Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national sur l&#39;abus des drogues (NIDA) subvention R01 DA24040 (CDC), l&#39;Université du Colorado Subvention de démarrage innovant (CDC), et NIDA formation subvention T32 DA017637 (MVB).

Une. Conservation et préparation virus <ol><li> L&#39;utilisation de vecteurs AAV réplication incompétent pour délivrer des gènes opsin pour le cerveau des rongeurs est approuvé pour la sécurité biologique de niveau 1 (BSL-1) et nécessite une protection adéquate et les procédures de traitement tel que décrit dans la publication du gouvernement américain, la biosécurité en microbiologie et biomédicales de laboratoires, disponible à les Centers for Disease Control site à ( <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li> Afin d&#39;éviter des cycles répétés de gel-dégel, le virus de la pipette de la fiole de fabricant en aliquotes de travail plus petits dans un Cabinet et magasin de biosécurité de classe II dans un congélateur à -80 ° C. </li><li> Avant l&#39;injection stéréotaxique, permettent une aliquote de dégeler la glace, puis tourner brièvement vers le bas avec une centrifugeuse de paillasse. </li><li> Remblayer lentement une seringue en verre et une aiguille Hamilton avec une petite quantité de silicone ou une huile minérale.Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air visibles dans le corps de la seringue. Insérer la seringue dans une pompe à micro-injecteur et fixer la pompe directement sur ​​le bras stéréotaxique verticale (c.-à-manipulateur stéréotaxique). </li><li> Abaissez le bras stéréotaxique jusqu&#39;à ce que la pointe de l&#39;aiguille touche le fond du tube aliquote de virus. Utiliser le dispositif de commande de la pompe de micro-injecteur pour retirer le volume souhaité de virus (1,5 ul pour une injection de 1 ul). </li><li> Toutes les surfaces et matériaux qui entrent en contact avec le virus doivent être décontaminés avec un désinfectant comme l&#39;eau de Javel (10%). </li></ol> 2. La chirurgie et le virus Injection <ol><li> Anesthésier l&#39;animal avec une kétamine (rat, 125 mg / kg, ip) - xylazine (rat, 10 mg / kg, ip) cocktail. Pour évaluer l&#39;efficacité de l&#39;anesthésie, de vérifier une réponse réflexe à une pincée de pieds et de donner des doses supplémentaires de kétamine si nécessaire. En utilisant des méthodes chirurgicales d&#39;asepsie standard, placer l&#39;animal dans un appareil stéréotaxique (Kopf David Dansinstruments). </li><li> Faire une incision médiane à travers la peau sur le dessus du crâne animal avec de petits ciseaux chirurgicaux ou d&#39;un scalpel. Séparez délicatement le tissu conjonctif et nettoyer le dessus du crâne avec un petit grattoir osseuse. </li><li> Vérifiez que la tête de l&#39;animal est telle que le niveau z coordonnées pour bregma et lambda sont égaux. Déterminer les coordonnées stéréotaxiques pour la zone du cerveau cible d&#39;un cerveau atlas tels que le cerveau de rat en stéréotaxique coordonnées (George Paxinos et Charles Watson, Academic Press, 2007) ou le cerveau de la souris dans stéréotaxique coordonnées (Keith BJ Franklin et George Paxinos, Academic Press , 2007). Marquez le site prévu de l&#39;injection avec un stylo chirurgical. </li><li> Mince soigneusement le crâne sur la zone cible à l&#39;aide d&#39;une perceuse à main et arrêter lorsque le foret atteigne le fond du crâne. En utilisant une paire de pinces très fines, retirer l&#39;os aminci afin d&#39;exposer la dure-mère. </li><li> Placez l&#39;aiguille de la seringue sur la cible sontun et abaisser l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce qu&#39;elle touche la dure-mère et utiliser ce point pour calculer la coordonnée z. Très lentement abaisser l&#39;aiguille d&#39;injection dans le cerveau jusqu&#39;à ce que la position correcte de z est atteinte. Dans ce protocole, la région prélimbique du cortex préfrontal médian (2,7 mm antérieur à bregma, ± 0,5 mm latéral de la ligne médiane, et -2,2 mm de durée) ou le subiculum dorsal (-6,0 mm antérieure à bregma, ± 3,0 mm latéral de la ligne médiane, et -2,0 mm de durée) est ciblée dans un Sprague Dawley rat mâle (env. 275 g) adulte. </li><li> Injecter le virus à un débit de 0,1 ul / min. Après l&#39;injection est terminée Attendre 10 min avant de retirer l&#39;aiguille pour éviter le reflux du virus à la surface du