このプロトコルにより、クロマチン免疫沈降実験のための凍結肝臓検体からの再現性と信頼性の高いクロマチン抽出が可能になります。はじめに、凍結した組織を含むチューブを乳鉢に入れ、そこに5分間置きます。次に、固い崩れがなくなるまで、事前に冷やした乳棒を使用してサンプルに圧力をかけます。
サンプルが入っているチューブを乳鉢から取り出します。950マイクロリットルの氷冷PBSと必要な阻害剤を加え、サンプルが完全に再懸濁されるまで静かに上下にピペットで移動します。直ちに組織懸濁液をホモジナイザーに移し、乳棒Aで20〜30ストロークを適用して、より細かい懸濁液を得る。
泡立ちを防ぐために、乳棒を液相の外側に移動させないでください。ホモジネートを、以前に氷上で冷やした新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、チューブを1, 300 G、摂氏4度で5分間遠心分離します。
上清を慎重に除去し、穏やかなピペッティングによりペレットを950マイクロリットルの室温PBSに完全に再懸濁します。次に、63.6マイクロリットルの16%メタノールフリーホルムアルデヒドを加えて、最終濃度1%を得るすぐにチューブを室温で10分間回転させます。回転後、室温で113マイクロリットルの1.25モルグリシンを加えて125ミリモルの最終濃度を得、さらに5分間チューブを回転させます。
次に、サンプルを1, 300 Gで摂氏4度で3分間遠心分離します。上清を廃棄し、必要な阻害剤を含む950マイクロリットルの氷冷PBSにピペッティングしてペレットを注意深く再懸濁します。サンプルを再度遠心分離し、前述のようにペレットを再懸濁します。
遠心分離ステップをもう一度繰り返し、すぐにクロマチン単離手順に進みます。950マイクロリットルのバッファーAと必要な阻害剤をペレットに加え、ペレットが完全に再懸濁されるまでピペッティングで穏やかに混合します。次に、チューブを摂氏4度で10分間回転させます。
回転後、サンプルを2, 000 Gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。950マイクロリットルのバッファーBと必要な阻害剤をペレットに加え、ペレットが完全に再懸濁されるまでピペッティングで穏やかに混合します。次に、チューブを摂氏4度で10分間回転させます。
回転後、サンプルを再度遠心分離します。上清を除去する。次に、必要な阻害剤を含む300マイクロリットルの室温バッファーCをペレットとピペットに激しく加えます。
サンプルを15〜30秒間ボルテックスします。次に、チューブを短時間回転させて、蓋の上の滴を集めます。クロマチンサンプルを超音波処理した後、30マイクロリットルの10%Triton X-100溶液を加え、5〜10秒間ボルテックスします。
サンプルを16, 000 Gで4°Cで15分間遠心分離します。そして、上清を氷上で予め冷却した清潔な1.5ミリリットルのチューブに移す。10〜25マイクロリットルの剪断クロマチンを新しいチューブに移し、バッファーCを加えて最終容量200マイクロリットルにします。
アリコートとショックは、さらに使用するまで、残りのクロマチンを摂氏マイナス80度で凍結します。8マイクロリットルの5モル塩化ナトリウムを加え、1, 000 RPMで振とうしながら加熱ブロック内で摂氏65度で少なくとも6時間インキュベートする。可能であれば、インキュベーションを一晩延長します。
サンプルを室温で5分間冷却した後、2マイクロリットルのRNase Aを加え、1, 000 RPMで振とうしながら摂氏37度で1時間インキュベートします。加熱ブロックからサンプルを取り出し、7マイクロリットルの300ミリモルの塩化カルシウムと2マイクロリットルのプロテイナーゼKを加えます1, 000 RPMで振とうしながら、加熱ブロック内のサンプルを摂氏56度で30分間インキュベートします。一方、サンプルごとに1本の相分離チューブを1本準備し、16, 000 Gまで4°Cで1分間遠心分離します。
加熱ブロックからチューブを取り外し、室温で3分間平衡化させた後、400マイクロリットルのサンプルを以前に遠心分離した相分離チューブに移します。次に、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール溶液400マイクロリットルを加え、5秒間ボルテックスする。チューブを16, 000 Gで4°Cで5分間遠心分離します。
次に、400マイクロリットルのクロロホルムとボルテックスを5秒間加えます。チューブをさらに5分間遠心分離し、400マイクロリットルの上相を、24マイクロリットルの5モル塩化ナトリウムと0.75マイクロリットルのグリコーゲンを含む新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、チューブを簡単にボルテックスします。
1, 055マイクロリットルの100%エタノールを加える。次に、徹底的にボルテックスし、サンプルを摂氏マイナス80度で1時間、または摂氏マイナス20度で一晩インキュベートします。インキュベーションが完了したら、サンプルを16, 000 Gで4°Cで30分間遠心分離し、ペレットを脱臼さずに上清を慎重に取り除きます。
500マイクロリットルの冷たい70%エタノールを加え、チューブを静かに傾けてペレットが洗浄されるようにします。チューブを16, 000 Gで4°Cで15分間遠心分離します。上清全体を慎重に取り除き、ペレットを室温で乾燥させます。
または、チューブを摂氏37度でインキュベートして、より迅速に乾燥させます。50マイクロリットルのTris-EDTA溶液を加え、300RPMで振とうしながら5〜10分間チューブを加熱ブロックに置きます。次に、1%アガロースゲルでDNAを分析します。
クロマチンの脱架橋およびアガロースゲル上のDNAの可視化の後、剪断の成功は、100〜300塩基対の範囲の断片の存在によって認識され得る。クロマチンは、H3K4トリメチル化、H3K27アセチル化、およびH3K27トリメチル化抗体で正常に沈殿し、さらにqPCRで分析されました。肝臓で活発に転写される染色体1つのオープンリーディングフレーム43、プロテアソーム20Sサブユニットβ2、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター領域は、H3K4トリメチル化およびH3K27アセチル化の濃縮を示した。
比較すると、ホメオボックスC13、ホメオボックスC12、およびマウスミエリン転写因子肝臓でサイレンシングされている1つのプロモーター領域は、期待どおりに富化されていなかった。H3 K27トリメチル化は反対の挙動を示し、それによってクロマチン免疫沈降またはChIPアッセイの成功を確認する。クロマチンをChIP-Seqに首尾よく供した。
シーケンシング後、リードは事前に準備されたインデックスに整列され、種に従って分離されました。遺伝子転写開始部位でのH3K4トリメチル化およびH3K27アセチル化沈着は、予想通りH3K27トリメチル化沈着と拮抗した。Hox Cクラスターは、マウスとヒトの両方の肝臓で転写的に不活性であることが知られています。
H3K4トリメチル化とH3K27アセチル化のプロファイリングでは、これら2つの翻訳後修飾のピークがクラスター外で示され、H3K27トリメチル化のシグナル強度は遺伝子クラスター内で増加する傾向があります。凍結組織標本からのクロマチン抽出は、細胞懸濁液の細かさと架橋中の温度に強く依存し、固有の変動性が高いです。固定されたラボ条件を確保することは、フラグメントサイズ範囲の再現性を維持するのに役立ちます。
