この作品は、NIHの助成金CA141009とGM39067によってサポートされていました。私たちは、書かれた部分にコメントをE.パーネルとR. Yarringtonに感謝します。

1。マウス脾臓ナイーブCD4 T細胞の分離<ol><li>インスティテューショナルアニマルケアと利用委員会（IACUC）プロトコルと一致して人道的な方法でマウスを生け贄に捧げる。脾臓を分析し、10％FBSを含むDMEMを10ml含むペトリ皿に入れてください。 </li><li>脾細胞を解放するために2つのスライドガラスのフロスト端部を用いて脾臓をつぶす。 15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li> 4℃で5分間、200×gで（典型的なローター直径の臨床遠心分離機用〜1,200 rpm）で遠心分離により細胞を回収</li><li>室温（RT）で1分間、赤血球を溶解するために2ミリリットルACKバッファーで細胞を再懸濁する。 FBSを含むDMEM 8mlのを追加することにより、反応を停止させます。 </li><li> 4℃で5分間、200×gで遠心分離によって細胞を回収</li><li> DMEM含むFBS 5mlに細胞を再懸濁し、70ミクロンメッシュフィルター（BDファルコン、カタログ番号352350）を通過する。細胞をカウントして続行ナイーブCD4の分離にメーカーの指示を使用してCD4離キット（Miltenyi社、カタログ番号130-​​095-248）を用いて細胞は、T。 4で5分間200×gで遠心分離によってT細胞℃でナイーブCD4を収集FBSと10mlのDMEMで細胞を再懸濁する。 </li></ol> 2。クロマチンの調製<ol><li>タンパク質複合体：クロスリンクDNAに15分間DMEM中で細胞懸濁液に1％の最終濃度を37％ホルムアルデヒドを加え、穏やかにRTで岩（Nutatorを用いる）。 </li><li> 125mMの最終濃度1 Mグリシンを添加することによって架橋を停止する。室温で5分間揺らし続けています。 </li><li> 4℃で5分間、200×gで遠心分離によって細胞を回収</li><li>氷冷PBS含むプロテアーゼ阻害剤の5mlに再懸濁することにより細胞を洗浄。 3回合計氷冷PBSを含むプロテアーゼ阻害剤で洗浄し、4℃で遠心分離により細胞を回収℃に</li><li> 1ml中に細胞を再懸濁しプロテアーゼ阻害剤を含む氷冷細胞溶解バッファー。 15分間、氷上でインキュベートする。細胞溶解の効率は0.4％トリパンブルー溶液（Sigma社、カタログ番号T8154）で細胞の小アリコートを再懸濁し、そして顕微鏡で観察することによって決定することができる。 </li><li> 4℃で5分間、200×gで（通常〜1,200 rpm）で遠心分離により核を集める慎重に上清を捨てる。 </li><li>プロテアーゼ阻害剤を含む核溶解緩衝液500μlの中の核を再懸濁し。 15分間、氷上でインキュベートする。 </li><li>出力レベル4、15秒バースト、氷の上で4回：Misonixソニケータ3,000、プローブの大きさ1.6ミリメートルを用いて細胞を超音波処理。各サンプルは、サンプルの過熱を防ぐために再度それを超音波処理する前に、1〜2分間氷上で冷却しなければならない。過熱は、クロスリンクの逆転を引き起こす可能性があります。 </li><li> 4で5分間16,000 xgで（マイクロで〜13,200 rpm）で超音波処理クロマチンを遠心℃に</li><li>明確なsupern20μlのアリコートを取りatant、DNAローディング染料を追加し、2％アガロースゲル（ほとんどのアプリケーションのために超音波処理したDNAの理想的な大きさが200-500 bpである）を通して電気泳動により超音波処理したDNAを確認してください。 </li><li> UV分光光度計を用いてDNA濃度を決定します。断片化クロマチンは℃のクロマチン免疫沈降反応を設定するためにすぐに使用されるか、または-80℃で保存することができます一般的に我々はマウス当たり2-3 X 10 6精製したCD4 T細胞は7.5から10μgのDNAを得る。 </li></ol> 3。クロマチン免疫沈降（すべてのステップが0-4℃で実施しなければならない） <ol><li>プロテアーゼ阻害剤付きチップ希釈バッファーでμgの/ mlの5-10のDNA濃度（総容積= 1ミリリットル）に超音波処理クロマチンを希釈。 </li><li>入力として100μlの（10％）を保存します。氷の上に保管してください。 </li><li>アリコート450μlの各アイソタイプコントロール（マウスまたはウサギIgG）及び目的の抗体としてラベル2 1.7ミリリットルマイクロチューブに。同じアイソタイプの複数の抗体が使用される場合、単一のアイソタイプCONTRオールは、この分析を実行するのに十分である。異なる動物源またはアイソタイプの抗体が使用されている場合は、複数のアイソタイプコントロールが必要になります。 </li><li>それぞれのチューブに使用する抗体の特異性に応じて、特定の抗体、またはアイソタイプコントロールの2-5μgのを追加します。 </li><li> °Cクロマチン - 抗体複合体の形成を可能にするために4℃で一晩Nutatorを使用してチューブを揺する。 </li><li>上記混合物にプロテインG磁気ビーズ（中断ビーズの1:1スラリー）を25μlを加え、4℃で少なくとも2時間揺することができ℃の我々のベンダーからビーズを直接使用することができる。 </li><li>磁気スタンドにマイクロチューブを置き、ビーズが磁化側に収集することができます。 </li><li>丁寧にビーズを乱すことなく吸引して溶液を除去。 </li><li>低塩洗浄溶液1mlを加え、穏やかにNutatorで5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。一回繰り返します。</li><li>高塩洗浄溶液1mlを加え、Nutator上で5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。一回繰り返します。 </li><li>塩化リチウムの洗浄溶液1mlを加え、Nutatorで5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。一回繰り返します。塩化リチウムの使用は、ビーズと非特異的クロマチン相互作用の効果的な除去を改善する。 </li><li> TE溶液1mlを加え、Nutator上で5分間揺することができます。マグネチックスタンドを使用してビーズを収集し、洗浄溶液を除去。 </li><li>溶出緩衝液を250μlを添加することによってビーズからDNAを溶出する。室温で15分間ロック。溶出液をオフにピペットして、新しい1.7ミリリットルのマイクロチューブでこの材料を保存します。もう一度繰り返し、溶出の両方を兼ね備えています。ビーズを捨てる。 </li><li>クロスリンクは最終0.3 Mの濃度とのRNase Aを1μl（20メートルに5 M NaClを追加し逆転する<html>溶出したDNAへグラム/ミリリットル）。容積500μlのように、ステップ3.2で保存した入力に溶出バッファー400μLを加える。入力に0.3 M、リボヌクレアーゼA、0.5 M EDTA、1Mトリス-HCl pH6.5の液20μlおよびプロテイナーゼK（20 mg / ml）で1μlの10μlの1μlのにNaClを加える。 </li><li>乾燥加熱ブロックで65℃で一晩チューブ℃でインキュベートする。 、サンプルの蒸発を避けるためにシールや開口部からそれらを保つためにチューブの重量を配置する。ハイブリダイゼーションオーブンを使用することもできる。 </li><li>室温に冷却管をしましょう​​。 1ミリリットルの100％エタノールを加え、-80℃で2時間、一晩インキュベート°C沈殿DNAへ。 </li><li>ペレットに15分DNAに対して16,000 xgでチューブを遠心する。 70％エタノールと空気乾燥ペレットで一度DNAペレットを洗浄します。オートクレーブ蒸留水100μlのDNAペレットを再懸濁します。 </li><li>溶出緩衝液50μlの総容積でキアクイックスピンカラム及び溶出を用いてDNAを精製する。このDNAは、PCRのために使用する準備ができました。 </li></ol>PCR反応の &quot;&gt; 4。準備（すべてのステップを氷上で実施しなければならない） <ol><li>チップと対応する入力サンプルから全DNAサンプルを収集します。また、ターゲットを絞った地域だけでなく、制御領域のすべてのPCR試薬とプライマーを集める。 &quot;ホットスタート&quot; Taq DNAポリメラーゼを使用してください。私たちは、この手順でDNA増幅を定量化するためにSYBRグリーンベースのアッセイを使用しますが、必要に応じて定量PCRマスターミックスキットを使用することができます。 </li><li>定量PCR分析における標準曲線を生成するための入力DNAの連続希釈を行う。例えば10％、1％、0.1％、溶出緩衝液中の0.01％は（ステップ3.18でキアクイックスピンカラムから）。この標準曲線テンプレートセットの濃度範囲と増分を96ウェルプレート（Genemate、カタログ番号T-3182から1の各ウェルにインプットDNAサンプルを10μl分注し等のChIP富化の予想されるレベルに基づいて変えることができる）、重複しています。 </li><li> 10ミリリットルチップアイソタイプコントロールからのDNAと同様に、それぞれに特異的な抗体をディスペンス三重で井戸。 </li><li>ターゲットプライマーまたはコントロールプライマー（各プライマー0.1μMの最終濃度）のいずれかを含む &quot;マスターミックス&quot;を作成し、各ウェルに10μLを分注する。たとえば、テンプレートで以下のマスターミックスを含有スペンスウェルに標的プライマーをウェルに緑色のマークが付けられ、コントロールプライマーを用いてマスターミックスを分配赤いマーク。 </li><li>井戸の底にすべてを収集するために、室温で1分間臨床遠心分離機（〜1,200 rpm）で、500×gで光学プラスチック封止膜と遠心分離機を用いたPCRプレートをカバーしています。 </li><li> PCR反応を開始します。私たちは、ライトサイクラー480 II（Roche）をこの例では、定量PCRを実行するためのオペレーティングライトサイクラー480SW 1.5ソフトウェアを使用します。 </li></ol>プレインキュベーション：1サイクル：95℃/ 5分。 増幅：40-45サイクル：94℃/ 5​​秒、60℃/ 5秒、72°C/10秒（温度が融点TEMPERATUR未満2-3°CであるべきアニーリングプライマーのE）。 融解曲線：1サイクル。 冷却：1サイクル。