cerveau. </li><li> Utiliser un fil de suture à coudre avec une aiguille attachée à la peau et de sceller les antibiotiques appliquer sur la plaie. </li><li> Le décours temporel de l&#39;expression fonctionnelle et ChR2 NPHR de vecteurs AAV sera variable en fonction de la conception expérimentale et le titre viral. Pour cette expérience, in vivo </em&gt; enregistrements ont été réalisés injection 18-21 jours de poste. </li></ol> 3. Livraison lumière et dans l&#39;enregistrement in vivo de ChR2 ou neurones exprimant NPHR <ol><li> Attacher une électrode de tungstène (~ 1-1,5 MQ, microsondes) à un tube capillaire en verre (Fisher Scientific) en utilisant la super glue. </li><li> Utilisez un outil de fibre de décapage (Thorlabs) pour exposer l&#39;extrémité dénudée d&#39;une fibre optique multimode (200 um noyau de diamètre, Thorlabs) et la pointe de fibre propre avec de l&#39;éthanol. Très légèrement marquer pointe de la fibre avec un couteau de diamant en forme de coin (Thorlabs) et retirez soigneusement la fibre excès (par exemple avec une pince fine). La fibre devrait s&#39;attacher facilement à la partition. </li><li> Connecter l&#39;extrémité de la fibre FC sur le connecteur d&#39;un ordinateur sur le port de sortie d&#39;un seul laser à diode de 200 mW ( <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) avec la longueur d&#39;onde souhaitée. Assurez-vous que des lunettes de protection approprié est porté en tout temps lorsque vous travaillez avec des lasers. </li><li> Mesurer la lintensité aser à l&#39;extrémité de la fibre optique à l&#39;aide d&#39;un mesureur de puissance optique ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Pour les enregistrements in vivo, l&#39;intensité lumineuse aussi peu que 20 à 100 mW / mm 2 de façon fiable peut évoquer CHR2-ou activation ou inactivation médiée NPHR, respectivement, de l&#39;activité neuronale. </li><li> Insérer la fibre optique dans le tube capillaire. Placez la pointe de la fibre d&#39;environ 500 um dessus de la pointe de l&#39;électrode de tungstène et attacher un fil de suture mince deux fois à quelques points près de la pointe de sorte que l&#39;électrode et la fibre sont droites. Assurez-vous que la distance entre la pointe de l&#39;électrode et le nœud le plus proche est assez long pour l&#39;insertion de la région cible. </li><li> Préparer l&#39;animal comme dans les étapes 2.1 et 2.2 ci-dessus. Utilisez la craniotomie initiale comme un guide pour faire une nouvelle petite fenêtre propre dans le crâne pour le positionnement de la optrode ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Faire une petite incision sur la dura aide d&#39;une aiguille fine. </li><li> Abaisser avec précaution la optrode par la fenêtre du crâne et dans le cerveau pour la région transduction utilisant un micromanipulateur (Narishige). Avancez ensuite le optrode lentement 10-50 um étapes jusqu&#39;à l&#39;émergence d&#39;une cellule sensible à la lumière. </li><li> Une interface utilisateur de logiciels personnalisés (NeuroLux Pro <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) écrit en LabVIEW (National Instruments) est utilisé pour contrôler la diode laser unique et de visualiser et d&#39;enregistrer l&#39;activité neuronale en cours. Signaux enregistrés sont capturés avec un examp-20K (Kation scientifique) passe-bande de l&#39;amplificateur filtré (0,3 à 8 kHz), et un analogue de National Instruments à bord numérique (NI USB-6009). L&#39;interface utilisateur de Pro NeuroLux permet le choix d&#39;entrées analogiques (choisir deux canaux pour le neuronale et signal TTL) et la sortie numérique. L&#39;utilisateur peut définir la fréquence d&#39;échantillonnage (20 kHz), la période de référence (pré-lumière), et la période post-lumière. L&#39;utilisateur peut définir l&#39;stimulati laser TTLla largeur d&#39;impulsion, la fréquence et la période de stimulation (si la fréquence est de 20 Hz et la stimulation période est de 500 msec, 10 des impulsions laser avec une largeur d&#39;impulsion définie sont fournis). L&#39;utilisateur peut également choisir la livraison de lumière continue (par exemple, la figure 1). Pour les enregistrements répétés, l&#39;utilisateur peut également définir le nombre de trains d&#39;impulsions et l&#39;intervalle entre les trains. Les données peuvent être acquis avec ou sans enregistrement sur le disque. </li><li> À la suite de l&#39;enregistrement, les animaux sont anesthésiés avec le cocktail de kétamine / xylazine et perfusées par voie transcardiaque avec du sérum physiologique et du paraformaldéhyde (4%), afin de vérifier le placement de optrode et l&#39;expression de l&#39;opsine. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299 (2007).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics in the nonhuman primate.</a> Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).</li><li>Zhao, S., Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2+/calmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li><li>McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+the+CNS.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).</li><li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+local+circuits+in+vivo:+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity.">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li><li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+optogenetic+silencing+of+orexin/hypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice.">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Une large gamme de techniques sont disponibles pour le ciblage des gènes génétiquement opsin microbiennes à des régions discrètes du cerveau chez les rongeurs. Livraison de gène viral fournit une approche relativement peu coûteux et rapide pour la médiation ChR2 et NPHR expression avec un type de cellule spécificité. Les systèmes de vecteurs d&#39;AAV sont un choix courant pour une utilisation dans des expériences optogénétiques dues à des titres élevés de production qui restent stables pendant le stockage, l&#39;absence de pouvoir pathogène, et sa capacité à produire de l&#39;expression 10 génique à long terme. Beaucoup de constructions opsin avec des promoteurs spécifiques de type cellulaire sont disponibles dans le commerce dans une variété de sérotypes d&#39;AAV de vecteur installations de base telles que l&#39;Université de Pennsylvanie ( <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) ou l&#39;Université de la Caroline du Nord à Chapel Hill ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). Un inconvénient de la technologie de l&#39;AAV est l&#39;capacité limitée d&#39;emballage (~ 4,7 kb), qui place une limitation sur la taille de la cassette de transgène qui peut être utilisé pour le ciblage spécifique de cellule. En variante, les vecteurs lentiviraux, qui ont une plus grande capacité de conditionnement, sont en mesure d&#39;accueillir l&#39;opsine de ciblage sous le contrôle des séquences promotrices de plus grandes. L&#39;utilisation d&#39;un optrode permet une détection fiable des signaux électrophysiologiques en combinaison avec la livraison de la lumière temporellement précis. Comme décrit ci-dessus, cependant, suffisamment de soin est nécessaire à sa construction. Depuis la fibre optique clivée est fragile, attacher le fil de suture trop serré peut causer la fibre de rompre. Même si le optrode peut être utilisé pour de multiples enregistrements, l&#39;électrode et la fibre optique doivent être nettoyés (ou manuellement clivés dans le cas de l&#39;extrémité dénudée de la fibre optique) avant l&#39;insertion en raison de l&#39;impédance de l&#39;électrode et de la qualité de la lumière délivrée dégradera avec une utilisation répétée. Pendant élémentenregistrements ctrophysiological il est important que la optrode être avancé lentement. Le optrode utilisé ici a une épaisseur d&#39;environ 350 um (de l&#39;électrode de tungstène: 125 um; noyau de fibre optique: 200 pm) et en l&#39;abaissant rapidement pourraient entraîner un mouvement du tissu cérébral. Artefacts induite par la lumière pourraient également être envisagées avec notamment l&#39;enregistrement et la livraison de lumière set-up 11-12. Bien que nous n&#39;avons trouvé aucune artefact induit par la lumière dans notre condition expérimentale, les enregistrements en dehors de la zone du cerveau transduction peuvent potentiellement être utilisés comme contrôle pour les objets légers. Une autre considération lors du processus d&#39;enregistrement est l&#39;intensité lumineuse nécessaire pour observer les changements dans les neurones ChR2 ou NPHR exprimant, en particulier pour les enregistrements de longue durée. L&#39;intensité du laser solide et de longue