이 작품은 약물 남용 (NIDA) 부여 R01 DA24040 (DCC), 콜로라도 대학의 혁신적인 씨 그랜트 (DCC) 및 NIDA 교육 교부금 T32 DA017637 (MVB)에 대한 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 바이러스의 저장 및 준비 <ol><li> 쥐의 뇌에 옵신 유전자를 전달하기위한 복제 무능한 AAV 벡터의 사용은 바이오 안전성 레벨 1 (BSL-1)에 대한 승인과에서 사용할 수있는 미국 정부 간행물, 미생물학 및 생물 의학 연구소에서 바이오 안전성에 설명 된대로 적절한 보호 및 취급 절차가 필요합니다 (의 질병 통제의 웹 사이트를위한 센터 <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li> -80 ° C의 냉동고에있는 클래스 II 바이오 안전성 내각과 저장소에있는 작은 작업 분주로 제조 업체의 유리 병에서 반복 동결 - 해동 사이클, 피펫 바이러스를 방지하기 위해. </li><li> 이전 정위 주사로 나누어지는 얼음에 해동 한 후 잠시 벤치 톱 원심 분리기와 스핀 다운 할 수 있습니다. </li><li> 천천히 해밀턴 유리 주사기 및 실리콘이나 미네랄 오일 소량의 바늘을 백필.확인 주사기 배럴에 보이는 기포가 없는지 확인하십시오. microinjector 펌프에 주사기를 삽입하고 수직 정위 팔 (즉, 정위 조작)에 직접 펌프를 연결합니다. </li><li> 바늘의 선단이 바이러스 분취 튜브의 바닥에 닿을 때까지 정위 아암을 하향 조정한다. 바이러스의 원하는 볼륨 (1 ㎕를 주입 1.5 μl를) 철회 microinjector 펌프 컨트롤러를 사용합니다. </li><li> 바이러스와 접촉 모든 재료와 표면은 염소 표백제 (10 %) 등의 소독제로 소독해야한다. </li></ol> 2. 수술과 바이러스 주입 <ol><li> 마취제와 동물을 마취 (쥐, 125 ㎎ / kg, IP) - 자일 라진 (쥐, 10 ㎎ / kg, IP) 칵테일. 마취의 효과를 측정하기 위해, 발가락 핀치에 반사 응답을 확인하고 필요한 경우 마취제의 보충 용량을 제공합니다. 표준 무균 수술 방법을 사용하여, 정위 장치 (데이비드 KOPF에서에 동물을 배치인스투르먼트). </li><li> 작은 외과 용 가위 또는 메스와 동물의 두개골의 상단에 피부를 통해 중간 선 절개를합니다. 부드럽게 결합 조직을 분리하고 작은 뼈 스크레이퍼와 두개골의 상단을 청소합니다. </li><li> 동물의 머리가 z는 브레 그마 및 람다 좌표 있도록이 동일 수준인지 확인합니다. 이러한 정위 좌표에있는 쥐의 두뇌 (조지 팍시 찰스 왓슨, 대학 출판부, 2007) 또는 마우스 뇌 정위 좌표 (키스 BJ 프랭클린과 조지 팍시, 학업 부담으로 뇌지도 책에서 대상 뇌 영역의 정위 좌표를 결정 , 2007). 수술 펜 주사의 의도 된 사이트를 표시합니다. </li><li> 조심스럽게 얇은 휴대용 드릴을 사용하여 대상 지역에 두개골과 드릴 비트는 두개골의 바닥에 도달 할 때 중지합니다. 극세 포셉의 쌍을 사용하여, 경막을 노출시키기 위해 얇게 뼈를 제거한다. </li><li> 대상에 주사기 바늘은 위치그것은 경질에 닿을 때까지 바늘을 낮추고 Z 좌표 계산이 점을 사용합니다. 적당한 Z 위치에 도달 할 때까지 매우 느리게 뇌에 주사 바늘을 낮출. 이 프로토콜에서, 내측 전두엽 피질의 prelimbic 지역이나 지느러미 subiculum의 브레 그마하기 (-6.0 mm 전방 (브레 그마 2.7 mm 전방은, 중간 선 및 경막에서 -2.2 mm의 측면 0.5 mm를 ±), 측면 3.0 mm는 ± 중간 선 및 경질)에서 -2.0 mm로 성인 수컷 Sprague Dawley 쥐 (약 275g)의 대상으로합니다. </li><li> 0.1 μL / 분의 속도로 바이러스를 주입한다. 주입이 완료된 후에는 뇌 표면에 바이러스의 역류를 방지하기 위해 바늘을 인출하기 전에 10 분 동안 기다린다. </li><li> 피부를 봉인하고 상처에 항생제를 적용 부착 바늘로 꿰매는 봉합사를 사용합니다. </li><li> AAV 벡터에서 ChR2 및 NpHR 기능 발현의 시간 과정은 실험 설계 및 바이러스 역가에 따라 달라질 수 있습니다. 이 실험, 생체 </eM&gt; 녹음은 18-21일 포스트 분사를 실시 하였다. </li></ol> 3. 빛 배달 및 ChR2 또는 NpHR 발현하는 신경 세포의 생체 내 녹음 <ol><li> 최고 접착제를 사용하여 유리 모세관 튜브 (피셔 과학)에 텅스텐 전극 (~ 1.5 MΩ, MicroProbes)를 연결합니다. </li><li> 에탄올로 멀티 모드 광섬유 (200 ㎛ 직경의 코어 THORLABS) 깨끗한 섬유 팁의 맨 끝을 노출 섬유 벗기는 도구 (THORLABS)를 사용합니다. 아주 가볍게 쐐기 모양의 다이아몬드 나이프 (THORLABS)와 섬유 팁 점수를 조심스럽게 (미세 집게로 예를 들면) 초과 섬유를 제거합니다. 