著者らは、オーストラリアの研究評議会と国民健康オーストラリアの医学研究評議会から資金を認め、また感謝したい マイクロコンタクトプリント用のSU-8のマスターのためにオーストラリア国立加工施設。 SHNは、高等教育マレーシアとマレーシア科学大学省によってサポートされています。

1。 PLL-PEG-ビオチンとカバーガラスのパッシベーションこのステップは、細胞がmicrocontract印刷（ステップ2-3a）またはディップペンリソグラフィー（ステップ3b）で作成されたガラスカバースリップ上の特定の領域上に付着し、移行するように、表面を不動態化するために設計されています。不動態化のために、ポリ-L-リジン（PLL）とポリエチレングリコール（PEG）との共重合体は、PEG分子の20％がビオチン（PLL-PEG-ビオチン）にグラフトされた使用されています。 <ol><li>カバーガラス（18ミリメートル×18ミリメートル）、100％エタノールでラック内の水没、それらをきれいにし、30分間超音波処理浴中にラックを配置します。空気中または窒素気流下でカバーガラスを乾かします。 </li><li>次に、1MのNaOHで30分間、カバーガラスを超音波洗浄します。その後慎重に1.5リットルのMilli-Q H 2 Oを入れたビーカーにラックを浸漬することにより、ガラス表面をすすぐすすぎ工程に新鮮なのMilli-Q H 2 Oの各時間を使って3回繰り返します。でカバーガラスを乾燥60℃のオーブン℃の</li><li>きれいなガラスの場所の半分が部分的にH 2 Oに満ちた24ウェルプレートで作られている湿潤チャンバー内に個別にカバースリップ各ガラスカバースリップ上のPBS中のPLL-PEG-ビオチン（1 mg / ml）を15μlのドロップします。残りのきれいなガラスカバースリップの残りの半分を取り、慎重にサンドイッチPEG溶液を。湿潤チャンバーで1時間カバースリップのままにしておきます。 PEG-被覆表面をこすることなく、静かに互いから離れ挟まカバーガラスをスライドさせたMilli-Q H 2 Oでそれらを洗い流す水は、PEG処理面上で容易にスライドさせて外してください。必要であれば、処理された表面とペーパータオルの上で空気乾燥したカバーガラスは上向き。さらに使用するまで真空デシケーター中でカバーガラスを格納します。 </li></ol> 2。マイクロコンタクトプリント用のスタンプの作製我々は、不動態化されたカバーガラス上にパターンストレプトトラックに2つのプロセスについて説明します。最初のものは、マイクrocontact印刷は、一般的にPDMSスタンプが鋳造されているからシリコンマスターの製作が必要になります。我々のケースでは、PDMSスタンプ上のパターンは、25μmの特徴高さが290μmの中心から中心までを離間さ100μmの幅の線である。以下に、我々は適切なシリコンマスター（ステップ2.1から2.3まで）とPDMSスタンプ（ステップ2.4​​）を製造する方法を簡単に説明します。しかし、カバーガラス上にタンパク質パターンを印刷するのに適している文献19から23に記載のマイクロコンタクトプリンティングのための複数のプロトコルがあります。マスターズはまた、カスタムメイドや商業的供給源から購入することができます。 <ol><li>ミリQ、H 2 Oで徹底的に10回、20分間ウェーハをすすぐ。：まず、ピラニア溶液（硫酸のvと30％過酸化水素3時01 v）中でインキュベートすることにより、シリコンウェハ（4 &quot;直径）をきれいに150℃のオーブンでウェハを乾燥°CO / N </li><li> 100％イソプロピルアルコールに続いて、100％アセトンできれいにし、乾燥させたシリコンウェーハを洗浄します。次のGM1070 SU-8フォトレジスト（Gersteltec Sarlは）3,100 rpmでウェハ上にスピンコート2ミリリットル40秒間は、25μmの厚さの層を作成することができます。次いで、試料を95℃でさらに5分間続く5分間℃における65℃のホットプレート上で焼かれる</li><li>所望のパターン（Quintel Q6000マスクアライナを使用するなどして）、フォトマスクの下で60秒間紫外線にSU-8フォトレジストを露出させ、ベーキング処理は2.2で説明する繰り返し。その後、サンプルを4分、100％のイソプロピルアルコールで洗浄し、窒素気流下で乾燥するため、SU-8の開発者（Gersteltec Sarlは）でウェーハを浸漬することにより開発されています。紫外線に露出していなかったSU-8フォトレジストの領域は、このようにPDMSスタンプの逆パターンを作成して、削除されます。 </li><li>次のステップは、シリコンマスターからPDMSスタンプをキャストすることです。