1。ナマルバ細胞を準備してカウント<ol><li>培養フラスコから細胞を除去し、ペレットに細胞を遠心してください。 PBSの既知の量で上清と再懸セルを削除します。このプロトコルで使用されている細胞は浮遊細胞です。あなたが接着細胞を使用している場合には、収集する前にトリプシンする必要があります。 </li><li> 、生細胞の数を決定するカウントスライド上に混合物の0.4％トリパンブルー溶液をピペットを10μlとそれを1:1に混合して細胞懸濁液の一部を染色し、TC10自動化されたセルにスライドを挿入するにはカウンター（バイオラッドラボラトリーズ株式会社）。 </li><li> TC10セルカウンターは、意志オートフォーカスは、カウントを続行して最も正確なカウントを保証する、とする。それは自動的にサンプル中の生細胞と全細胞の密度が決まります。 </li><li>ビュースクリーン上のセルを表示する画像を表示する]を選択します。その後、自動的に必要とされる細胞の混合物の量を計算TC10セルカウンタを持つように希釈電卓]を選択します。 </li><li>この実験は、3種類のsiRNAの合計を使用しています：あるコントロールsiRNAとSTAT6遺伝子、プラストランスフェクトされていないコントロールをターゲットに二つの異なるsiRNAを。これは、1mlあたり5 × 10 6細胞の最終濃度で3.6ミリリットルを必要とします。 </li><li>希釈計算機に所望の濃度と最終的な音量の値を入力し、それは細胞懸濁液の体積は、そのサンプルの生細胞数に基づいて、必要に応じて計算します。また、手動で計算を実行します。次に、新しいチューブにこれらの実験のために細胞の混合物の必要量を転送する。 </li><li>細胞をペレット化する細胞の混合物をスピンし、すべてのPBSを取り除く。ジーンパルサーエレクトロポレーションバッファー（バイオラッド社）の3.6 mlで再懸濁します。適切なsiRNAを含むチューブに800μlのアリコートを移し、穏やかに混合する。セルはエレクトロポレーションのための準備が整いました。 </li></ol> 2。 96ウェルプレートに細胞をElectroporating <ol><li> 96ウェルエレクトロプレートが一緒にエレクトロポレーションするすべての4つの治療のために複製することができます。 </li><li> 96ウェルエレクトロプレートの適切なウェルに細胞懸濁液150μlを移す。 </li><li> MXcellのエレクトロポレーションプレートをチャンバー内にプレートを挿入し、蓋を閉じます。 </li><li>使用されている細胞株とバッファ用に最適化された設定を使用してエレクトロ。これらの細胞は、指数関数的な減衰の250 Vの機器の設定と波、350μF、および1000Ωの抵抗を使用して電気穿孔されています。 </li><li>エレクトロポレーションが完了した後、混合し、その後、予め温めておいた培地を含む組織培養プレートに細胞を転送するために各ウェルに優しく上下にピペッティングし。ナマルバ細胞を7.5％FCS、1％ピルビン酸を添加したRPMI（ライフテクノロジーズ）で栽培されています。 </li><li>エレクトロされて​​いないコントロールサンプルは、残りの細胞懸濁液から採取し、同じようにエレクトロポレーションした細胞に予め温めておいた培養液の培養皿に追加されます。 </li><li> 37℃で一晩培養する° C、5％のCO 2。 </li><li> 24時間後、細胞の一組は、10 ng / mlの最終濃度が組換えIL - 4（R＆Dシステムズ）を誘導した。コントロール細胞の2番目のセットは、追加のメディアを受け取ります。すべての細胞は37℃、5％CO 2でさらに24時間インキュベートする。 </li></ol> 3。 RNAを抽出し、確認してください<ol><li>成長の48時間の合計した後、各ウェルの細胞をカウントし、RNA抽出のためのマイクロチューブに各ウェルから一アリコートを転送し、ウェスタンブロット法または他のタンパク質分析のための第2のアリコートを凍結する。 </li><li>細胞をペレット化するためにサンプルを遠心分離し、各チューブから上清を除去し捨てる。 </li><li> RNAの抽出を続行します。我々は一般的に含まれているプロトコルに従ってAurumトータルRNAキット（Bio - Rad）を使用してください。 </li><li>分解したRNAは、誤解を招くような結果を与えるので、siRNAを介した遺伝子ノックダウンを監視する場合には、RNAの品質を検証するために特に重要です。 280分の260の比はRNAの完全性を示すものではありませんしたがって、それは、RNAが分解されていないことを確認するためにゲルやマイクロ流体デバイス上でサンプルを実行することが重要です。 </li><li>ワンステップの質と量の両方を評価するために、これらのサンプルはExperion自動電気泳動システム（Bio - Rad）を用いて分析されます。 </li><li>最初に、熱のサンプル。その後、プライム、負荷、および渦Experion RNAチップ。 Experion電気ステーションにチップを挿入し、実行を開始します。 </li><li>実行が完了したら、Experionソフトウェア（従来のRNAに似たれるエレクトロ、結果表の形式（RNAの濃度、リボソーム比、およびRNAの品質指標番号を表示する）、および仮想ゲルに自動的に結果が表示されます。ゲル）。高品質のトータルRNAサンプルは、通常、8〜10のRQIを持つことになります。 </LI&gt; </ol> 4。リアルタイムPCR <ol><li> RNAの品質を確認した後、cDNAを反応に進んでください。この実験は、1回の反応でcDNAを合成し、リアルタイムPCRを組み合わせることiScriptワンステップRT - PCRミックス（Bio - Rad）を使用。 </li><li>各プライマーセットのRNAテンプレート以外のすべての反応成分を含むマスターミックスを作成し、PCRプレートに、それらを配布する。 </li><li>均一な濃度にRNAを希釈した後、適切なウェルにRNAサンプルを追加。各反応は三重に設定されています。 </li><li>プレートをシールし、CFX384リアルタイムPCRシステム（Bio - Rad社）に配置します。適切なプロトコルを選択して、実行を開始します。 </li><li>実行が完了すると、遺伝子発現は、コントロールsiRNAをエレクトロポレーションした細胞の同正常化への実験的siRNAをエレクトロポレーションした細胞のリファレンス遺伝子に正規化された目的の遺伝子の遺伝子発現を比較することによって決定されます。 </li></ol> 5。 siRNAのノックダウンの解析<ol><li> CCL17の発現は、CCL17のIL - 4依存的誘導に転写活性化因子STAT6の役割を調べるために定量的リアルタイムPCRを用いてモニターした。この実験では、GAPDHは、参照遺伝子として使用した。代替のリファレンス遺伝子または複数のリファレンス遺伝子は同じ方法で使用することができます。 </li><li> CFXマネージャーソフトウェアを自動的に同じサンプルから参照遺伝子の発現にCCL17の発現を正常化し、自動的に単に&quot;基準&quot;と対照治療としてGAPDHを選択することにより治療を制御するために、結果として得られる正規化された値を比較した（IL​​ - 4誘導することなくコントロールsiRNA）としてCFXマネージャーソフトウェアの実験の設定ウィンドウの&quot;コントロール&quot;。 </li><li> IL - 4誘導することなく、CCL17の転写は、対照治療に匹敵する低い、構成的な水準で推移。 </li><li> IL - 4で誘導され、通常のSTAT6経路（すなわち、コントロールsiRNAまたはトランスフェクトされていないコントロールトリートメント）保持する細胞はCCL17発現の8-10倍の誘導を示した。 </li><li> IL - 4ではなくSTAT6式のいずれかSTAT6 siRNAの導入により阻害と誘導された細胞はCCL17のIL - 4誘導発現におけるSTAT6の役割を確認する非誘導細胞よりも約2倍高いCCL17の発現を示した。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 IL - 4シグナル伝達経路の概要。 その受容体へのIL - 4の）結合は、STAT6の二量体化と活性化につながる。核に移行しSTAT6を活性化し、そのようなCC17として、その標的遺伝子の転写を活性化する。 B）IL - 4誘導がなければ、CCL17の転写は低く、構成的なレベルで維持されます。 C）STAT6遺伝子のsiRNAによるサイレンシングの後、IL4による治療は、CCL17発現のほとんど、あるいは全く増加につながるはずだ。 <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 IL4により、CCL17の誘導は、定量的リアルタイムPCRによって異なる条件で測定。 A）IL - 4なし栽培のサンプルは関係なく、遺伝子発現の発現の低い構成的レベルを持っていた。 B）緑と青で示すように、対照試料には、IL - 4による処理に通常対応し、CCL17の8-10倍の誘導を。しかし、赤やピンクに示すようにSTAT6をターゲットにしたsiRNAでトランスフェクトされた細胞は、STAT6演劇CCL17のIL - 4誘導発現における役割その考えを支持する、IL - 4に対応してCCL17の発現を減少していた。