섬유는 점수에 쉽게 절단해야합니다. </li><li> 200 mW의 하나의 다이오드 레이저 (출력 포트의 PC 커넥터에 섬유의 FC의 끝을 연결 <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> 원하는 파장). 레이저 작업시 적절한 보호 안경을 항상 착용되어 있는지 확인합니다. </li><li> L을 측정광 파워 미터 (하여 광섬유의 끝 ASER 강도 <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">를 www.Lumiphy.com</a> ). 생체 녹음의 경우, 20 ~ 100 mW의 / ㎟ 한 작은 빛의 강도가 안정적으로 연결 활동의 각각 ChR2 또는 NpHR 매개 활성화 또는 침묵을 보여주고 있습니다. </li><li> 모세관에 광섬유를 삽입. 약 500 μm의 텅스텐 전극의 끝 위의 섬유 팁을 배치하고 전극과 섬유가 직선이되도록 끝 근처의 몇 가지 포인트에 두 번가는 봉합 실을 맨다. 전극의 끝과 가장 가까운 매듭 사이의 거리가 대상 영역에 삽입을위한 충분한 시간이 있는지 확인합니다. </li><li> 단계 2.1 이상 2.2에서와 같이 동물을 준비합니다. optrode (위치의 두개골에 새로운 깨끗한 작은 창을 만들기 위해 가이드로 초기 개두술을 사용 <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com을</a> ). D에 작은 절개를합니다우라는 미세 바늘을 사용. </li><li> 조심스럽게 미세 조작기 (Narishige)를 사용하여 형질 영역으로 두개골 창을 통해 뇌에 optrode을 낮 춥니 다. 그런 다음 빛에 반응 세포의 출현까지 10 ~ 50 μm의 단계에서 천천히 optrode를 진행. </li><li> 사용자 정의 소프트웨어 사용자 인터페이스 (NeuroLux 프로 <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> 의 LabVIEW (내쇼날 인스트루먼트)로 작성)은 하나의 다이오드 레이저를 제어하고 지속적인 신경 활동을 시각화하고 기록하는 데 사용됩니다. 녹음 된 신호를 필터링 ExAmp-20K (KATION 과학) 앰프의 대역 통과 (0.3-8 kHz에서), 디지털 보드 (NI의 USB-6009)에 대한 내쇼날 인스트루먼트의 아날로그로 촬영됩니다. NeuroLux 프로 사용자 인터페이스는 아날로그 입력의 선택 및 디지털 출력 (신경과 TTL 신호에 대한 두 개의 채널을 선택) 할 수 있습니다. 사용자는 샘플링 레이트 (20 KHZ), 기준 기간 (프리 라이트), 및 사후 점등 기간을 정의 할 수있다. 사용자는 TTL 레이저 stimulati를 정의 할 수도펄스 폭, 주파수와 자극 기간 (주파수가 20 Hz에서 자극 기간은 500 밀리 초입니다 경우, 정의 된 펄스 폭 (10) 레이저 펄스가 전달)에 대한 것입니다. 사용자는 또한 지속적으로 빛 배송을 선택 (예를 들어, 그림 1). 수 있습니다 반복 기록을 위해, 사용자는 또한 펄스 트레인의 개수 및 기차 간의 간격을 정의 할 수있다. 데이터 또는 디스크에 기록하지 않고 획득 할 수있다. </li><li> 기록 후, 동물을 케타민 / 자일 라진으로 마취 칵테일 것으로 transcardially optrode 배치 및 옵신 발현을 확인하기 위해서 생리 식염수 및 파라 포름 알데히드 (4 %)으로 관류. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299 (2007).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics in the nonhuman primate.</a> Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).</li><li>Zhao, S., Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2+/calmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li><li>McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+the+CNS.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).</li><li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+local+circuits+in+vivo:+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity.">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li><li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+optogenetic+silencing+of+orexin/hypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice.">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

