共トランスフェクトする( 材料表を参照)。<ol>
<li>125 μLの還元血清培地を含むチューブに9 μLのリポソームベース溶液をフェノールレッド( 材料表を参照)を入れたチューブで、トランスフェクションを行い、室温で5分間インキュベートします。</li>
			<li>各トランスフェクションチューブに対して各プラスミドの3μgを125μLの減らされた血清培地に希釈して、DNAのマスターミックスを調製します。</li>
			<li>DNAマスターミックスチューブに12μLのエンハンサー試薬を加え、よく混ぜてすぐにDNAを加える:比1:1で希釈リポソームの各チューブにエンハンサーマスターミックス。室温で15分間インキュベートします。</li>
			<li>各ウェルにDNA-脂質複合体を加え、24時間5%CO2の37°Cインキュベーターで細胞をインキュベートします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>3日目の朝、PBS 1 mLでそれぞれをよくすすいでください。</li>
		<li>PBSを取り出し、37°Cで5分間0.3mLのトリプシンを各ウェルにインキュベートします。</li>
		<li>各ウェルに0%のFCSを含むフェノールレッドを含まない還元血清培地の2 mLを加えてトリプシンを中和し、トランスフェクションした細胞を15mLチューブに移す。 注:フェノールレッドは、ルシファーゼ活性を妨げる可能性があります。したがって、細胞はフェノールレッドのない培地において、このステップから上に処理されなければならない。</li>
		<li>290 x g で 5 分間スピンダウンし、培地を吸引します。0%FCSを含むフェノールレッドなしで2mLの還元血清培地中の細胞を再懸濁する。ステップ 1.1 で説明したとおりにカウントします。</li>
		<li>種子は、0%FCSを含むフェノールレッドなしで培地90 μLのウェルあたり30,000細胞の密度で96ウェル不透明プレートでHEK 293細胞をトランスフェクトしました。3つの異なる化合物に対する同じ実験内で3つの技術的複製を得るために、縁のウェルを除く細胞を持つプレートの60の井戸を種付けする。</li>
		<li>トランスフェクションした細胞を播種した直後に、10%DMSO化合物溶液を10μL添加します(ステップ1.2参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>化合物製剤<ol>
<li>100% DMSO (v/v) に目的の化合物を溶解することにより、1 mM の化合物ストック溶液を調製します。各化合物滴定に対して3回の反復を行うために、1 mM化合物ストック溶液の8 μLを使用してください。 注:使用される1 mMストックコンパウンドのボリュームは、必要以上です。これは、ピペットエラーがあれば考慮するために行われます。</li>
		<li>1 mMストックの4 μLを持つストックコンパウンド溶液の2倍シリアル希釈を、各滴定ポイントごとに4 μLの100%DMSOに実行します。 注:完全な複合滴定を行う場合は、開始在庫から9個のシリアル希釈を100%DMSOで実行します。複数の化合物をテストする必要がある場合は、このステップとその後の希釈を容易にするために96ウェルプレートとマルチチャンネルピペットを使用してください。</li>
		<li>2倍シリアル希釈の各ポイントに36μLのHPLCグレードの無菌水を加え、10%DMSO(v/v)で40μLの10倍の作動溶液を調製します(すなわち100 μM〜0.39 μM 10%DMSOストックシリーズは、10μM〜0.039μMの最終溶液につながる。治療制御については、HPLCグレードの滅菌水に10%DMSOのみのストック溶液も用意してください。</li>
