وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني لتعاطي المخدرات (النداء) منحة R01 DA24040 (DCC)، جامعة كولورادو مبتكرة غرانت البذور (DCC)، والنداء منحة التدريب T32 DA017637 (MVB).

1. فيروس التخزين والتحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمت الموافقة على استخدام ناقلات AAV النسخ المتماثل غير كفء لتقديم الجينات أوبسين إلى الدماغ القوارض للسلامة الأحيائية المستوى 1 (BSL-1) ويتطلب الحماية المناسبة وإجراءات التعامل مع النحو المبين في المنشور حكومة الولايات المتحدة، سلامة الأحيائية في علم الأحياء الدقيقة والمختبرات الطبية الحيوية، وهي متاحة على مراكز السيطرة على الأمراض في الموقع في ( <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل تجنب تكرار تجميد أذاب دورات، وفيروس ماصة من القارورة المصنعة في العمل مأخوذة أصغر في الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الحقن المجسم، تسمح قسامة لذوبان الجليد على الجليد وتدور لفترة وجيزة ثم إلى أسفل مع جهاز للطرد المركزي أعلى مقاعد البدلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الردم ببطء حقنة هاميلتون الزجاج وإبرة مع كمية صغيرة من السيليكون أو الزيوت المعدنية.تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء مرئية في برميل حقنة. إدراج حقنة في مضخة microinjector وإرفاق مضخة مباشرة إلى الذراع التجسيمي العمودي (أي تتلاعب التجسيمي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض الذراع التجسيمي حتى غيض من إبرة تلامس قاع الأنبوب قسامة الفيروس. استخدام وحدة تحكم لمضخة microinjector لسحب حجم المطلوب من فيروس (1.5 ميكرولتر لحقن 1 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب تطهير جميع المواد والأسطح التي تتلامس مع الفيروس مع مطهر مثل الكلور (10٪). </li></ol> 2. الجراحة وحقن الفيروسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوانات مع الكيتامين (الجرذ، 125 ملغ / كغ، والملكية الفكرية) - زيلازين (الفئران، و 10 مغ / كغ، والملكية الفكرية) كوكتيل. لقياس فعالية التخدير، وتحقق من وجود استجابة منعكس لقرصة أخمص قدميها، وإعطاء جرعات تكميلية من الكيتامين إذا لزم الأمر. باستخدام الطرق الجراحية العقيم القياسية، وضع الحيوان في جهاز التجسيمي (ديفيد كوبف فياألدوات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق خط الوسط من خلال الجلد في أعلى الجمجمة الحيوان مع مقص جراحي صغير أو مشرط. فصل بلطف النسيج الضام وتنظيف الجزء العلوي من الجمجمة مع مكشطة العظام الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من أن رأس الحيوان هو مستوى بحيث ض إحداثيات bregma وامدا على قدم المساواة. تحديد الإحداثيات التجسيمي للمنطقة الدماغ الهدف من أطلس الدماغ مثل الجرذ الدماغ في التجسيمي الاحداثيات (جورج Paxinos وتشارلز واطسون، الصحافة الأكاديمية، 2007) أو الماوس الدماغ في التجسيمي الاحداثيات (كيث BJ فرانكلين وجورج Paxinos، مطبعة الأكاديمية ، 2007). بمناسبة موقع المقصود من حقن بالقلم الجراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رقيقة بعناية الجمجمة فوق المنطقة المستهدفة باستخدام الحفر باليد ووقف عندما يصل لقمة الحفر أسفل الجمجمة. باستخدام زوج من ملقط غرامة اضافية، وإزالة العظام ضعيفة من أجل فضح الجافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إبرة الحقنة أكثر من هدف ولوخفض الإبرة حتى يلمس الجافية واستخدام هذه النقطة لحساب ض تنسيق. خفض ببطء شديد إبرة الحقن في المخ حتى يتم الوصول إلى موقف ض السليم. في هذا البروتوكول، ومنطقة الحوف من قشرة الفص الجبهي الأنسي (2.7 ملم الأمامي إلى bregma، ± 0.5 مم الوحشي على خط الوسط، و-2.2 ملم من الجافية) أو مرفد الظهرية (-6.0 ملم الأمامي إلى bregma، ± 3.0 مم الوحشي إلى خط الوسط، و-2.0 ملم من الجافية) ويستهدف في الكبار سبراغ داولي الفئران الذكور (حوالي 275 غرام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الفيروس بمعدل 0.1 ميكرولتر / دقيقة. بعد الانتهاء من حقن الانتظار 10 دقيقة قبل سحب الإبرة لتجنب ارتجاعي الفيروس على سطح الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إبرة خياطة الخياطة مع المرفقة لختم الجلد وتطبيق المضادات الحيوية على الجرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبطبيعة الحال سوف وقت ChR2 وNpHR التعبير وظيفية من ناقلات AAV تختلف اعتمادا على التصميم التجريبي وعيار الفيروسية. لهذه التجربة، في الجسم الحي </eأجريت م&gt; تسجيلات حقن 18-21 يوما آخر. </li></ol> 3. توصيل الضوء وتسجيل في الجسم الحي من ChR2 أو الخلايا العصبية، معربا عن NpHR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق القطب التنغستن (~ 1-1.5 