従来、マクロファージは細胞の移動が遅いため、リアルタイムの走気学アッセイでは研究が困難でした。このプロトコルは、最大6時間以上の化学戦術勾配で移動するマクロファージを画像化する手段を提供する。転写アッセイなどのインプラントアッセイと比較して、マクロファージ形態を観察できるという利点があり、細胞速度や化学戦術効率などのパラメータを測定することができる。
マクロファージは多くの炎症性疾患に関与しており、この技術は、化学軸を阻害するように設計された薬物を研究するのに有用であり得る。また、ヒト単球などの他の細胞タイプにも適用することができる。初めてこの技術を試みるとき、細胞で作業する前に、気化チャンバーを充填する練習をするのが最善です。
この技術の最も重要な側面の1つは、気泡の回避です。原稿の指示に従って調製された変更されたRPMI 1640 HEPES媒体と1つまたは2つの化学顔軸スライドの接続チャネルを事前充填することによって開始する。スライドを細胞培養皿に入れ、37°Cに加熱したアルミニウムブロックに皿を置きます。
次に、ポート 1 とポート 4 にプラグを挿入します。200マイクロリットルのベベリングピペットチップを使用して、変更されたRPMI 1640 HEPES培地の15マイクロリットルを充填ポート3に堆積します。次に、ピペットチップをポート2に挿入し、適度に速い速度で15マイクロリットルを吸引し、接続チャネルと2つの側面供給チャネルを事前に充填します。
充填口2と3をキャップで覆い、37°Cの乾燥した二酸化炭素を含まないインキュベーター内の閉じた湿度室のラックにケモタクシススライドを置きます。マクロファージを分離するには、24ゲージのプラスチックカテーテルを、生後3〜4ヶ月のマウスの腹腔に挿入し、5ミリリットルのプラスチック注射器を使用して、カルシウムやマグネシウムなしで氷冷ハンクの緩衝塩溶液で空洞を洗い流します。洗浄した培地をチューブに集めた後、6.5分間Gの300倍に遠心する。
上清を捨て、200マイクロリットルの改変RPMI 1640培地中の細胞を再懸濁する。細胞懸濁液のアリコートを1~20に希釈する。次に、カウント デバイスを使用してセルをカウントします。
1ミリリットル当たり6個の細胞に10倍の10倍の最終濃度に希釈し、加熱されたアルミニウムブロックで摂氏37度に維持します。細胞懸濁液を上下に5回ピペットして凝集を減らし、10マイクロリットルを静かに3つの気化チャンバーのポートに堆積させる。ポート 2 にピペットチップを置き、セルのサスペンションを接続チャネルにゆっくりと引き込みます。
セルのサスペンションが導入されるとすぐに、ポート1と4のプラグを取り外してフローを阻止し、4つの充填ポートすべてにキャップを置きます。次に、37°Cの湿度室に2〜3時間、気胸スライドを置きます。逆顕微鏡で観察領域を検査します。
次に、充填ポート1と2にプラグを置き、充填ポート3が媒体で上部に充填され、気泡が含まれているかどうかを確認します。必要に応じて、無菌27ゲージ注射針を使用して気泡を取り外します。次に、100マイクロリットルの機械ピペットを用いて培地60マイクロリットルを吸引し、その先端を充填ポート3に入れる。
ボリューム設定リングを使用して、1~2分後に充填ポート4の上部に到達するまで、ゆっくりと着実にリザーバに媒体を注入します。2 つ目のリザーバを満たすには、ポート 1 からプラグを移動し、ゆっくりとポート 3 に挿入します。培地50マイクロリットルを吸引し、ピペットチップをポート4に入れ、1~2分後に充填ポートの上部に到達するようにゆっくりと2番目のリザーバに媒体を注入する。
2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに495マイクロリットルの培地を加え、パテントブルー5の5マイクロリットルを加えます。混合物を短時間渦に、その後、組換えマウス補体C5aと渦の5.4マイクロリットルを再び加え、混合する。ポート1の上部の浅いくぼみが中程度で、15マイクロリットルの青色補体C5a含有培地を堆積することを確認してください。
その後、充填ポート4に200マイクロリットルのピペットチップを挿入し、ボリューム設定リングをゆっくりと回転させて、媒体を反対側の貯水池に引き込みます。充填ポート1の短い垂直列に空気を引き込み、流体と空気の界面が列の途中になるまで引き込みます。次に、ポート 1 をポート 1 に接続してから、ポート 4 からピペットをそっと持ち上げ、スライドが所定の位置に残っていることを確認し、ゆっくりとポート 4 を接続します。
タイムラプスイメージングを行うために、ステージインキュベーターを装着した反転顕微鏡のステージ上に走気軸スライドを配置し、10X位相コントラスト対物レンズで観察領域を画像化し、マクロファージラメリポディアに焦点を当てます。マウス腹膜マクロファージのタイムラプスビデオ顕微鏡に使用される気胸スライドには、それぞれが4つの充填ポートを有する3つの気胸室があります。各チャンバの観察領域に細胞を播種した。
そして、2〜3時間のインキュベーションの後、チャンバーはゆっくりと媒体で満たされました。観察領域の細胞を検査した時点で、細胞の3分の2までが洗い流されていた。一般的に、弱く接着性のB-1細胞を洗い流し、残りの細胞は主にマクロファージであった。
マクロファージをB細胞と区別するために、新たに単離された細胞を特異的抗体で標識した。マクロファージは緑色蛍光、B細胞は赤色、細胞核は青色で標識した。マクロファージの移動は、2つの貯水池の1つに化学誘引剤である補体C5aを導入することによって調査された。
補数C5勾配で移行するマクロファージの移動トラックを記録した。各移行トラックの開始点は、X がゼロに等しく、Y が 0 に等しく、移行プロットを作成するために正規化されています。次に、個々のマクロファージの細胞速度および化学戦術効率を計算した。
この技術は、Gタンパク質サブユニット、およびRho GTPases、および化学軸におけるマクロファージ運動の役割を研究するのに有用であった。