illumination laser pourraient entraîner des lésions tissulaires et / ou une diminution de la réponse à la suite lumineuse délivrée 12-13. Pour l&#39;expérimentation de comportement de l&#39;utilisation d&#39;un vecteur viral de commande est nécessaire pour eliminating tout effet dû à la chaleur délivrée par la fibre. Pour un grand nombre des constructions optogénétiques disponibles dans le commerce, il existe des constructions de commande complémentaires, dans lequel la séquence du gène de l&#39;opsine a été éliminé. Il convient de noter que conçu ChR2 variantes avec des propriétés et de la cinétique améliorées ont été développées avec d&#39;autres opsins silencieux qui peuvent être mieux adaptés à certaines questions expérimentales 14-15. Par exemple, une nouvelle variante ChR2 établie par mutagénèse ciblée, appelée &quot;CHETA&quot;, peut conduire à haute fidélité dopage neuronale à des fréquences (jusqu&#39;à au moins 200 Hz) supérieur à celui de la ChR2 originale 14. La combinaison de l&#39;administration in vivo de la lumière et l&#39;enregistrement simultané des réponses neuronales est une étape critique dans l&#39;établissement de relations de cause à effet entre l&#39;activité motifs dans des populations cellulaires génétiquement ciblées et événements comportementaux correspondants temps-verrouillé. Les procédures et les hardware décrite ici fournit une approche simple pour la mise en œuvre de optogenetics vivo enregistrements de tête fixe dans les rongeurs.

La capacité d&#39;activer ou de couper un type de cellule spécifique au sein d&#39;un circuit neuronal dans un mode temporel précis est essentiel pour comprendre comment les circuits neuronaux traiter différents types d&#39;informations sous-jacentes émotion et cognition. Contrôle expérimental sur l&#39;activité neuronale intact a utilisé des outils de loss-/gain-of-function (par exemple, la stimulation électrique, la modulation pharmacologique, lésion) qui ne fournissent pas le nécessaire sélective pour le contrôle des populations spécifiques de neurones, soit sur ​​une échelle temporelle ou spatiale. S&#39;adressant directement à ces défis technologiques, le développement et l&#39;application d&#39;outils sensibles à la lumière génétiquement encodables a permis neuroscientifiques de contrôler l&#39;activité électrique de types cellulaires particuliers pendant les événements de comportement bien définies. Beaucoup de ces protéines sensibles à la lumière sont d&#39;origine microbienne, avec le canal de lumière fermée cation, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, et la pompe de chlorure de lumière conduit, halorhodopsin (NPHR) 2,3, dans une utilisation généralisée. Un avantage majeur de optogenetics est la capacité de la population de cellules génétiquement cibles spécifiques dans des régions cérébrales hétérogènes et la technique a été appliquée avec succès à un certain nombre d&#39;organismes modèles (invertébrés aux primates non humains) 4-6. Beaucoup d&#39;animaux transgéniques optogénétiques ont été générés et sont disponibles commercialement 7,8, mais établissant lignées transgéniques peuvent être main-d&#39;œuvre et le coût prohibitif. Nous décrivons ici un protocole de livraison de manière virale médiée par des gènes CHR2 et NPHR sous le promoteur de CaMKIIα dans prélimbique cortex de rat et subiculum dorsal en utilisant un virus adéno-associé recombinant (AAV). Dans le cerveau antérieur, expression CaMKIIα est exclusif à neurones pyramidaux glutamatergiques 9. AAV est couramment utilisé pour la recherche fondamentale en raison de sa relative facilité de production et l&#39;absence de pathogénicité, ainsi que la forte et persil&#39;expression du transgène de stent qui ont été réalisés avec ces vecteurs 10. En outre, nous présentons les étapes et le matériel pour la livraison de la lumière et l&#39;enregistrement simultanés chez des rats anesthésiés tête fixe.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe </td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Removable Needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-03</td>
 <td>31 gauge, beveled tip</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microinjector Pump</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>UMP3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pump Controller</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-MICRO4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone Oil</td>