MΩ، مجهرية) إلى أنبوب زجاجي الشعرية (فيشر العلمية) باستخدام الغراء عظمى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الألياف تجريد أداة (Thorlabs) لفضح نهاية العارية من الألياف متعددة البصرية (200 ميكرون قطر الأساسية، Thorlabs) والألياف نظيفة طرف مع الايثانول. يسجل طفيفة جدا الألياف طرف مع اسفين على شكل سكين الماس (Thorlabs) وإزالة بعناية الألياف الزائدة (على سبيل المثال مع ملقط غرامة). الألياف يجب أن يلتصق بسهولة في النتيجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الطرف FC من الألياف إلى موصل الكمبيوتر على منفذ إخراج 200 ميغاواط ليزر ديود واحد ( <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) مع الطول الموجي المطلوب. تأكد من أن يلبس النظارات الواقية المناسبة في جميع الأوقات عند التعامل مع أجهزة الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس لتركثافة في عسير غيض من الألياف البصرية باستخدام السلطة متر الضوئية ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). لفي الجسم الحي تسجيلات، يمكن أن شدة الضوء أقل قدر 20-100 ميغاواط / مم 2 استحضار موثوق ChR2 أو تفعيل NpHR بوساطة أو إسكات، على التوالي، من نشاط الخلايا العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الألياف الضوئية في أنبوب شعري. موقف الطرف الألياف حوالي 500 ميكرون أعلاه غيض من التنغستن القطب وربط خيوط الجروح رقيقة مرتين في بضع نقاط بالقرب من الطرف بحيث القطب والألياف هي على التوالي. تأكد من أن المسافة بين غيض من القطب وأقرب عقدة طويلة بما فيه الكفاية لالإدراج إلى المنطقة المستهدفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحيوان كما في الخطوات 2.1 و 2.2 أعلاه. استخدام حج القحف الأولية كدليل لجعل نافذة صغيرة نظيفة جديدة في الجمجمة لتحديد المواقع optrode ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). إجراء شق صغير في دأورا باستخدام إبرة رفيعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض بعناية optrode من خلال نافذة الجمجمة والى الدماغ إلى المنطقة transduced باستخدام مياداة مجهرية (Narishige). ثم دفع optrode ببطء في 10-50 ميكرومتر الخطوات حتى ظهور خلية ضوئية استجابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واجهة المستخدم البرمجيات المخصصة (NeuroLux برو <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> يستخدم) مكتوبة في ابفيف (الصكوك الوطنية) للسيطرة على ليزر ديود واحد وتصور وتسجيل النشاط العصبي المستمر. يتم التقاط الإشارات المسجلة مع أمثل-20K (Kation العلمي) مكبر للصوت الفرقة تمرير تصفيتها (0،3-8 كيلو هرتز)، والتناظرية الصكوك الوطنية إلى مجلس الرقمية (NI USB-6009). وNeuroLux برو واجهة المستخدم يسمح اختيار مدخلات تناظرية (اختيار قناتين للإشارة العصبية وTTL) والإخراج الرقمي. قد تحدد للمستخدم معدل أخذ العينات (20 كيلو هرتز)، وفترة الأساس (ما قبل الضوء)، وفترة ما بعد الضوء. يمكن للمستخدم تحديد stimulati الليزر TTLعلى عرض النبضة، وتواتر ومدة التحفيز (إذا كان التردد هو 20 هرتز والتحفيز الفترة هو 500 ميللي ثانية، يتم تسليم 10 نبضات الليزر مع عرض النبضة محددة). كما يمكن للمستخدم اختيار التسليم ضوء مستمر (على سبيل المثال، الشكل 1). للحصول على تسجيلات المتكررة، المستخدم أيضا قد تحديد عدد القطارات النبض والفترة الفاصلة بين القطارات. يمكن الحصول على البيانات مع أو بدون تسجيل إلى القرص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التسجيل، يتم تخدير الحيوانات مع كوكتيل الكيتامين / زيلازين وperfused transcardially مع المالحة الفسيولوجية وبارافورمالدهيد (4٪) وذلك للتحقق من وضع optrode وأوبسين التعبير. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299 (2007).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics in the nonhuman primate.</a> Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).</li><li>Zhao, S., Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2+/calmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li><li>McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+the+CNS.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).</li><li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+local+circuits+in+vivo:+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity.">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li><li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+optogenetic+silencing+of+orexin/hypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice.">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