		<li>10x作動溶液の10μLを96ウェル不透明プレートの細胞に加えて、残存DMSO濃度1%(v/v)を100μLの残量で目的の最終濃度で得、37°Cで3時間インキュベートし、5%v/v大気CO2でインキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>ルシファーゼの相補性と生存率アッセイ<ol>
<li>3時間の薬物化後、1体積の基質と19ボリュームの希釈試薬を組み合わせることによりルシファーゼ基質試薬の調製を開始する(メーカーの指示書を参照)。 注:ルシファーゼアッセイは市販のキットを使用して実行されます( 材料表を参照)。</li>
		<li>マルチチャンネルピペットを使用して、25 μLの基質試薬をすぐに添加します。</li>
		<li>室温で軌道シェーカーで50分間350 rpmでプレートを振ります。</li>
		<li>プレートリーダーを使用して発光を評価します。そのためには、ミラーリーダーを発光に、発光フィルタを455に設定します。測定時間を1 sにして、6.5mmの測定高さを使用してください。</li>
		<li>細胞の生存率を評価するために、33 μLの生存率アッセイ試薬を加え、プレートリーダーを使用して室温で15分後に再び発光を再測定します。</li>
		<li>600 nmの発光と発光フィルターにミラーリーダーを設定して、プレートリーダーで発光を評価します。測定時間を1 sにして、6.5mmの測定高さを使用してください。 注:生存率は、メーカーの指示に従って細胞のリシス時のATPの細胞内レベルを測定することによって評価されます。この場合、生存率アッセイは異なる発光波長を有する別のルシファーゼを使用するため、多重化が可能である。</li>
		<li>データを使用して、データを 4 パラメータフィッティング曲線式に適合させるカーブによって、各化合物の IC50 値を決定します。 Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B)) + D 数値 D と A は、カーブフィッティングプロセスで拘束する必要があります。 D = Y 軸上の発光値は、最小曲線漸近曲線または最小理論レベルの応答を eIF4E:4G 相補アッセイから期待される最小の理論レベルで行う。 A = Y 軸上の発光値は、eIF4E:4G 相補アッセイから予想される最大曲線アセンプトまたは最大理論レベル応答を求める。 注: 最小応答の値は 1% DMSO (v/v) コントロール処理から導き出され、最大応答の値は、細胞の生存率に影響を与えずに高原化した高親和性 mTOR 阻害剤の最大応答から導出されます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. eIF4E:eIF4G604-646 細胞の eIF4F 複合破壊によるアッセイ阻害
<ol><li>アッセイによって測定される信号が化合物によるeIF4E-eIF4G相互作用の物理的破壊に対応していることを確認するために、ステップ1.1に記載されるように細胞をシードする。</li>
	<li>翌日、フェノールレッドを含まない減らされた血清培地の1mLで培地を交換し、目的の化合物で4時間インキュベートする。DMSO濃度が1mLの総体積で1%(v/v)の残留を確認します。 注: 結果との相関を容易にするため、測定された補完アッセイ滴定曲線の始まり、中点、終点の化合物濃度を使用します。</li>
	<li>細胞をライゼし、m7GTPプルダウンを行い、eIF4FおよびeIF4E:4EBP1複合体を単離した。m7GTPプルダウン実験を行う方法の詳細な手順は、他の場所で見つけることができます 14.</li>
	<li>ウェスタンブロット分析によりm7GTP結合eIF4G、eIF4Eおよび4EBP1タンパク質レベルを検出し、相補アッセイシグナル阻害を伴うeIF4F複合破壊に相関させる。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