 <td>Alfa Aesar</td>
 <td>A12728</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser Protective Eyeware</td>
 <td>Kentek </td>
 <td>KMT-4501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Optical Fiber</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>BFL37-200</td>
 <td>200 &mu;m diameter core, 0.37 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber Stripping Tool</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>T12S21</td>
 <td>for 200 &mu;m diameter core multimode fiber</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Power Meter</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Photodetector</td>
 <td>Newport</td>
 <td>818-SL/DB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tungsten/Fiber Optrode</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>Lumitrode</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Capillary Tube</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-362-566</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydraulic Micromanipulator</td>
 <td>Narishige</td>
 <td>MO-22</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Kation Scientific</td>
 <td>ExAmp-20K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquistion Device</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>NI USB-6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rodent Head Restraint for Recording</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic Unit</td>
 <td>David Kopf Instruments</td>
 <td>Model 963</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo

Méthodes optogénétiques ont émergé comme un outil puissant pour élucider l&#39;activité des circuits neuronaux qui sous-tend un ensemble diversifié de comportements à travers un large éventail d&#39;espèces. Outils optogénétiques d&#39;origine microbienne sont constitués de protéines membranaires sensibles à la lumière qui sont en mesure d&#39;activer (par exemple, channelrhodopsin-2, ChR2) ou silence (par exemple, halorhodopsine, NPHR) activité neurale types de cellules ingenetically définis plus comportemental délais pertinents. Nous démontrons d&#39;abord une approche simple pour la livraison de médiation virale adéno-associé de ChR2 et NPHR transgènes au subiculum dorsal et la région prélimbique du cortex préfrontal chez le rat. Parce que ChR2 et NPHR sont génétiquement ciblage, nous décrivons l&#39;utilisation de cette technologie pour contrôler l&#39;activité électrique de populations spécifiques de neurones (ie, les neurones pyramidaux) intégrés dans le tissu hétérogène avec une grande précision temporelle. Nous décrivons ici la, un logiciel personnalisé de matériell&#39;interface utilisateur et les procédures qui permettent la livraison simultanée de la lumière et de l&#39;enregistrement électrique de neurones pyramidaux transduites dans un anesthésié en préparation in vivo. Ces outils sensibles à la lumière offrent la possibilité d&#39;identifier les contributions causales de différents types de cellules pour le traitement d&#39;informations et de comportement.

La figure 1 montre une capture d&#39;écran du logiciel personnalisé (NeuroLux Pro) développé dans l&#39;environnement LabVIEW (National Instruments) utilisé pour l&#39;enregistrement simultané de l&#39;activité neuronale et le contrôle des paramètres d&#39;impulsions de lumière (c&#39;est à dire de fréquence d&#39;impulsion, largeur d&#39;impulsion, période de stimulation). Le logiciel envoie un signal de commande à un dispositif d&#39;acquisition numérique qui génère des impulsions TTL pour le contrôle sur le laser à diode unique. En outre, le programme affiche de logiciels et les magasins l&#39;activité neuronale enregistrée et signaux TTL livrés. Ces signaux sont numérisés par l&#39;intermédiaire du dispositif d&#39;acquisition à une fréquence d&#39;échantillonnage définie (par exemple, 20 kHz). Signaux sont enregistrés comme un tableau à deux dimensions en double précision dans un fichier binaire. La figure 2 montre la optrode personnalisé constitué par une électrode de tungstène fixé à une fibre optique. Une fibre optique est fixée à l&#39;aide de l&#39;électrode mince fil de suture à troisdes points. Si nécessaire, la super glue peut être utilisé pour les faire adhérer. Cependant, éviter