تتوفر لراثيا استهداف الجينات الميكروبية أوبسين إلى مناطق الدماغ منفصلة في القوارض وهناك مجموعة واسعة من التقنيات. يوفر توصيل الجينات الفيروسية نهج غير مكلفة نسبيا وسريعة للوساطة ChR2 وNpHR التعبير مع خلية من نوع خصوصية. نظم ناقلات AAV هي خيار مشترك للاستخدام في التجارب optogenetic بسبب التتر الإنتاج العالية التي تبقى مستقرة أثناء التخزين، افتقارها إلى المرضية، وقدرتها على إنتاج طويلة الأجل التعبير الجيني 10. العديد من بنيات أوبسين مع المروجين محددة الخلايا من نوع المتاحة تجاريا في مجموعة متنوعة من الأنماط المصلية AAV من المرافق الأساسية مثل ناقلات جامعة بنسلفانيا ( <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) أو جامعة من ولاية كارولينا الشمالية في تشابل هيل ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). عيب واحد لتكنولوجيا AAV هوقدرة محدودة التعبئة والتغليف (~ 4.7 كيلو بايت)، الأمر الذي يضع قيدا على حجم الكاسيت التحوير التي يمكن استخدامها لاستهداف خلية محددة. كبديل، ناقلات lentiviral، والتي لديها قدرة أكبر التعبئة والتغليف، هي قادرة على استيعاب أوبسين تستهدف تحت سيطرة تسلسل المروج أكبر. استخدام وسيلة optrode يسمح للكشف عن الإشارات الكهربية يمكن الاعتماد عليها في تركيبة مع تسليم ضوء زمنيا الدقة. كما هو موضح أعلاه، ومع ذلك، هناك حاجة إلى رعاية كافية في بنائه. منذ الألياف البصرية المشقوق لا يزال هشا، وربط خيوط الجروح بإحكام شديد قد يتسبب في الألياف للكسر. على الرغم من أن optrode يمكن استخدامها للحصول على تسجيلات متعددة، يجب تنظيف القطب والألياف البصرية (أو يدويا المشقوق في حالة نهاية العارية الألياف البصرية) قبل الإدراج لأن مقاومة من القطب ونوعية الضوء تسليمها سوف تتحلل مع الاستخدام المتكرر. خلال ايلىتسجيلات ctrophysiological من المهم أن تكون متقدمة optrode ببطء. وoptrode المستخدمة هنا ما يقرب من 350 ميكرون سمك (التنغستن القطب: 125 ميكرومتر؛ الأساسية للألياف البصرية: 200 ميكرون) وخفض ذلك بسرعة قد يؤدي إلى حركة أنسجة المخ. كما يمكن اعتبار القطع الأثرية التي يسببها الضوء، مع تسجيل خاص وتسليم ضوء مجموعة عمليات 11-12. على الرغم من أن لم نجد أي قطعة أثرية الناجم عن ضوء في حالة تجريبية لدينا، والتسجيلات خارج منطقة الدماغ transduced يمكن أن تستخدم كجهاز تحكم عن التحف الخفيفة. اعتبار آخر أثناء عملية التسجيل هو شدة الضوء اللازمة لمراقبة التغيرات في ChR2 أو NpHR، معربا عن الخلايا العصبية، وخاصة بالنسبة للتسجيلات مدة طويلة. قوية كثافة الليزر والإضاءة الليزر طويلة يمكن أن يؤدي إلى تلف الأنسجة و / أو استجابة لاحقة انخفض ضوء تسليمها 12-13. للتجريب السلوكية مطلوب استخدام ناقل فيروسي التحكم عن eliminatinز أي تأثير بسبب الحرارة تسليمها من الألياف. بالنسبة للعديد من بنيات optogenetic المتاحة تجاريا هناك ثوابت تحكم التكميلية التي تمت إزالة التسلسل الجيني أوبسين. تجدر الإشارة إلى أن المهندسة ChR2 المتغيرات مع تحسين خصائص وحركية وضعت جنبا إلى جنب مع opsins إسكات الأخرى التي قد تكون أكثر ملاءمة لبعض الأسئلة التجريبية 14-15. على سبيل المثال، وهو البديل ChR2 الجديدة التي أنشئت عن طريق الطفرات المستهدفة، ووصف &quot;ChETA&quot;، يمكن أن تدفع عالية الدقة ارتفاعه العصبية بترددات (حتى لا يقل عن 200 هرتز) أعلاه أن من ChR2 الأصلي 14. مزيج من الضوء في الجسم الحي تسليم وتسجيل وقت واحد من الاستجابات العصبية هو خطوة حاسمة في إقامة علاقات سببية بين النشاط منقوشة في السكان الخلية المستهدفة وراثيا والأحداث السلوكية المقابلة غير الساحلية الوقت. الإجراءات وهاrdware المذكورة هنا توفير نهج واضحة لتنفيذ optogenetics لفي الجسم الحي تسجيلات الثابتة الرأس في القوارض.