まず、徹底的にエラストマーポリマー10部（シルガード184）と硬化剤1部（w / w）を混ぜます。任意の気泡、脱気真空ラインに接続されたデシケーター中に混合物を削除するには1時間。次に、高さが約1cmにシャーレ内のシリコンマスター上にPDMSエラストマーを注ぎ、1時間で70℃のオーブンで、マスターとPDMSの混合物を硬化させる。最後に、PDMSスタンプを、シリコンマスターから削除され、大きさにカットされています。 </li></ol> 3。非アクティブ化されたカバーガラス上にパターニングストレプトアビジンまたは接着手掛りカバーガラスを不動態化した後、タンパク質パターンがマイクロコンタクトプリント（ステップ3a）またはディップペンナノリソグラフィー（ステップ3b）がプリントされています。我々のケースでは、ストレプトアビジンは、RGD勾配（ステップ4）の基礎を形成する線として印刷されます。同じ手順を、また、接着剤パターンを作成するためにマトリックスタンパク質を印刷するために使用することができます。 表面への生体分子のパターニングのためのマイクロコンタクトプリンティングに代わる方法は、ディップペンリソグラフィーです。ディップペンリソグラフィーでは、カンチレバーが表面に少量の溶液を転送するために使用されています。カンチレバーの大きさは、vソリューションのiscosityは、表面上にカンチレバーの接触時間、印刷室の表面や湿度の疎水性は、プリント機能のサイズを決定します。この方法の利点は、マスターと切手を製作する必要がないように、異なるパターンは、それぞれの実験のために印刷することができることである。欠点は、それが与えられたパターンをプリントし、ディップペンリソグラフィーは、多くの研究室では使用できない可能性が専門機器を必要とすることに時間を要することです。我々が使用したディップペンリソグラフィー機器はBioforceナノサイエンスからNanoeNablerだった。ここで、我々はSPT10カンチレバーを使用しているため、直径&lt;10μmであった小さなドットを印刷した。 3A。マイクロコンタクトプリント（μCP）法<ol><li>きれいにし、PDMSスタンプをより親水性にし、1.5時間のための紫外線とオゾン（Bioforceナノサイエンスから例えば、UVオゾンProcleaner）のPDMSスタンプのパターン化された側を治療する。別の方法として、プラズマを使用同じ目的のために短い時間のためのクリーナー。このプロセスは、印刷プロセスを改善し酸化PDMS表面24を作成します 。 </li><li>ただちに、オゾンやプラズマ処理後、PDMSスタンプ上に10μlのストレプトアビジン（PBS中1 mg / ml）を広げ、湿潤チャンバーで1時間放置（そのような部分的に充填された6ウェルプレートのような、ステップ1.3を参照） 。トラックは、蛍光顕微鏡下で表示する必要がある場合、例えばストレプトアビジン-AlexaFluor350としてフルオロフォアにコンジュゲートしているストレプトアビジンを使用しています。 </li><li>ティッシュペーパーと空気で約1分のスタンプを乾かすとスタンプから過剰ストレプトアビジンを削除します。軽くPLL-PEG-ビオチンでコーティングされたガラスカバースリップ上にスタンプを押します。 </li><li>蛍光ストレプトアビジンがステップ3.a2で使用された場合は、落射蛍光顕微鏡下で使用してパターンを調べます。デシケーターで印刷面を保管してください。 </li></ol>図3b。ディップペンリソグラフィー<ol><li>まず、1 mg / mlのストレプトアビジンまたはSTREの1部を混ぜてグリセリン10部（v / v）でptavidin-AlexaFluor350とカンチレバーに混合液5μlをロードします。ディップペンリソグラフィー装置の取扱説明書で説明されるように、印刷プロセスを開始します。印刷速度を調整し、約5μmのスポットサイズを小さくするには、表面への表面やカンチレバーの垂直距離でカンチレバーの時間にお問い合わせください。 図2cに示す例では、ドットは行10〜15μmに設定カラム分離に沿って印刷されました。この距離は、お互いに併合からドットを防止するのに十分であるが、ほとんどの顕微鏡設定でビューの1つのフィールドに複数のドットを表示することができます。 </li><li>デシケーターで印刷面を保管してください。 </li></ol> 4。ストレプトアビジン - パターン表面上に接着剤グラデーションを作成する我々は、ストレプトアビジン（ 図3）または共同で被覆されたカバーガラス上にビオチン-RGDの接着グラデーションを作成する不動態化されたカバーガラス上ntainストレプトパターン（ 図5）。