기술의 다양한 설치류에서 분리 된 뇌 영역에 미생물 옵신 유전자를 유전자 표적으로 사용할 수 있습니다. 바이러스 성 유전자 전달은 세포 형 특이 ChR2 및 NpHR 표현을 매개 비교적 저렴​​하고 빠른 방법을 제공합니다. AAV 벡터 시스템은 스토리지, 병원성이 부족하고 장기 유전자 발현 (10)을 생산하는 능력을 유지하는 동안 안정적인 높은 생산 역가 때문에 optogenetic 실험에 사용하기위한 일반적인 선택이다. 세포 형 특이 적 프로모터와 옵신 구조의 대부분은 펜실베니아 대학 (벡터 핵심 시설에서 AAV 혈청 형의 다양한 상업적으로 사용할 수 있습니다 <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) 또는 대학 채플 힐의 노스 캐롤라이나 ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). AAV 기술에 대한 하나의 단점은셀 고유 타겟팅을 사용할 수있는 유전자 카세트 크기에 제한을 배치 한정된 장비 용량 (~ 4.7 KB). 대안으로,보다 큰 장비 용량 렌티 바이러스 벡터는, 큰 프로모터 서열의 제어하에 표적 옵신를 수용 할 수있다. optrode의 사용은 일시적으로 정밀한 빛의 전달과 함께 전기 생리학 신호의 신뢰성 감지 할 수 있습니다. 상술 한 바와 같이, 그러나, 충분한주의가 그 건설 필요하다. 절단 된 광섬유가 깨지기 때문에, 너무 단단히 봉합 실을 묶는 것은 섬유가 중단 될 수 있습니다. 전달 광의 전극과 품질의 임피던스가 저하되므로 optrode 여러 레코딩에 사용될 수 있지만, 전극과 광섬유 삽입 이전 세정 (또는 수동으로 광섬유 맨발 단부의 경우 절단)되어야 반복 사용과 함께. ELE 중ctrophysiological 녹음 그것은 optrode 서서히 전진하는 것이 중요하다. 여기에 사용 optrode 약 350 μm의 두께가 (텅스텐 전극 : 125 μm의, 광섬유의 코어 : 200 ㎛) 및 빨리 저하는 뇌 조직의 움직임으로 이어질 수 있습니다. 빛에 의한 유물은 특정 기록 및 광 전달 셋업 11-12로 간주 될 수 있습니다. 우리가 우리의 실험 조건에서 더 빛을 유도 유물을 발견하지만, 형질 뇌 영역 밖의 기록은 잠재적으로 빛 유물에 대한 제어로 사용할 수 있습니다. 기록 처리 중에 다른 고려 사항은, 특히 장기간 녹화 들면 ChR2 또는 NpHR-발현 뉴런의 변화를 관찰하기위한 필수의 광 강도이다. 강한 레이저 강도와 긴 레이저 조명은 조직 손상 및 / 또는 후속 전달 빛을 12-13로 감소 반응이 발생할 수 있습니다. 행동 실험을 위해서 컨트롤 바이러스 벡터의 사용은 eliminatin 필요G 섬유에서 전달되는 열에 의한 영향. 시판 optogenetic 구조의 많은 옵신 유전자 서열이 제거 된 상보 제어 구조가있다. 그것은 ChR2 특정 실험 질문에 14 ~ 15에 더 적합 할 수있는 다른 침묵 opsins과 함께 개발 된 향상된 특성 및 반응 속도와 변종 설계 주목해야한다. 예를 들어, 대상 돌연변이 유발을 통해 설립 된 새로운 ChR2 변종, &quot;Cheta은은&quot;원래 ChR2 14의 위의 (적어도 200 Hz에서 최대) 주파수에서 높은 충실도의 연결 스파이크를 구동 할 수있다라고합니다. 생체 내에서 빛의 전달 및 신경 반응의 동시 녹음의 조합은 유전자 표적 세포 집단과 해당 시간에 잠 행동 행사에 패턴 활동 사이의 인과 관계를 확립하는 중요한 단계입니다. 절차 및 하여기에 설명 rdware 설치류의 생체 내 머리 고정 녹음에 optogenetics을 구현하는 간단한 방법을 제공합니다.