القدرة على تفعيل أو إسكات نوع خلية معينة داخل الدوائر العصبية بطريقة دقيقة زمنيا هو أمر حاسم لفهم كيفية معالجة الدوائر العصبية أنواع مختلفة من المعلومات الكامنة العاطفة والإدراك. السيطرة التجريبية على النشاط العصبي سليمة وقد استخدمت أدوات loss-/gain-of-function (على سبيل المثال، التحفيز الكهربائي والتشكيل الدوائية، الآفة) التي لا توفر المطلوب انتقائي للسيطرة على فئات معينة من السكان من الخلايا العصبية، إما على نطاق والزمانية أو المكانية. معالجة هذه التحديات التكنولوجية مباشرة، وقد مكن تطوير وتطبيق أدوات حساسة للضوء وراثيا encodable علماء الأعصاب للسيطرة على النشاط الكهربائي من أنواع الخلايا حدد خلال الأحداث السلوكية واضحة المعالم. العديد من هذه البروتينات الحساسة للضوء هي من أصل الميكروبية، مع قناة بوابات ضوء الموجبة، channelrhodopsin-2 (ChR2) 1، ومدفوعة ضوء مضخة كلوريد، halorhodopالخطيئة (NpHR) 2،3، في الاستخدام واسع النطاق. والميزة الرئيسية لoptogenetics هو القدرة على السكان الخلية وراثيا هدف محدد في مناطق الدماغ غير متجانسة ولقد تم تطبيق هذه التقنية بنجاح لعدد من الكائنات نموذج (اللافقاريات إلى الرئيسيات غير البشرية) 4-6. وقد ولدت كثير من الحيوانات المعدلة وراثيا optogenetic ومتاحة تجاريا 7،8، ولكن يمكن إنشاء خطوط المعدلة وراثيا تكون كثيفة العمالة وباهظة التكلفة. نحن هنا وصف بروتوكول للتوسط فيروسي التسليم من ChR2 وNpHR الجينات تحت المروج CaMKIIα في الفئران الحوف القشرة الظهرية ومرفد باستخدام الغدة المرتبطة المؤتلف الفيروس (AAV) المتجه. داخل الدماغ الأمامي، CaMKIIα التعبير هي حصرية لالخلايا العصبية الهرمية الجلوتاميرجي 9. ويستخدم عادة لAAV البحوث الأساسية بسبب السهولة النسبية لإنتاجه وعدم المرضية، وكذلك قوي وPERSIالدعامة التعبير التحوير الذي تم تحقيقه مع هذه النواقل 10. بالإضافة إلى ذلك نحن الخطوط العريضة للخطوات والأجهزة للتسليم الضوء في وقت واحد وتسجيل في الفئران الثابتة الرأس تخدير.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe </td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Removable Needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-03</td>
 <td>31 gauge, beveled tip</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microinjector Pump</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>UMP3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pump Controller</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-MICRO4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone Oil</td>
 <td>Alfa Aesar</td>
 <td>A12728</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser Protective Eyeware</td>
 <td>Kentek </td>
 <td>KMT-4501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Optical Fiber</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>BFL37-200</td>
 <td>200 &mu;m diameter core, 0.37 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber Stripping Tool</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>T12S21</td>
 <td>for 200 &mu;m diameter core multimode fiber</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Power Meter</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Photodetector</td>
 <td>Newport</td>
 <td>818-SL/DB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tungsten/Fiber Optrode</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>Lumitrode</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Capillary Tube</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-362-566</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydraulic Micromanipulator</td>
 <td>Narishige</td>
 <td>MO-22</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Kation Scientific</td>
 <td>ExAmp-20K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquistion Device</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>NI USB-6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rodent Head Restraint for Recording</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic Unit</td>
 <td>David Kopf Instruments</td>
 <td>Model 963</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo

ظهرت أساليب Optogenetic كأداة قوية لتوضيح النشاط العصبي الدائرة الكامنة مجموعة متنوعة من السلوكيات عبر مجموعة واسعة من الأنواع. تتكون أدوات Optogenetic المنشأ الميكروبية للبروتينات غشاء الحساسة للضوء التي هي قادرة على تفعيل (على سبيل المثال، channelrhodopsin-2، ChR2) أو الصمت (على سبيل المثال، halorhodopsin، NpHR) النشاط العصبي أنواع الخلايا المحددة ingenetically الإفراط في الجداول الزمنية سلوكيا ذات الصلة. علينا أن نبرهن أولا مقاربة بسيطة للتسليم بوساطة فيروس الغدة المرتبطة من ChR2 وNpHR الجينات المحورة إلى مرفد الظهرية ومنطقة الحوف من قشرة الفص الجبهي في الفئران. لأن ChR2 وNpHR هي للاستهداف وراثيا، نحن تصف استخدام هذه التكنولوجيا لمراقبة النشاط الكهربائي للسكان محددة من الخلايا العصبية (أي الخلايا العصبية الهرمية) جزءا لا يتجزأ من نسيج غير متجانس مع دقة زمنية عالية. وصفنا هنا الأجهزة والبرامج المخصصةواجهة المستخدم، والإجراءات التي تسمح للتسليم في وقت واحد وتسجيل الضوء الكهربائية من الخلايا العصبية الهرمية transduced في تخدير في إعداد الجسم الحي. توفر هذه الأدوات للضوء استجابة الفرصة لتحديد المساهمات السببية من أنواع مختلفة من الخلايا لمعالجة المعلومات والسلوك.