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> A </td><td> 10％入力</td><td> 10％入力</td><td>アイソタイプ</td><td>特定</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B </td><td> 1％入力</td><td> 1％入力</td><td>アイソタイプ</td><td>特定</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> C言語</td><td> 0.1％入力</td><td> 0.1％入力</td><td>アイソタイプ</td><td>特定</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td> 0.01％入力</td><td> 0.01％入力</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> 10％入力</td><td> 10％入力</td><td>アイソタイプ</td><td>特定</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td> 1％入力</td><td> 1％入力</td><td>アイソタイプ</td><td>特定</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td> 0.1％入力</td><td> 0.1％入力</td><td>アイソタイプ</td><td>特定</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td> 0.01％入力</td><td> 0.01％入力</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>緑：ターゲット地域のプライマーを使用してください。 赤：制御領域のプライマーを使用してください。 5。分析<ol><li> DNAの絶対量の定量化のためのプログラムのqPCRソフトウェア。重要なのは、未知の特定及びアイソタイプ試料における補間DNA量に標準曲線を使用することは、すべてのプライマーの品質と効率の評価とのマッチングは、サンプルで見つかった濃度範囲にわたって設定可能。さらに、それはまた、モルを提供する電子usingΔΔCqおよび関連の方法よりも最終的な相対倍濃縮結果にCQ（C tまたはC p）の値を変換するための信頼できる方法。 </li><li>サンプルエディターに移動​​し、それらの標準曲線の値と種々の希釈の入力サンプルを（10％、1％、0.1％と0.01％）含むウェルをマーク。また、PCRプレートがレイアウトされているとおりに、未知のChIPサンプルを井戸にラベルを付ける。他の定量PCRマシンで使用される同等のソフトウェアでは、それに応じて各プライマーペアの反応は、標準曲線の値と実験およびアイソタイプ対照サンプルに対応する部分集合を指定する。 </li><li>ライトサイクラーソフトウェアでは、サブセットエディタに移動し、入力サンプルと井戸と同様未知のChIPサンプルを含むサブセットをマーク。未知試料を分析のために、入力サンプルの既知濃度から生成された標準曲線を用いて定量することができる。他の定量PCRマシンで使用される同等のソフトウェア、指名サブセットcorrespで各プライマーペアのすべての反応にとめどなく流れ出ること。 </li><li> PCR増幅が完了したら、 &quot;絶対Quant/2ndデリバティブマックス&quot;との分析を行い、分析し、Enterキーを押しOKためのサブセットを選択します。他の定量PCRマシンで使用される同等のソフトウェアでは、各サブセット中のDN​​A量にCqの値を変換します。 </li><li>入力サンプルの既知の濃度を用いて標準曲線を生成し、未知試料中に存在するDNAの絶対量が表示される &quot;計算&quot;を押してください。 </li><li>せん断DN​​Aの品質が良好であれば、とプライマーは、標的部位に特異的に結合する場合には、PCR効率に近い2〜でなければならない。 </li><li>可能であれば、同じサブセットに対して &quot;呼び出しのTm&quot;と融解曲線分析を行います。単一のピークは、1つの特定の製品が増幅されたことを示します。特定のDNAの増幅はまた、アガロースゲルを介してDNAラダーと共にPCR産物を電気泳動することにより試験することができる。 </li><li>としてデータをエクスポートタブさらなる分析のためにMicrosoft Excelで開くことができます区切りのテキストフ​​ァイル、。 </li><li> Microsoft Excelを使用して、標的プライマー用アイソタイプコントロールで特定の抗体のためのDNA量を割ります。制御領域のプライマーに対して、この手順を繰り返します。同じアイソタイプの抗体は、複数の異なる免​​疫沈降に使用した場合、同じアイソタイプコントロールからの値が、これらのそれぞれを正規化する。複数の標的プライマー対が使用される場合、また、単一の制御プライマー対のセットからのDNA量は、各ターゲット（ 図1および2）の正規化のために使用されるべきである。出力値は、非特異的抗体の背景免疫沈降に対する各位置における特異的抗体免疫沈降倍濃縮を表す。 </li><li>に対して相対的濃縮を取得するために制御領域プライマー倍濃縮（制御アイソタイプ）とターゲットプライマー倍濃縮を（制御アイソタイプ）割りバインドされていない領域（ 図1）を制御する。重要なのは、なぜなら各サンプルの総入力DNAと標準曲線の発生上記の免疫沈降値のそれぞれが、標準曲線から既にに正規化され、補間、およびように発現していることに注意して、マシンソフトウェアによって総入力の割合。 </li><li>免疫沈降または洗浄に使用されるバッファのストリンジェンシーが高すぎる場合には、アイソタイプ対照の増幅がサンプルが観察されない免疫沈降させながら、特異的な抗体で免疫沈降サンプルから堅牢な増幅が、観察されることが可能である。そのようなシナリオでは、標的領域と非結合領域の両方に特異的な抗体チップからのアイソタイプコントロールチップの量を減算する方がよい。相対的濃縮は、非結合領域（ 図3）差による標的領域に対する差を割ることによって算出することができる。 </li></ol>