de fixer définitivement la fibre optique à l&#39;électrode, car bien que l&#39;électrode peut être réutilisée plusieurs fois, transmission de la lumière à travers la fibre se dégrade avec l&#39;utilisation répétée et devrait être clivé et nettoyé ou remplacé à chaque insertion dans le cerveau. Panneaux gauche de la figure 3 montrent des images fluorescentes de la protéine fluorescente jaune, indiquant ChR2 réelle et l&#39;expression NPHR. Ces photographies montrent l&#39;expression de NPHR représentant chez le rat dorsale subiculum (figure 3A) et expression ChR2 dans le cortex prélimbique (figure 3B). Expression virale a été limitée principalement à la subiculum dorsal et le cortex prélimbique (par exemple, certains fluorescence a été observée dans le gyrus denté (figure 3A, à gauche)). Les pistes de l&#39;électrode (piste mince, tête de flèche) et la fibre optique (piste d&#39;épaisseur, flèche) ont également été observées. la figure 4 montre que ChR2 induite dopage temporellement précis chez le rat cortex prélimbique. figure 4A est un exemple de trace de potentiels d&#39;action ChR2 déclenchés en réponse à la livraison de 20 Hz de 10 ms des impulsions de lumière bleue de rat prélimbique cortex. Raster parcelle (figure 4B) montre l&#39;activation ChR2-induite dans six neurones représentatives. Tous les neurones enregistrés ont montré dopage lumière évoqués avec une fidélité parfaite. Contrairement à ChR2, NPHR rapidement et de façon réversible taire activité spontanée in vivo chez le rat prélimbique cortex (panneau de droite de la figure 4). Figure 4C est un exemple de trace montrant que continue 532 nm éclairage (10 s) du cortex prélimbique exprimer NPHR sous la promoteur de CaMKllα élimine l&#39;activité unitaire spontanée in vivo. A noter que la réduction au silence complète de l&#39;activité des cellules pyramidales prélimbique temps est asservie à la production d&#39;une lumière continue de 10 sec. Faibleer raster parcelle (figure 4D) montre silence NPHR-induite dans six neurones représentatives. Les deux enregistrements in vivo sont typiques de celles obtenues à partir de rats adultes Sprague-Dawley à laquelle la livraison médiée par AAV de gènes microbiens opsin s&#39;est produite 18 à 21 jours avant. La figure 5 montre le résultat d&#39;une stimulation répétée ChR2 d&#39;un neurone pyramidal prélimbique de rat. Impulsion de lumière bleue (10 msec) a été livré à 20 Hz pendant 5 sec (100 impulsions total). traces de tension du dopage lumière évoqués ont été acquis de manière répétée toutes les 2 min pendant une session d&#39;enregistrement de 2 heures (61 répétitions au total). Même lors de l&#39;utilisation de ce protocole de stimulation répétitive, ChR2 induite dopage stable et robuste en réponse à la livraison de la lumière. Les figures 6 et 7 montrent les résultats de photoinhibition NPHR induite par photoactivation et CHR2-entraînée de l&#39;activité du neurone de subicular de rat. Comme c&#39;est le cas dans le cortex prélimbique, NPHR et ChR2 ont pumédiation de l&#39;inhibition et l&#39;activation des neurones subicular opsin transduites avec une grande reproductibilité temps-verrouillé induite lumière. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> Figure 1. Capture d&#39;écran de l&#39;interface du logiciel Pro NeuroLux pour la livraison de la lumière et l&#39;enregistrement simultanés électrophysiologique. Trace photo montre silence NPHR induite de l&#39;activité spontanée de rat cellules pyramidales prélimbique en réponse à 10 secondes de la prestation de lumière nm continu 532. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> Figure 2. Image haute puissance de optrode personnalisé. Une fibre optique est introduite dans un tube capillaire en verre fixé à une électrode en tungstène et fixé à l&#39;électrode en utilisant un fil de suture. La distance centre-à-centre entreen la pointe de l&#39;électrode et la pointe de la fibre est d&#39;environ 500 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> Figure 3. Expression virale et le placement de optrode. (Gauche) Les photographies montrent l&#39;expression de NPHR représentant dorsal subiculum (A) et d&#39;expression dans le cortex ChR2 prélimbique (B). (À droite) Schéma qui représente l&#39;endroit où chaque photo a été prise. La pointe de flèche et la flèche dans chaque photographie