시간적으로 정확한 방식으로 신경 회로 내의 특정 세포 유형을 활성화하거나 침묵하는 기능은 신경 회로가 감정과 인식의 기초가 서로 다른 유형의 정보를 처리하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 그대로 신경 활동을 통해 실험 제어는 제공하지 않습니다 loss-/gain-of-function 도구 (예를 들어, 전기 자극, 약물 변조, 병변)를 채용 한 하나 공간적 시간적 규모로, 뉴런의 특정 인구를 제어하기위한 선택적으로 필요합니다. 바로 이러한 기술적 과제를 해결, 유전자 인코딩 할 빛에 민감한 도구의 개발 및 응용 프로그램은 잘 정의 된 행동 이벤트 기간 동안 셀을 선택 유형의 전기 활동을 제어하는​​ 신경 과학자를 가능하게했다. 이 빛에 민감한 단백질의 대부분은 빛 게이트 양이온 채널, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, 및 광 기반 염화 펌프, halorhodop으로, 미생물 기원합니다죄 널리 사용 (NpHR) 2, 3,. optogenetics의 가장 큰 장점은 이종 뇌 영역에있는 유전자 표적 특정 세포 집단의 능력과 기술을 성공적으로 모델 생물의 수 (인간이 아닌 영장류에 무척추 동물) 4-6에 적용되었습니다. 많은 optogenetic 형질 전환 동물이 발생하고 7,8 상업적으로 사용할 수 있습니다, 그러나 설립 유전자 변형 라인은 노동 집약적이고 비용 금지 될 수 있습니다되었습니다. 여기서 우리는 재조합 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 벡터를 사용하여 쥐 prelimbic의 피질 및 subiculum의에서 CaMKIIα 프로모터에서 ChR2 및 NpHR 유전자의 바이러스 성 매개 납품을위한 프로토콜을 설명합니다. 전뇌 내 CaMKIIα 식 글루타메이트 피라미드 뉴런 9 배타적입니다. AAV는 일반적으로 인해 상대적으로 생산 및 병원성의 부족의 용이성뿐만 아니라, 기본적인 연구에 사용되는 강한 persi이 벡터 10 달성 한 스텐트 유전자 발현. 또한 우리는 마취 머리 고정 된 쥐에서 동시에 빛의 전달 및 기록하는 단계와 하드웨어를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Syringe </td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>10 &amp;mu;l</td></tr><tr><td>Removable Needle</td><td>Hamilton</td><td>7803-03</td><td>31 gauge, beveled tip</td></tr><tr><td>Microinjector Pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Pump Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Oil</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12728</td><td></td></tr><tr><td>Laser Protective Eyeware</td><td>Kentek</td><td>KMT-4501</td><td></td></tr><tr><td>Multimode Optical Fiber</td><td>Thorlabs</td><td>BFL37-200</td><td>200 &amp;mu;m diameter core, 0.37 NA</td></tr><tr><td>Fiber Stripping Tool</td><td>Thorlabs</td><td>T12S21</td><td>for 200 &amp;mu;m diameter core multimode fiber</td></tr><tr><td>Optical Power Meter</td><td>Lumiphy LLC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lumiphy.com/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;www.lumiphy.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Photodetector</td><td>Newport</td><td>818-SL/DB</td><td></td></tr><tr><td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td><td>Lumiphy LLC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lumiphy.com&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;www.lumiphy.com&lt;/a&gt;</td><td>coupled to a 200 &amp;mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td></tr><tr><td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td><td>Lumiphy LLC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lumiphy.com&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;www.lumiphy.com&lt;/a&gt;</td><td>coupled to a 200 &amp;mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td></tr><tr><td>Tungsten/Fiber Optrode</td><td>Lumiphy LLC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lumiphy.com/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;www.lumiphy.com&lt;/a&gt;</td><td>Lumitrode</td></tr><tr><td>Glass Capillary Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-566</td><td></td></tr><tr><td>Hydraulic Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MO-22</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Kation Scientific</td><td>ExAmp-20K</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquistion Device</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6009</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Head Restraint for Recording</td><td>Lumiphy LLC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lumiphy.com/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;www.lumiphy.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Small Animal Stereotaxic Unit</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 963</td><td></td></tr></tbody></table>