表面のグラデーションを作成するために、我々は受動拡散によって安定したソリューションのグラデーションを作成し、市販のマイクロ流体デバイスを（Ibidiからスティッキスライド走3Dと呼ばれる）を使用しました。ストレプトアビジンの結合部位に対して競合するために、我々は（ 図1を参照）のRGDに共役ではありませんでしたビオチン-RGDとビオチンの対向する2つのグラデーションを採用。 <ol><li>スティッキスライド走3Dデバイスの粘着面上にストレプトアビジン被覆またはパターン化されたカバーガラスを接着。数時間のために漏れがないことを確認するには、デバイスのエッジは温めワセリンの薄い層で、パラフィンワックス1部（w / w）であるワセリン1部の混合物の第2層で封止されている。 </li><li>チャンネル内の6μlのPBSで機器のチャンネルを埋める。その後PBSと70＆mの0.03μg/μLのビオチン-4-フルオレセインの70μlの2つのリザーバを埋めるU; 0.03μg/μLのそれぞれPBSにビオチン-RGDのリットル。 1時間暗所でRTでサンプルをインキュベートする。 </li><li>ビオチンソリューションを外し、まだPBSで二回マイクロ流体デバイスに接続されている間、慎重に表面をすすいでください。接着剤グラデーションの方向をマークし、必要に応じて、4℃でPBSで記入した装置を格納しますが、デバイスが乾燥しないようにしてください。必要に応じて、蛍光顕微鏡を用いて接着剤勾配を分析します。 </li></ol> 5。ライブセルイメージングのための蛍光団を有する細胞のラベリング細胞を蛍光顕微鏡下で細胞の追跡を支援する蛍光色素で標識されています。一般的なプローブは、蛍光オルガネラマーカー、細胞核にラベルを付けるようSYTO 64レッドです。そうするためには、細胞をまず45分間培養培地中の1μMのSYTO 64レッドと一緒にインキュベートし、PBSで3回洗浄し、最後にPBSでさらに3回洗浄する。細胞はすべきではないことに注意してください長時間のPBS中に維持した。 細胞追跡のための代替染料は細胞質を染色CellTrackerシリーズであり、細胞遊走と分裂の際に保持されます。蛍光融合タンパク質を用いた細胞のトランスフェクションは、移行時には、目的のタンパク質の細胞内分布を記録する場合に特に便利です。有機色素よりしかし、蛍光タンパク質は、典型的に、光漂白剤より速く、長期的な観測ができないことがありますので。 6。マイクロ流体デバイスに可溶性グラデーションを持つ細胞のロード<ol><li>蛍光標識された細胞数を数えると等しいセルの数値の2管に分割。例えば、10％ウシ胎児血清（FBS）で、低血糖ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）等の化学誘引物質を含有する培地で細胞の一つのチューブを洗浄し、再懸濁します。 0パーセントFBSを含むDMEM すなわち 、化学誘引せずにメディア内のセルの他のチューブを洗浄し、再懸濁します。最終濃度各チューブ内の細胞の5×10 5細胞/ mlである必要があります。 </li><li>マイクロ流体デバイス（ステップ4.3）からのすべてのソリューションを外し、顕微鏡ステージ上に置きます（ステップ7を参照）。 1貯水池と別のものにHeLa細胞を70μlの（10％FBSを含むDMEM中に5×10 5細胞/ ml）に細胞の70μlを（0％FBSを含むDMEM中に5×10 5細胞/ ml）を読み込みます。緩く蒸発を避けるために、貯水池の上にテープを配置します。表面の細胞は事前イメージングにプレインキュベートされる場合、それは細胞が勾配ない増殖培地中のデバイスにロードされることをお勧めします。次に、このデバイスを顕微鏡のステージ上に配置され、メディアは他の中で、10％FBSを1リザーバーとDMEMでFBSを含まない勾配メディアすなわち DMEMに置き換えられます。 </li></ol> 7。細胞イメージングとデータ解析を生きる<ol><li>顕微鏡（ニコンのTi-E）をオンにして、実験を開始する前に、少なくとも1時間のステージを温める。 </li><li> MICRのそのチャンネルを確認してくださいofluidicデバイスが視野にあり、細胞がフォーカスされている。このような露光時間と蛍光フィルター、細胞やトラックをキャプチャ明視野と蛍光の画像シーケンスだけでなく、時間ポイントと記録の長さ（ 例えば 、16時間毎に15分間）として画像収集パラメータを選択します。 </li><li>そのようなImageJのマニュアルトラッキングまたはIbidi走化および移行ツールとして適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。 </li></ol>