الشكل 1 يصور لقطة من البرنامج (NeuroLux برو) وضعت في بيئة ابفيف (الصكوك الوطنية) مخصصة تستخدم لتسجيل نشاط الخلايا العصبية في وقت واحد والتحكم المعلمات ضوء نبض (أي تردد النبض، وعرض النبضة، وفترة التحفيز). يرسل برنامج حاسوبي إشارة الأوامر لجهاز اكتساب الرقمية التي تولد نبضات TTL للسيطرة على الصمام الثنائي ليزر واحد. بالإضافة إلى ذلك يعرض برنامج البرنامج ويخزن نشاط الخلايا العصبية المسجلة وإشارات TTL تسليمها. يتم ترقيم هذه الإشارات من خلال جهاز اكتساب بمعدل عينة محددة (على سبيل المثال، 20 كيلو هرتز). يتم حفظ الإشارات كما سجلت مجموعة ومزدوجة الدقة ثنائية الأبعاد في ملف ثنائي. ويبين الشكل 2 optrode مخصصة تتكون من القطب التنغستن تعلق على الألياف البصرية. يتم إصلاح الألياف البصرية إلى القطب باستخدام رقيقة خيوط الجروح في ثلاثة<html> نقطة. إذا لزم الأمر، الغراء عظمى يمكن استخدامها على الانضمام لهم. ومع ذلك، وتجنب التلاعب في نتائج دائمة الألياف البصرية إلى أنه على الرغم من القطب الكهربائي يمكن إعادة استخدامها عدة مرات، نقل الضوء عبر الألياف سوف تتحلل مع الاستخدام المتكرر، وينبغي المشقوق وتنظيفها أو استبدالها مع كل الإدراج في الدماغ. لوحات تبقى من الشكل 3 تظهر الصور الفلورسنت المعززة بروتين فلوري الصفراء، مما يدل ChR2 الفعلية وNpHR التعبير. تظهر هذه الصور التعبير NpHR ممثل في الفئران الظهرية مرفد (الشكل 3A) وChR2 التعبير في القشرة الحوف (الشكل 3B). اقتصر التعبير الفيروسية في معظمها إلى مرفد الظهرية والقشرة الحوف (على سبيل المثال لوحظ بعض مضان في التلفيف المسنن (الشكل 3A، يسار)). وقد لوحظت أيضا مسارات القطب (المسار رقيقة، ورأس السهم) والألياف البصرية (المسار سميكة، والسهم). ويبين ق = &quot;jove_content&quot;&gt; اليسار لوحة من الشكل 4 أن ChR2 يسببها ارتفاعه دقيقة زمنيا في الفئران القشرة الحوف. الشكل 4A هو تتبع سبيل المثال من إمكانات العمل أثار ChR2 في استجابة لتسليم 20 هرتز من 10 ميللي ثانية البقول الضوء الأزرق على الفئران الحوف القشرة. النقطية مؤامرة (الشكل 4B) يبين تفعيل ChR2 التي يسببها الخلايا العصبية في ستة ممثل. أظهر جميع الخلايا العصبية سجلت ارتفاعه أثار ضوء مع الإخلاص الكمال. وعلى النقيض من ChR2، NpHR بسرعة وإسكات عكسية النشاط العفوي في الجسم الحي في الفئران الحوف القشرة (يمين لوحة من الشكل 4). الشكل 4C هو التتبع المستمر سبيل المثال تبين أن 532 نانومتر الإضاءة (10 ثانية) من القشرة الحوف معربا عن NpHR تحت CaMKllα المروج يلغي عفوية النشاط وحدة واحدة في الجسم الحي. لاحظ أن إسكات كاملة من الحوف نشاط الخلايا الهرمية هو 10 ثانية تسليم ضوء مستمر غير الساحلية الوقت. منخفضإيه النقطية مؤامرة (الشكل 4D) يظهر إسكات NpHR التي يسببها الخلايا العصبية في ستة ممثل. سواء في الجسم الحي تسجيلات هي نموذجية من تلك التي حصلنا عليها من الكبار الفئران سبراغ داولي الذي التسليم بوساطة الجينات AAV أوبسين الميكروبية وقعت 18-21 يوما قبل. ويبين الشكل (5) ونتيجة لتكرار التحفيز ChR2 من الحوف الفئران الهرمي الخلايا العصبية. تم تسليم نبض الضوء الأزرق (10 ميللي ثانية) في 20 هرتز لمدة 5 ثوانى (المجموع 100 البقول). تم الحصول عليها آثار التيار الكهربائي من ضوء ارتفاعه أثار مرارا كل 2 دقيقة خلال جلسة تسجيل 2 ساعة (المجموع 61 التكرار). حتى عند استخدام هذا البروتوكول التحفيز المتكررة، ChR2 يسببها ارتفاعه مستقرة وقوية ردا على إيصال الضوء. أرقام 6 و 7 تظهر نتائج photoinhibition NpHR التي يسببها وتنشيط ضوئي ChR2 يحركها من الفئران مرفدي نشاط الخلايا العصبية. كما هو الحال في القشرة الحوف، كانت NpHR وChR2 قادرة علىتوسط في تثبيط الناجم عن الضوء غير الساحلية