a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo

Optogenetic 방법은 종의 넓은 범위에 걸쳐 행동의 다양한 세트를 기본 신경 회로의 활동을 해명하기위한 강력한 도구로 등장했습니다. 미생물 유래의 Optogenetic 도구 (예를 들어, channelrhodopsin-2, ChR2) 또는 침묵 (예를 들어, halorhodopsin, NpHR) 행동으로 관련 척도에 신경 활동 ingenetically 정의 종류의 세포를 활성화 할 수있는 빛에 민감한 막 단백질로 구성되어 있습니다. 우리는 첫 번째 지느러미 subiculum의 쥐의 전두엽 피질의 prelimbic 지역에 ChR2 및 NpHR 도입 유전자의 아데노 - 관련 바이러스 매개 전달을위한 간단한 방법을 보여줍니다. ChR2 및 NpHR 유전자 타겟팅 할 수 있기 때문에, 우리는 높은 시간 정밀도로 이종 조직에 내장 신경 (즉, 피라미드 뉴런)의 특정 개체군의 전기적 활성도를 제어하기위한 본 기술의 사용을 설명한다. 우리는 여기에 하드웨어, 사용자 정의 소프트웨어 업데이트를 설명생체 준비 마취에서 유전자 변형 피라미드 뉴런에서 동시에 빛의 전달 및 전기 녹음 수 있도록 사용자 인터페이스 및 절차에 대해 설명합니다. 이러한 광 응답 툴 정보 처리 및 동작에 다른 세포 유형의 인과 포스팅을 식별하기위한 기회를 제공한다.