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我々は、開示することは商業的な利害関係はありません。

このプロトコルでは、化学的に修飾された表面および細胞遊走に対する誘引物質勾配の影響を調査するために、市販のマイクロ流体デバイス（Ibidiからスティッキスライド走3D）を使用しました 。勾配は、チャネルの長さに沿って拡散することによって確立されるので、この設定では、マイクロ流体の流れを必要としません。流れは差ような安定した接着斑と小焦点複合体と?...

監督細胞遊走は、多くの細胞の基本的な財産であり、胚発生、感染防御、創傷治癒を含む多くの正常な生理学的プロセスの重要な側面である。加えて、細胞遊走はまた、血管疾患、腫瘍細胞の転移および慢性炎症の1,2のような多くの疾患において重要な役割を果たしている。古典的な細胞移動の状態が-偏光、突起伸展性、接着性、力発生とリア撤回の形成は-一般的に3,4を受け入れており、信号の統合が調整されることによって時空のメカニズムを解明することは、より困難になっています。 細胞外マトリックス（ECM）は、細胞接着のための基質として機能し、固有の化学的および物理的な5 6多様性を通じて、セルナビゲーション7,8のための方向手がかりを提供しています。これらの接着剤の合図9、可溶性因子10月12日に加えて、&lt;/ sup&gt;のようなケモカインおよび増殖因子としては、化学誘引物質受容体とその下流motogenicシグナリングを介して導か細胞遊走を誘導することができる。現在、このような受容体チロシンキナーゼ（RTK）などの関与と接着受容体（ すなわち、インテグリン）または化学誘引物質受容体を介したシグナル伝達、かどうかは知られていない、支配的である。また、それは受容体系の階層は特定の細胞型であるかどうか知られています。 生細胞顕微鏡、バルクアッセイではアクセスできませんし、固定化された13,14及び可溶性手がかり15 16の勾配を生成するマイクロ流体デバイスと組み合わせることができる豊富な情報を提供します。ここで説明する方法は簡単に細胞生物学研究室（ 図1）で実施可能であることを細胞遊走のイメージングアッセイを作成するには、市販のマイクロ流体室と連携して、表面改質のためのシンプルで確立された一連の手順を利用しています。組み立てマイクロ流体デバイスは、ガラス17に匹敵すると拡散性分子の勾配は少なくとも16時間安定している光学特性を持っています。システムは、落射蛍光顕微鏡と高度な技術を使用することができます。他の走化性のセットアップ18とは異なり、このシステムは徐々に移行し、接着細胞を記録するのに適しています。重要なのは、システムがモジュール化されており、簡単に代替接着剤や水溶性遊走の手がかりと様々な種類の細胞の検査の導入が可能です。

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverglass staining outfits</td>
 <td>Thomas Scientific</td>
 <td>8542 E40</td>
 <td>Coverslip rack</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oven</td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td>ED 53 series</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon wafer</td>
 <td>Silicon Quest</td>
 <td>708-007</td>
 <td>Boron doped &lt;100&gt; wafer, 4" diameter, 500 &mu;m, single side polished</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GM1070 SU-8 photoresist</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 developer</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 curing agent</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 elastomer prepolymer</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td >&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLL-PEG-biotin (20%)</td>
 <td>SuSos AG</td>
 <td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>46955</td>
 <td>1 mM in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-AlexaFluor350</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S-11249</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-4-fluorescein</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B-1370</td>
 <td>0.03 &mu;g/&mu;l in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-RGD</td>
 <td>GenScript</td>
 <td>SC1208</td>
 <td>0.03 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syto 64 Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td> S-11346 </td>
 <td>1 &mu;M in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sticky slide chemotaxis 3D</td>
 <td>Ibidi</td>
 <td>80328</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l Greiner yellow bevelled tip</td>
 <td>Greiner Bio-One</td>
 <td>739261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaseline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>16415</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin wax, mp 55-57 &deg;C</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>327204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nano eNabler 10 &mu;m cantilever </td>
 <td>BioForce</td>
 <td>SPT-S-C-10s</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Image J software</td>
 <td>National Institute of Health</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Tracking plugin</td>
 <td>Fabrice Cordeli&egrave;res</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemotaxis and Migration Tool</td>
 <td>Ibidi GmbH</td>
 <td></td>
 <td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html" target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

creating adhesive and soluble gradients for imaging cell migration with fluorescence microscopy