本稿で説明する方法は、生細胞におけるeIF4G-eIF4E相互作用の直接測定を通じてeIF4F複合体集合体を定量的に監視するためのルシメラーゼベースの相補アッセイを利用する。我々は、eIF4E-eIF4G相補システムの使用に関する詳細を提供しており、また、このシステムが、eIF4E-eIF4G相互作用16の薬物誘発4EBP1媒介解離解を測定する際に極めて正確であることを示した。このアッセイの?...

遺伝子発現の制御は、増殖増殖や分化などの細胞プログラムの正しい実行において極めて重要な役割を果たす。調節制御機構は、遺伝子転写のレベルまたはmRNA翻訳のレベルで発揮することができます。過去10年間で、伸びと終了の後半のステップではなく、開始プロセスの変調による翻訳制御が、幅広い生物学的機能を果たすタンパク質の特定のサブセットの合成を細かく調節できることがますます明らかになりました。
生存に関与するmRNAの翻訳の増加は、抗オートファジーおよび抗アポトーシス応答がいくつかの癌に関与しており、また、異常活性化または翻訳開始因子1の発現を介して関連している。
eIF4F複合体は翻訳開始のマスターレギュレータです。5'mRNA末端にキャップ構造を結合することにより、eIF4Fは、初期mRNA-リボソームの採用を推進し、今度は弱く翻訳された真核生物mRNA2のmRNA翻訳効率を高めている。EIF4Fは、RAS/MAPKまたはAKT/TOR経路の異常活性化を有する多くの癌モデルに対して癌関連mRNAの媒介翻訳が報告されており、癌細胞が独自の腫瘍性腫瘍性活性を高めるためにeIF4Fをアップレコンドすることを示唆している。eIF4F複合体形成を阻害することによってこのフィードフォワードループの破壊は、これにより非常に有望な治療戦略3、4である。
eIF4F複合体は、(i)eIF4E、mRNAの5'UTRで見つかったキャップ構造と相互作用するeIF4Fのキャップ結合サブユニット、(ii)eIF4A、RNAヘリカーゼおよび(iii)eIF4G、eIF4AおよびeIF4Eの両方と相互作用し、最終的に40SSサブユニットを募集する足場タンパク質からなる。eIF4GとeIF4Eとの会合は、機能的eIF4F複合体の組み立てのためのレート制限ステップであり、eIF4E結合タンパク質(4EbPs、メンバー1、2および3)によって負の調節を行う)6。正規および非正規のeIF4E結合配列7、8、9(ヒトeIF4E上のaa 604-646にまたがる領域)から成るインターフェースを介してeIF4G結合eIF4Eと競合することにより、4EBPはeIF4Eの翻訳に積極的に関与し、eIF4Fの複雑な形成を防ぐeIF4Eのプールを減少させる。これらのタンパク質相互作用の相互作用は主に、4EBPのラパマイシン(mTOR)媒介リン酸化の哺乳動物標的によって調節される。ミトゲン刺激の際に、mTORは4E-BPタンパク質ファミリーのメンバーを直接リン酸化し、eIF4Eとの関連を減少させ、そしてそれにより、eIF4E-eIF4G相互作用および機能的eIF4F複合体の形成を促進する。
eIF4F複合体完全性を標的とする化合物の開発に多大な努力をしたにもかかわらず、生細胞におけるeIF4E-eIF4G相互作用の直接的な破壊を測定するアッセイの欠如は、細胞活性ヒット化合物の探索を制限している。eIF4E-eIF4G相互作用を通じてeIF4F完全性の状態をリアルタイムに監視するために、コエンテラジンアナログ(例えば、ナノルクベースの補完アッセイ)に基づくルシファーゼアッセイを適用しました。ルシベーター補完タンパク質系は、18kDaタンパク質フラグメント(SubA)と11個のアミノ酸ペプチド断片(SubB)からなるが、自己の最小の自己結合と安定性11に最適化されている。ヒトeiF4G1(aa 604-646)からのヒト全長eIF4EおよびeIF4E相互作用ドメインとの融合産物として表現されると、2つの相互作用タンパク質はSubAとSubB断片を近接して近接し、細胞透過性基質の存在下で、最終的に明るい図を生成する活性型発光体の形成を誘導する(我々は他の場所でeIF4E:eIF4G604-646 補完システム16の構築と検証を報告している。
ここでは、eIF4E:eIF4G604-646 補完システム(要求に応じて利用可能)を適用して、生細胞における4EBP1媒介eIF4E-eIF4G破壊を正確に測定する方法を説明する。さらに、我々は、潜在的な癌治療薬12として現在臨床試験中のいくつかのmTOR阻害剤の効果を測定することによって、その有用性を実証する。オフターゲット効果は薬物特異的活性をマスクすることが多いため、eIF4E:eIF4G604-646 システム測定の汎用性を、これらを考慮に入れて細胞生存率の直交測定で拡張する方法についても説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

eIF4F複合体の形成は、ヒトにおいてしばしば発癌活性化を受けるシグナル伝達経路の収束のための主要な下流節であることが示されている。eIF4Fは、翻訳開始のmRNA-リボソーム採用段階に関与するキャップ結合複合体である。多くの癌の細胞および前臨床モデルにおいて、eIF4Fの調節緩和は癌の増殖および生存に関与する特定のmRNAサブセットの翻訳の増加をもたらす。eIF4Fは、キャップ結合サブユニットeIF4E、ヘリケースeIF4Aおよび足場サブユニットeIF4Gから構築されたヘテロ三量体複合体である。活性eIF4F複合体の組み立てに重要なのは、eIF4EとeIF4Gタンパク質のタンパク質間相互作用です。この記事では、ライブセルにおけるeIF4E-eIF4G相互作用の状態を監視するeIF4Fアセンブリを測定するプロトコルについて説明します。eIF4e:4G細胞タンパク質-タンパク質相互作用アッセイは、eIF4F複合体完全性における薬物誘発変化を正確かつ確実に評価することを可能にします。この方法は、市販の化合物の活性を検証したり、eIF4F複合体の形成を効率的に妨害する新規化合物やモダリティのさらなるスクリーニングに応用できると考えています。

eIF4E:eIF4G604-646 相補系の感度を検証するために、4EBP1媒介性eIF4F複合体集合体の阻害をmTOR阻害剤を用いて評価した。4EBPタンパク質ファミリーのmTORC1キナーゼ依存性リン酸化を阻害することにより、mTOR阻害は、eIF4Eに対する4EBP1会合を増強し、したがって、eIF4F分解15を増強する。mTORC1のアロステリック阻害剤であるがmTORC2およびATP競合ベースの?...