著者はこの記事で使用する試薬や器具を生産するバイオラッドラボラトリーズによって採用されている。

この記事では、サスペンションの細胞株をトランスフェクトすると、これらの細胞で遺伝子発現を追跡する方法が困難にsiRNAをエレクトロポする方法について説明しました。この手順を行う際には、すべてのサンプルで可能な限り一貫性のある物事を保つために覚えておくことが重要S。

using an automated cell counter to simplify gene expression studies: sirna knockdown of il-4 dependent gene expression in namalwa cells

siRNAを介した遺伝子ノックダウンの使用は、遺伝子発現の研究​​において重要なツールであることを続けている。 siRNAの研究は、単一の遺伝子をダウンレギュレートの効果を研究するだけでなく、シグナル伝達経路やその他の複雑な相互作用ネットワークを調べるためだけでなく、実施されています。これらの経路の分析は、関連する細胞モデルの使用および細胞生理に少ない摂動を引き起こすメソッドの両方が必要です。エレクトロポレーションは、ますます調査中のシグナル伝達経路を変更することなく、細胞株および初代培養細胞をトランスフェクトすることが困難にsiRNAや他の核酸を導入するための効果的な方法として使用されている。成功のsiRNA実験に複数の重要なステップがあります、といくつかの実験的な段階でデータの品質を向上させながら作業を簡素化する方法があります。あなたがあなたのsiRNAを介した遺伝子ノックダウンのプロジェクトで始めるための、我々は、トランスフェクション後のリアルタイムPCR遺伝子発現解析を通してエレクトロポレーションする前に細胞を収集し、カウントから完全な経路の調査を実行する方法を説明します。以下の研究では、バーキットリンパ腫細胞株（ナマルバ）におけるCCL17のIL - 4依存性遺伝子発現における転写活性化因子STAT6の役割を調査する。実証技術は、接着および浮遊細胞の両方に対するsiRNAベースの実験の広い範囲のために有用である。我々はまた、どのように同時にMXcellのエレクトロポレーションシステムを使用して複数のサンプルをエレクトロにTC10自動細胞計数器で計数セル、、そしてどのように同時にExperion自動電気泳動システムを持つRNAの質と量を評価することを合理化する方法を示します。

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Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

この手順では、細胞株をトランスフェクトし、リアルタイムPCRによる遺伝子発現を追跡することが困難にsiRNAを導入し、迅速かつ簡単なワークフローを説明します。自動細胞計数器の使用、マルチウェルエレクトロプレート、および自動化された電気泳動の駅は、高価なロボット処理を必要とせず、迅速かつ信頼性の高い結果を提供する。

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

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Research

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Biology

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

生物学

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

脊髄電気生理学

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究​​のための動的画像解析

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.

遺伝子発現とE4orf4誘発細胞死にノックダウン効果の測定のための条件付きノックダウン細胞株の作製

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...