الوقت وتفعيل الخلايا العصبية transduced أوبسين مرفدي مع استنساخ عالية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> الشكل 1. قطة من NeuroLux واجهة البرنامج برو للتسليم في وقت واحد وعلى ضوء تسجيل الكهربية. يظهر أثر في الصورة إسكات NpHR الناجم عن النشاط العفوي من الفئران الخلايا الهرمية الحوف ردا على 10 ثانية من 532 المستمر تسليم ضوء نانومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> الشكل 2. صورة طاقة عالية من optrode مخصصة. يتم إدخال الألياف البصرية في أنبوب زجاجي الشعرية تعلق على القطب التنغستن والثابتة إلى القطب باستخدام خيوط الجروح. المسافة إلى مركز مركز betwالتابعين طرف القطب وغيض من الألياف هو ما يقرب من 500 ميكرون. <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> الرقم 3. التعبير الفيروسية والتنسيب optrode. تظهر (يسار) صور التعبير NpHR ممثل في ظهري مرفد (A) وChR2 التعبير في القشرة الحوف (B). (يمين) التخطيطي الذي يمثل الموقع حيث تم أخذ كل صورة. رأس السهم والسهم في كل صورة تشير إلى موقع القطب التنغستن والألياف البصرية، على التوالي. SUB: مرفد، DG: التلفيف المسنن، PL: القشرة الحوف <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> الشكل 4. في الجسم الحي التسجيلات الكهربية من ChR2 أو NpHR transduced-prelimb الفئرانجيم القشرة. (A) مثال التتبع من إمكانات العمل أثار ChR2 في استجابة لتسليم 20 هرتز من اللون الأزرق (473 نانومتر) نبضات الضوء (10 ميللي ثانية، الشريط الأزرق). (B) مؤامرة النقطية تظهر ارتفاعه ChR2 التي يسببها الخلايا العصبية في ستة ممثل. يتم رسم كل نشاط الوحدة باعتبارها نقطة. (C) مثال أثر لقمع NpHR التي يسببها النشاط العفوي خلال أخضر مستمر (532 نانومتر) إضاءة الضوء (10 ثانية، شريط أخضر). (D) مؤامرة النقطية تظهر إسكات NpHR التي يسببها الخلايا العصبية في ستة ممثل. يتم رسم كل نشاط الوحدة باعتبارها نقطة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> الرقم 5. ارتفاعه 20 هرتز المتكررة ChR2 يحركها من الخلايا العصبية الهرمية الحوف الفئران في الجسم الحي. (A) الجهد آثار ارتفاعه أثار الخفيفحصلت في نقاط زمنية 0، 30، 60، 90، 120 دقيقة بعد بداية التسجيلات. (B) مؤامرة النقطية تظهر جميع التكرار 61 (2 دقيقة الفاصل الزمني بين المحاكمة، و 120 دقيقة الكل) من التنشيط التي يسببها الضوء. يتم رسم كل نشاط الوحدة باعتبارها نقطة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الرقم 6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> الرقم 6. في الجسم الحي التسجيلات الكهربية من NpHR transduced الفئران الظهرية مرفد. (A) مثال التتبع تبين أن 10 ثانية المستمر الإضاءة 532 نانومتر (الشريط الأخضر) من مرفد الظهرية معربا عن NpHR يلغي النشاط العفوي. (ب) متوسط ​​الطول الموجي من الوحدتين المسجلة من التتبع أعلاه. تم استخدام عتبة السعة لتحديد اثنين من الخلايا العصبية متميزة. (C) مؤامرة النقطية تظهر خمسة التكرارق من إسكات NpHR التي يسببها لهذه الوحدات. يتم رسم كل نشاط الوحدة باعتبارها نقطة. <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> الرقم 7. 20 هرتز المتكررة يحركها CR2 ارتفاعه من الفئران الظهرية مرفدي الخلايا العصبية في الجسم الحي. (A) الجهد آثار ضوء أثار ارتفاعه المكتسبة في نقاط زمنية 0، 30، 60، 90، 120 دقيقة بعد بداية التسجيلات. أقحم: النشاط انفجار نموذجية من هذه الخلية. (B) مؤامرة النقطية تظهر جميع التكرار 61 (2 دقيقة الفاصل الزمني بين المحاكمة، و 120 دقيقة الكل) من التنشيط التي يسببها الضوء. يتم رسم كل نشاط الوحدة باعتبارها نقطة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> .