그림 1은 신경 세포 활동의 동시 녹음에 사용되는 빛의 펄스 파라미터 (즉, 펄스 주파수, 펄스 폭, 자극 기간)을 제어하는 사용자 정의 소프트웨어 LabVIEW 환경 개발 (프로 NeuroLux) (내쇼날 인스트루먼트)의 스크린 샷을 보여줍니다. 소프트웨어 프로그램은 하나의 다이오드 레이저에 대한 제어를위한 TTL 펄스를 생성하는 디지털 수집 장치에 명령 신호를 보낸다. 또한 소프트웨어 프로그램의 표시 및 저장 기록 된 신경 세포의 활동과 전달 TTL 신호. 이러한 신호는 정의 된 샘플 레이트 (예를 들어, 20 kHz에서)에서 수집 장치를 통해 디지털화된다. 기록 된 신호는 이진 파일의 2 차원 배정 밀도 배열로 저장됩니다. 그림 2는 광섬유에 부착 된 텅스텐 전극으로 구성된 사용자 지정 optrode을 보여줍니다. 광섬유는 3 번 경상 봉합 실을 사용한 전극에 고정되어있다포인트. 필요한 경우, 최고 접착제는 이들을 고착 할 수있다. 그러나, 전극이 섬유를 여러 번, 빛의 투과를 재사용 할 수 있지만, 반복 사용으로 분해하고 분해 및 청소하거나 뇌에 삽입 할 때마다 교체해야하기 때문에 영구적으로 전극에 광섬유를 고정하지 마십시오. 실제 ChR2 및 NpHR 식을 나타내는 강화 노란색 형광 단백질의 그림 3은 형광 이미지의 왼쪽 패널. 이 사진은 대표적인 쥐의 등쪽에서 subiculum의 NpHR 표현 (그림 3A)과 prelimbic 피질 ChR2 표현 (그림 3B)를 보여줍니다. 바이러스 성 표현 (예 : 일부 형광)이 왼쪽, 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 (그림 3A를 관찰) 등의 subiculum의 및 prelimbic 피질에 주로 제한되었다. 전극 (얇은 트랙, 화살표 머리)와 광섬유 (두꺼운 트랙, 화살표)의 트랙도 관찰되었다. 그림 4의 = &quot;jove_content&quot;&gt; 왼쪽 패널 ChR2가. 그림 4a는 prelimbic 쥐에 10 밀리 초 푸른 빛의 펄스의 20 Hz에서 전달에 대응 ChR2 트리거 활동 전위의 예를 추적합니다 쥐 prelimbic 피질에서 시간적으로 정확한 스파이크를 유도 것을 보여줍니다 피질. 래스터 플롯 (그림 4B)는 여섯 대표 뉴런 ChR2 유도 활성화를 보여줍니다. 모든 기록 된 신경 세포는 완벽한 충실도로 빛을 유발 급상승을 보였다. ChR2 달리, NpHR가 신속하고 가역적으로 쥐 prelimbic 피질 (그림 4의 오른쪽 패널)의 생체 내에서 자발적인 활동을 침묵.도 4c 보여주는 예제 추적입니다 아래 NpHR을 표현 prelimbic 피질의 연속 532 nm의 조명 (10 초) CaMKllα 프로모터는 생체 내에서 자연 단일 유닛 활동을 제거한다. prelimbic 피라미드 세포 활동의 완전한 침묵 시간 고정 10 초 연속 광 전달에 유의하십시오. 낮은어 래스터 플롯 (그림 4D)는 여섯 대표 뉴런 NpHR 유도 침묵을 보여줍니다. 모두 생체 내 기록은 미생물 옵신 유전자의 AAV - 중재 배달 18-21 일 이전에 발생한 성인 흰쥐에서 얻은 전형적인이다. 그림 5는 쥐 prelimbic 피라미드 신경 세포의 반복 ChR2 자극의 결과를 보여줍니다. 블루 라이트 펄스 (10 밀리 초)을 5 초 (100 펄스 총) 20 Hz에서 전달했다. 빛 유발 스파이크의 전압 추적 반복 2 시간의 녹음 세션 (61 회 반복 합계) 중 매일 2 분을 인수했다. 이 반복적 인 자극 프로토콜을 사용하는 경우에도, ChR2는 광 전달에 응답하여 안정적이고 강력한 스파이크를 유발. 도 6 및 7은 NpHR 유도 광 저해 및 래트 subicular 신경 활동의 ChR2 구동 photoactivation의 결과를 나타낸다. 경우 prelimbic 피질에서와 같이, NpHR 및 ChR2는 할 수 있었다빛에 의한 시간 고정 억제 및 재현성 옵신 형질 도입 subicular 신경 세포의 활성화를 중재. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> 그림 1. 동시에 빛의 전달 및 전기 생리학 녹음 NeuroLux Pro 소프트웨어 인터페이스의 스크린 샷. 사진은 추적 연속 532 nm의 빛 전달의 10 초에 대응 쥐 prelimbic 피라미드 세포의 자발적인 활동의 NpHR 유도 침묵을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> 그림 2. 사용자 정의 optrode의 고성능 이미지. 광섬유는 유리 모세관 텅스텐 전극에 부착되어 봉합 실을 사용한 전극에 고정 삽입된다. betw 중심 간 거리EEN 전극 팁 및 광섬유 팁은 약 500 μM이다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> 그림 3. 바이러스 성 표현과 optrode 배치. (왼쪽) 사진은 대표 지느러미 subiculum의에서 NpHR 식 (A)와 prelimbic 피질 (B)에 ChR2 표현을 보여줍니다. 각 사진이 촬영 된 위치를 나타냅니다 (오른쪽) 도식. 각 사진의 화살촉과 화살은 텅스텐 전극의 위치와 광섬유를 표시였다. SUB : subiculum의, DG : 치아 이랑 (dentate gyrus), PL :. prelimbic 피질의 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> 그림 4. ChR2 또는 NpHR 형질 도입 쥐 prelimb에서 생체 전기 생리학 기록IC 피질. (A) 블루 (473 NM) 광 펄스 (10 밀리 초, 파란색 막대)의 20 Hz에서 전달에 대응 ChR2 트리거 활동 전위의 예 추적. (B) 여섯 대표 뉴런에 ChR2 유도 스파이크를 보여 래스터 플롯. 각 유닛 활동은 점으로 꾸몄다. (C) 연속 녹색 (532 nm의) 빛 조명 (10 초, 녹색 막대) 동안 자발적인 활동의 NpHR 유도 억제의 예 추적. (D) 여섯 대표 뉴런에 NpHR 유도 침묵을 보여주는 래스터 플롯. 각 유닛 활동은 점으로 꾸몄다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> 그림 5. 생체 내에서 쥐 prelimbic 피라미드 신경 세포의 반복 20 Hz에서 ChR2 중심 급상승. (A) 라이트 유발 스파이크의 흔적을 전압은시점 0, 30, 60, 90에서 취득한, 레코딩의 시작 후 120 분. (B) 빛에 의한 활성화의 61 반복 (2 분 간 시험 간격, 120 분 합계)를 표시 래스터 플롯. 각 유닛 활동은 점으로 꾸몄다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> 그림 6. NpHR 형질 도입 쥐의 척수에서 subiculum의 생체 ​​전기 생리학 기록. (A) NpHR을 표현 지느러미 subiculum의 10 초 연속 532 nm의 조명 (녹색 막대가) 자발적인 활동을 제거 보여주는 예 추적. 위의 추적에서 두 개의 기록 된 단위 (B) 평균 파형. 진폭 임계 값은 두 개의 별개의 뉴런을 식별하는데 사용되었다. (C) 다섯 반복을 보여주는 래스터 플롯이러한 단위의 NpHR 유도 침묵의의. 각 유닛 활동은 점으로 꾸몄다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> 그림 7. 생체 내에서 쥐의 등쪽 subicular 신경 세포의 반복 20 Hz에서 CR2 중심 급상승. (A) 시점 0, 30 일에 획득 한 요동 치고 빛 유발의 흔적을 전압은 60, 90, 120 분 녹화 시작 후. 삽입 된이 세포의 전형적인 파열 활동. (B) 빛에 의한 활성화의 61 반복 (2 분 간 시험 간격, 120 분 합계)를 표시 래스터 플롯. 각 유닛 활동은 점으로 꾸몄다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, &quot;optogenetics&quot;라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