<ol>
	<li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters.">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).</li><li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation.">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 37-47 (2002).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+nuclear+localization+of+NFAT+in+Foxp3++regulatory+T+cells+independent+of+calcineurin+activity.">Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity.</a> J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).</li><li>Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct1+is+a+switchable,+bipotential+stabilizer+of+repressed+and+inducible+transcriptional+states.">Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+localization+of+replication+factors.">Genome-wide localization of replication factors.</a> Methods. 57, 187-195 (2012).</li><li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations.">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).</li><li>Sikes, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+method+for+rapid+and+sensitive+chromatin+immunoprecipitation.">A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation.</a> Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes.">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li><li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins.">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

上記プロトコルが正確にチップを用いた主要リンパ球からDNAの濃縮を定量化する堅牢な方法を提供します。このプロトコルで堅牢性のために一つの大きな理由は、生物学的には複製が含まれていることです。上記のプロトコルは3が、独立して計算される濃縮を複製し使用しています。出力は、変動性の尺度を提供するために、計算された濃縮および標準偏差の程度を提供するために平均化さ...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F-8775</td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline</td>
 <td>Hyclone</td>
 <td>SH30256.01</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease Inhibitor tablets</td>
 <td>Roche</td>
 <td>04693116001</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein G magnetic beads</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>101945</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase A (20 mg/ml)</td>
 <td>EMD Millipore</td>
 <td>556746</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K (20 mg/ml)</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03115879001</td>
 <td>Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum Taq DNA Polymerase</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>10966-034</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SYBR Green I</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S7567</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Glycine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Prepare fresh</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M EDTA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris-HCl, pH 6.5</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table of Specific Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clay Adams Brand Nutator</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>Model: 421105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic Stand</td>
 <td>Promega</td>
 <td>Z5342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiaquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Masonix Sonicator 3000</td>
 <td>QSonica</td>
 <td>Model: S3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Spectrophotometer</td>
 <td>NanoDrop Technologies</td>
 <td>ND-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating Block</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13259-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotator</td>
 <td>VWR</td>
 <td>80085-692 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated bench top centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Model: Allegra X-12R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5415 D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table of Equipment </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