indiquent l&#39;emplacement de l&#39;électrode en tungstène et la fibre optique, respectivement. SUB: subiculum, DG: gyrus denté, PL:. Cortex prélimbique <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> Figure 4. In vivo des enregistrements électrophysiologiques du ChR2 ou prelimb de rat NPHR transduitescortex ic. (A) Exemple de trace de potentiels d&#39;action ChR2 déclenchés en réponse à la livraison de 20 Hz de bleu (473 nm) des impulsions de lumière (10 ms, bar bleu). (B) parcelle de Raster montrant dopage ChR2-induite dans six neurones représentatives. Chaque unité d&#39;activité est tracée en un point. (C) Exemple de trace de suppression NPHR-induite de l&#39;activité spontanée pendant vert continu (532 nm) de lumière d&#39;illumination (10 sec, barre verte). (D) parcelle de Raster montrant silence NPHR-induite dans six neurones représentatives. Chaque unité d&#39;activité est représentée par un point. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> Figure 5. Dopage répétitif 20 Hz ChR2-sortie d&#39;un neurone pyramidal de prélimbique de rat in vivo. (A) Tension traces du dopage lumière évoquéeacquise au niveau des points de temps 0, 30, 60, 90, 120 minutes après le début des enregistrements. (B) parcelle de Raster montrant les 61 répétitions (2 min d&#39;intervalle entre les essais, 120 min au total) de l&#39;activation induite par la lumière. Chaque unité d&#39;activité est représentée par un point. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> Figure 6. In vivo des enregistrements électrophysiologiques du NPHR transduction rat dorsale subiculum. (A) Exemple trace montrant que 10 sec continu 532 nm éclairage (barre verte) du subiculum dorsal exprimer NPHR élimine l&#39;activité spontanée. (B) des formes d&#39;onde moyenne des deux unités enregistrées à partir de la trace ci-dessus. Le seuil d&#39;amplitude a été utilisée pour identifier deux neurones distincts. (C) parcelle de Raster montrant cinq répétitions de silence NPHR-induite de ces unités. Chaque unité d&#39;activité est tracée en un point. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> Figure 7. Répétitif 20 Hz entraîné CR2-dopage d&#39;un rat dorsale subicular neurone in vivo. (A) Tension traces de la lumière évoquée dopage acquis aux points de temps 0, 30, 60, 90, 120 min après le début des enregistrements. Encart: activité typique de l&#39;éclatement de cette cellule. (B) parcelle de Raster montrant les 61 répétitions (2 min d&#39;intervalle entre les essais, 120 min au total) de l&#39;activation induite par la lumière. Chaque unité d&#39;activité est représentée par un point. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Le développement récent des outils de neurosciences qui combinent la génétique et de l&#39;optique, appelée &quot;optogenetics&quot;, permet le contrôle de l&#39;activité des circuits neuronaux avec un niveau de résolution spatiale et temporelle sans précédent. Ici, nous fournissons un protocole pour l&#39;intégration dans l&#39;enregistrement in vivo avec la manipulation de sous-ensembles optogenetic génétiquement définies de neurones pyramidaux du cortex préfrontal et subicular.

Une méthode pour High Fidelity optogénétiques contrôle de Pyramidal neurones individuels<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

19.0K vues.  University of Colorado Boulder.  Le développement récent des outils de neurosciences qui combinent la génétique et de l'optique, appelée "optogenetics", permet le contrôle de l'activité des circuits neuronaux avec un niveau de résolution spatiale et temporelle sans précédent. Ici, nous fournissons un protocole pour l'intégration dans l'enregistrement in vivo avec la manipulation de sous-ensembles optogenetic génétiquement définies de neurones pyr...

Vidéo: A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Recherche

Neurosciences

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogénétiques Dissection de circuits Peur en tranches cérébrales

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Une méthode simplifiée pour les ultra-basse densité, à long terme primaire hippocampique Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Contrôle optique d&#39;une protéine Neuronal L&#39;utilisation d&#39;un acide aminé Unnatural génétiquement codificateur dans Neurones

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.