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Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

ここでは、スクリーニングフォーマットにおけるeIF4F複合ダイナミクスの薬物誘発摂動を評価することを可能にする生細胞におけるeIF4E-eIF4G相互作用を測定するプロトコルを提示する。

ライブセルにおけるeIF4E-eIF4G相互作用を測定してeIF4Fアセンブリをモニタリング

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

monitoring-eif4f-assembly-measuring-eif4e-eif4g-interaction-live

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K ビュー.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). ここでは、スクリーニングフォーマットにおけるeIF4F複合ダイナミクスの薬物誘発摂動を評価することを可能にする生細胞におけるeIF4E-eIF4G相互作用を測定するプロトコルを提示する。

ビデオ: Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients have achieved complete remission (CR). Approximately half of the adult patients who entered CR will relapse within 12 months due to the outgrowth of residual AML cells in the bone marrow. The quantitation of these remaining leukemia cells, known as minimal or measurable residual disease (MRD), can be a robust biomarker for the prediction of these relapses. Moreover, retrospective analysis of several studies has shown that the presence of MRD in the bone marrow of AML patients correlates with poor survival. Not only is the total leukemic population, reflected by cells harboring a leukemia associated immune-phenotype (LAIP), associated with clinical outcome, but so is the immature low frequency subpopulation of leukemia stem cells (LSC), both of which can be monitored through flow cytometry MRD or MRD-like approaches. The availability of sensitive assays that enable detection of residual leukemia (stem) cells on the basis of disease-specific or disease-associated features (abnormal molecular markers or aberrant immunophenotypes) have drastically improved MRD assessment in AML. However, given the inherent heterogeneity and complexity of AML as a disease, methods for sampling bone marrow and performing MRD and LSC analysis should be harmonized when possible. In this manuscript we describe a detailed methodology for adequate bone marrow aspirate sampling, transport, sample processing for optimal multi-color flow cytometry assessment, and gating strategies to assess MRD and LSC to aid in therapeutic decision making for AML patients.

Detection of minimal or measurable residual disease (MRD) is an important prognostic biomarker for refining risk assessment and predicting relapse in acute myeloid leukemia (AML). These comprehensive guidelines and recommendations with best practices for consistent and accurate identification and detection of MRD, may aid in making effective AML treatment decisions.

サンプルおよび測定可能な残存病変と急性骨髄性白血病の白血病幹細胞を測定するプロセス骨髄に対する包括的なプロトコル

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

がん研究

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological information is also necessary. The protocol of immunocytochemical staining on paraffin-embedded cell blocks, presented herein, is an excellent alternative to immunofluorescent staining on non-paraffin-embedded fixed cells. In this protocol, a paraffin cell block from HeLa cells was prepared using the thromboplastin-plasma method, and immunocytochemistry was performed for the evaluation of two proliferation markers, CKAP2 and Ki-67. The nuclei and cytoplasmic morphology of the HeLa cells were well preserved in the cell-block slides. At the same time, the CKAP2 and Ki-67 staining patterns in the immunocytochemistry were quite similar to those in immunohistochemical staining in paraffin cancer tissues. With modified cell-culture conditions, including pre-incubation of HeLa cells under serum-free conditions, the effect could be evaluated while preserving architectural information. In conclusion, immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks is an excellent alternative to immunofluorescent staining.

Currently, immunofluorescent staining on fixed cells is the method of choice for determination of protein expression levels when morphological information is also necessary. This protocol presented herein provides for an alternative method of immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks.

セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学による培養細胞の蛋白質発現レベルの定量

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

車 T 細胞スフェロイド殺害アッセイ

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

免疫蛍光による非小細胞肺癌患者からの循環腫瘍細胞の半自動PD-L1特性図と列挙

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

腫瘍マクロファージ相互作用を研究するインビトロアッセイ

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を調べる三次元スフェロイドモデル

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural microenvironment and stromal cell interaction, cannot be entirely replicated with in vitro assays; thus, animal models are critical for investigating and understanding the effects of therapeutic intervention. However, most brain tumor xenografting methods do not produce brain metastases consistently in terms of the time frame and tumor burden. Brain metastasis models generated by intracardiac injection of cancer cells can result in unintended extracranial tumor burden and lead to non-brain metastatic morbidity and mortality. Although intracranial injection of cancer cells can limit extracranial tumor formation, it has several caveats, such as the injected cells frequently form a singular tumor mass at the injection site, high leptomeningeal involvement, and damage to brain vasculature during needle penetration. This protocol describes a mouse model of brain metastasis generated by internal carotid artery injection. This method produces intracranial tumors consistently without the involvement of other organs, enabling the evaluation of therapeutic agents for brain metastasis.

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Most brain metastasis mouse models are complicated by systemic metastases confounding analysis of mortality and therapeutic intervention outcomes. Presented here is a protocol for internal carotid injection of cancer cells that produces consistent intracranial tumors with minimal systemic tumors.

がん細胞の内頸動脈注射による脳転移のモデル化

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...