efficient chromatin immunoprecipitation using limiting amounts of biomass

クロマチン免疫沈降（チップ）は、生きた細胞のクロマチン中のDNAと異なるタンパク質との相互作用を決定するために広く用いられている方法である。例としては、配列特異的DNA結合転写因子、ヒストンおよびそれらの異なる変形状態が、そのようなRNAポリメラーゼおよび補助因子として酵素およびDNA修復成分を含む。その普遍性にもかかわらず、最新の欠如、相互作用の定量的な評価指標を可能材のベンチの準備の両方の正確な分析のための詳細な方法論があります。この情報の欠如に起因し、また、任意の免疫沈降のように、条件は実験条件の新しいセットの再最適化する必要があり、あるため、ChIP解析が不正確又は不十分な定量結果を受けやすい。 我々のプロトコルは、最終的に転写因子で精液の仕事に由来する：DNA相互作用1,2が、感作に多くの改良を組み込ん困難な得る細胞タイプに対するVITY及び再現。プロトコルは、DNAの濃縮を定量する定量PCRを用いて、以下のプロトコルの半定量的変異体を使用して両方が正常3,4使用されている。 PCR増幅された材料のこの定量的な分析は、計算行い、アッセイにおける制限因子を表す。重要なコントロールやその他の考慮事項は、下に変更を表示しないようにこのような研究対象のタンパク質（または予想に拘束されることにしないと予測遺伝子間領域としてアイソタイプをマッチさせた抗体の使用だけでなく、ゲノムDNAの制御領域の評価を含んで実験条件）。さらに、すべてのChIPのサンプルの入力材料の標準曲線を実験材料で濃縮度の絶対レベルを導出するために使用される。標準曲線の使用は関係なく設計されているどのように慎重にの、プライマーセット間のアカウントの違いを考慮するのに役立ち、また、効率が異なる単一プライマーセット用のテンプレート濃度の範囲全体にわたってences。我々のプロトコルは、我々は広範囲に後で、分析フェーズをカバーするという点で5-8利用可能な他のものとは異なっている。

もしあればクロマチン免疫沈降（ChIPの）プロトコルは、このように &quot;ローディングコントロール&quot;として、ゲノムの非結合領域を増幅するプライマー対を使用してPCRで使用されるDNAの量で、相違のためにここコントロールを提示した。 図3に示す例では、標的領域としてマウスIL2プロモーターの利息および転写因子NFAT結合部位の我々のタンパク質に結合していない領...

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Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

efficient-chromatin-immunoprecipitation-using-limiting-amounts

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K ビュー.  University of Utah School of Medicine. 我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。

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Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

生物学

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

メチル化DNA免疫沈降

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

同系ゼブラフィッシュにおける限界希釈細胞移植を用いた腫瘍増殖細胞の頻度を定量化

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

を使用してクロマチン免疫沈降（ChIP）ショウジョウバエ組織

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...