19.0K 조회수.  University of Colorado Boulder.  유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, "optogenetics"라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다. 

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Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

연구

신경과학

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

행동분석학

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

에 가이드<em&gt; 생체</emOptogenetically 확인 된 대뇌 피질의 억제의 interneurons에서&gt; 단일 단위 기록

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent improvements in methodologies and applications for the study of theta oscillations. A simple characterization of the isolated hippocampal preparation is presented whereby the relationship between internal hippocampal theta oscillators is examined together with the activity of pyramidal cells, and GABAergic interneurons, of the cornu ammonis-1 (CA1) and subiculum (SUB) areas. Overall, we show that the isolated hippocampus is capable of generating intrinsic theta oscillations in vitro and that rhythmicity generated within the hippocampus can be precisely manipulated by optogenetic stimulation of parvalbumin-positive (PV) interneurons. The in vitro isolated hippocampal preparation offers a unique opportunity to use simultaneous field and intracellular patch-clamp recordings from visually-identified neurons to better understand the mechanisms underlying theta rhythm generation.

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Here, we present a protocol for recording rhythmic neuronal network theta and gamma oscillations from an isolated whole hippocampal preparation. We describe the experimental steps from extraction of the hippocampus to details of field, unitary and whole-cell patch clamp recordings as well as optogenetic pacing of the theta rhythm.

Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝<em&gt; 체외에서</em&gt; : 격리 된 설치류 Septohippocampal Circuit에서 기록하는 방법론

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect distinct cellular and network components of these circuits remains unclear. Ex vivo brain slices provide a means by which investigators may probe discrete components of complex networks and disentangle potential mechanisms underlying the effects of volatile anesthetics on evoked responses. To isolate potential cell type- and pathway-specific drug effects in brain slices, investigators must be able to independently activate afferent fiber pathways, identify non-overlapping populations of cells, and apply volatile anesthetics to the tissue in aqueous solution. In this protocol, methods to measure optogenetically-evoked responses to two independent afferent pathways to neocortex in ex vivo brain slices are described. Extracellular responses are recorded to assay network activity and targeted whole-cell patch clamp recordings are conducted in somatostatin- and parvalbumin-positive interneurons. Delivery of physiologically relevant concentrations of isoflurane via artificial cerebral spinal fluid to modulate cellular and network responses is described.

Ex vivo brain slices can be used to study the effects of volatile anesthetics on evoked responses to afferent inputs. Optogenetics are employed to independently activate thalamocortical and corticocortical afferents to non-primary neocortex, and synaptic and network responses are modulated with isoflurane.

뇌 조각에서 구 심성 경로의 광유전 적 활성화 및 휘발성 마취제에 의한 반응의 조절

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. Traditional in vitro electrophysiological techniques use electrical stimulation to evoke synaptic transmission. A major drawback of this method is its nonspecific nature; all axons in the region of the stimulating electrode will be activated, making it difficult to attribute an effect to a particular afferent connection. This issue can be overcome by replacing electrical stimulation with optogenetic-based stimulation. We describe a method for combining optogenetics with in vitro patch-clamp recordings. This is a powerful tool for the study of both basal synaptic transmission and synaptic plasticity of precise anatomically defined synaptic connections and is applicable to almost any pathway in the brain. Here, we describe the preparation and handling of a viral vector encoding channelrhodopsin protein for surgical injection into a pre-synaptic region of interest (medial prefrontal cortex) in the rodent brain and making of acute slices of downstream target regions (lateral entorhinal cortex). A detailed procedure for combining patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study short- and long-term synaptic plasticity is also presented. We discuss examples of experiments that achieve pathway- and cell-specificity by combining optogenetics and Cre-dependent cell labeling. Finally, histological confirmation of the pre-synaptic region of interest is described along with biocytin labeling of the post-synaptic cell, to allow further identification of the precise location and cell type.

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Here we present a protocol describing viral transduction of discrete brain regions with optogenetic constructs to permit synapse-specific electrophysiological characterization in acute rodent brain slices.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

Fine motor skills are essential in everyday life and can be compromised in several nervous system disorders. The acquisition and performance of these tasks require sensory-motor integration and involve precise control of bilateral brain circuits. Implementing unimanual behavioral paradigms in animal models will improve the understanding of the contribution of brain structures, like the striatum, to complex motor behavior as it allows manipulation and recording of neural activity of specific nuclei in control conditions and disease during the performance of the task. 
Since its creation, optogenetics has been a dominant tool for interrogating the brain by enabling selective and targeted activation or inhibition of neuronal populations. The combination of optogenetics with behavioral assays sheds light on the underlying mechanisms of specific brain functions. Wireless head-mounted systems with miniaturized light-emitting diodes (LEDs) allow remote optogenetic control in an entirely free-moving animal. This avoids the limitations of a wired system being less restrictive for animals' behavior without compromising light emission efficiency. The current protocol combines a wireless optogenetics approach with high-speed videography in a unimanual dexterity task to dissect the contribution of specific neuronal populations to fine motor behavior.

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

The present protocol describes how to use wireless optogenetics combined with high-speed videography in a single pellet reach-to-grasp task to characterize the neural circuits involved in the performance of skilled motor behavior in freely moving mice.

생체 내 숙련 된 운동 행동의 무선 광유전학 제어

Fine motor skills are essential in everyday life and can be compromised in several nervous system disorders. The acquisition and performance of these ...

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는 방법

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

에 가이드

Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

뇌 조각에서 구 심성 경로의 광유전 적 활성화 및 휘발성 마취제에 의한 반응의 조절

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

생체 내 숙련 된 운동 행동의 무선 광유전학 제어

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법

요약

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특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

에 가이드

Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

뇌 조각에서 구 심성 경로의 광유전 적 활성화 및 휘발성 마취제에 의한 반응의 조절

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

생체 내 숙련 된 운동 행동의 무선 광유전학 제어

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는 방법