Watch this Scientific Journal Video about A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo at JoVE.com

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

التطور الأخير من الأدوات التي تجمع بين علم الأعصاب وعلم الوراثة وعلم البصريات، ووصف &quot;optogenetics&quot;، وتمكن من السيطرة على النشاط الدوائر العصبية مع مستوى غير مسبوق من القرار المكانية والزمانية. هنا نقدم بروتوكول للدمج في تسجيل المجراة مع التلاعب optogenetic من مجموعات فرعية محددة وراثيا من الخلايا العصبية الهرمية الفص الجبهي القشرية ومرفدي.

وهناك طريقة للتحكم عالي الدقة Optogenetic من الخلايا العصبية الفردية الهرمية<em&gt; في الجسم الحي</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

a-method-for-high-fidelity-optogenetic-control-individual-pyramidal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

18.9K Views.  University of Colorado Boulder.  التطور الأخير من الأدوات التي تجمع بين علم الأعصاب وعلم الوراثة وعلم البصريات، ووصف "optogenetics"، وتمكن من السيطرة على النشاط الدوائر العصبية مع مستوى غير مسبوق من القرار المكانية والزمانية. هنا نقدم بروتوكول للدمج في تسجيل المجر?...

Video: A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

الفيروسية تنبيغ الانتقائي للبالغين المولودين في الخلايا العصبية الشمية لالمزمنة في الجسم الحي تحفيز Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها<em&gt; في الجسم الحي</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

في القياسات الكهربية فيفو على الأعصاب ماوس الوركي

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

فيفو السابقين علم البصريات الوراثي تشريح الدوائر الخوف في الدماغ شرائح

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

والطريقة المبسطة للفائقة منخفضة الكثافة، طويل الأجل الابتدائية الحصين العصبية الثقافة

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

مراقبة البصرية من البروتين العصبية باستخدام حمض أميني مصطنعة مشفرة وراثيا في الخلايا العصبية

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

تصوير راتيوميتريك الكالسيوم من الخلايا العصبية الفردية في التصرف ايليجانس كاينورهابديتيس

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.