細胞が感知し、そのような細胞外マトリックスや成長因子などの水溶性の手がかりの糖タンパク質などの接着手がかりの高い濃度に向かって移動することができます。ここでは、ライブセルイメージングと互換性のあるマイクロ流体チャンバー内に接着剤及び水溶性の手がかりの対向するグラデーションを作成する方法を概説しています。ポリ-L-リジンおよびポリエチレングリコール（PLL-PEG）の共重合体は、カバーガラスを不動態と生体分子と細胞の非特異的吸着を防止するために採用されている。次に、マイクロコンタクトプリンティングまたはディップペンリソグラフィーは、接着手がかりとしてビオチン化ペプチドアルギニン - グリシン - アスパラギン酸（RGD）のためのポイントをアンカーとして機能するように不動態化された表面にストレプトアビジンのトラックを作成するために使用されます。マイクロ流体デバイスは、修正された表面上に配置され、ストレプトアビジントラックに接着手がかり（100％、0％、RGDにRGD）の勾配を作成するために使用されます。最後に、同じマイクロ流体デバイスは、化学誘引成功のグラデーションを作成するために使用され接着剤手がかりの勾配の反対方向に可溶手がかりとしてウシ胎児血清（FBS）、hも付きます。

セルは渡り鳥の信号25を統合する方法を理解するために、我々は競合する接着剤と水溶性の勾配（ 図1）を使用する環境で移行することを蛍光顕微鏡での画像セルにメソッドを開発しました。蛍光ストレプトアビジンとビオチン化RGDが含まれていた接着剤のトラックがマイクロプリントトラックとディップペンリソグラフィー（ 図2）で作成されまし?...

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Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

生細胞遊走試験のための顕微鏡検査室における接着剤および可溶性勾配のアセンブリのための方法が記載されている。エンジニアリング環境は、ソリューションの勾配と防汚表面と接着剤のトラックを結合し、したがって1つは、指導の手がかりの相対的な重要度を決定することができます。

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

creating-adhesive-soluble-gradients-for-imaging-cell-migration-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K ビュー.  The University of New South Wales. 生細胞遊走試験のための顕微鏡検査室における接着剤および可溶性勾配のアセンブリのための方法が記載されている。エンジニアリング環境は、ソリューションの勾配と防汚表面と接着剤のトラックを結合し、したがって1つは、指導の手がかりの相対的な重要度を決定することができます。

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Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Microelectrode arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film polymer are expected to have extended functional lifetime because the flexible material may minimize adverse tissue response caused by micromotion. However, their flexibility prevents them from being accurately inserted into neural tissue. This article demonstrates a method to temporarily attach a flexible microelectrode probe to a rigid stiffener using biodissolvable polyethylene glycol (PEG) to facilitate precise, surgical insertion of the probe. A unique stiffener design allows for uniform distribution of the PEG adhesive along the length of the probe. Flip-chip bonding, a common tool used in microelectronics packaging, enables accurate and repeatable alignment and attachment of the probe to the stiffener. The probe and stiffener are surgically implanted together, then the PEG is allowed to dissolve so that the stiffener can be extracted leaving the probe in place. Finally, an in vitro test method is used to evaluate stiffener extraction in an agarose gel model of brain tissue. This approach to implantation has proven particularly advantageous for longer flexible probes (&gt;3 mm). It also provides a feasible method to implant dual-sided flexible probes. To date, the technique has been used to obtain various in vivo recording data from the rat cortex.

Insertion of flexible neural microelectrode probes is enabled by attaching probes to rigid stiffeners with polyethylene glycol (PEG). A unique assembly process ensures uniform and repeatable attachment. After insertion into tissue, the PEG dissolves and the stiffener is extracted. An in vitro test method evaluates the technique in agarose gel.

生体溶解性接着剤で取り付けられている硬質補強材を用いた柔軟神経プローブの挿入

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

生物工学

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光<em&gt;インビボ</em&gt;光学イメージング

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

垂直化学的酸素勾配の下で細胞移動研究のためのポリジメチルシロキサン - ポリカーボネートマイクロ流体デバイス

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...