著者は批判的な議論のためにW.日とK·ジャンセンに感謝し、シンガポール国立大学でナノバイオメカニクス研究室による支援を認める。 NAKがマリー·キュリーIIFフェローシップによる支援を認めるものです。

1.細胞の回収<ol><li> 37℃、5％CO 2インキュベーターからMD-MBA-231細胞を得る。 0.5％トリプシン-EDTA溶液を用いて組織培養プレートから細胞を剥離。 T25フラスコで培養した細胞のためのトリプシン-EDTA溶液1mlを使用してください。 </li><li> 4分間200×gでの遠心分離により15ミリリットルコニカルチューブ中の細胞をペレット化し、上清を吸引し、そして培養培地の5ミリリットル中に細胞を再懸濁。 </li><li>血球計数器を使用して、ρ、細胞密度をカウントします。 注：細胞播種インナーゲルを調製するために、細胞懸濁液は、後に最終的な細胞播種密度に達するために10倍に希釈される。したがって、10倍濃縮細胞懸濁液が必要とされる。 </li><li> 10×細胞濃度を達成するために必要な媒体の体積を計算する。 <img alt="式1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> 注：最終細胞播種密度を、 最後の C、約2の15; 10 6細胞/ mlのMD-MBA-231細胞に推奨されており、このプロトコルで使用されている。他の播種密度は、他の細胞型のために探索することができる。 </li><li>ペレット細胞1以上の4分間200×gでの遠心分離により15ミリリットルコニカルチューブの時間、上清を吸引除去する。 </li><li>細胞凝集を最小限にするために十分に無血清細胞培養培地の必要量（ステップ1.3で算出したV 培地 ）中で細胞を再懸濁。 注：フェノールレッドを自家蛍光であり、蛍光/反射率画像化を妨害する可能性がある。フェノールレッドを含まない培地の使用は、最高の画像品質を達成すると考えることができる。 </li></ol>コラーゲン溶液の調製<ol><li>原液コラーゲン溶液、10×PBS緩衝液、ミリQ H 2 O、0.1 MのNaOH、及びいくつかの微量遠心管を得る。早期のコラーゲン重合を防止するために氷の上にすべてを保持し、無菌状態を維持する。 </li><li>無菌のガラス - を平衡化する37℃のインキュベーター内に予め加温してボトムディッシュ。 注：このプロトコルのすべてのボリュームは、ウェル12 mmのガラスボトムディッシュに最適化されています。他の皿型が使用される場合、それに応じてボリュームを調節する。 </li><li>コラーゲンストック濃度に基づいて、インナーゲル（溶液I）が2.4 mg / mlのコラーゲン溶液50μlを調製するのに必要とされる必要な容量を計算する。 注意：インナーゲルのための他のコラーゲン濃度を使用することもできる。 </li><li>無菌環境（通常はバイオセーフティーフード）で、ゆっくりと穏やかな旋回と（ステップ2.3で計算）コラーゲン原液の必要量に10×PBS緩衝液の5μlを添加する。気泡の形成を避けるように注意してください。 </li><li>校正されたpHメーターを使用し、0.1M NaOHを用いて7.4に、混合物のpHを調整する。おおよその目安としては、（量がストック濃度とpHによって異なります）7.4に近いpHをもたらすために約5μLを使用しています。 注：ボリュームがこのに関与していることに注意してくださいステップは、標準pHメーターを使用するには小さすぎる。以下のトリックのいずれかを使用します。 <ol><li>複数のサンプルのためのコラーゲン溶液を準備します。標準pHメーターを使用してバルクのpHを調整し、サンプル全体でコラーゲン溶液を配布。 </li><li>あるいは、より大きな体積のコラーゲン溶液のpHを調整する（すなわち、標準的pH計の使用を可能にするボリューム）。 NaOHの量は、最終的なpHにpHを必要に応じて注意してください。ボリュームを縮小し、実験のためのNaOHの適切な量を使用しています。リトマス紙を用いてpH値を確認してください。 </li><li>そうでなければ、より正確に少量のpHを調節するために、マイクロpH電極を使用する。 </li></ol></li><li> H 2 Oを使用して45μLの容積に解決策を持参早期のコラーゲン重合を防止するために氷の上のすべての手順を実行します。 </li></ol>同心円ジェル文化の3の形成<ol><li>予め温めておいたガラスボトムディッシュを取る目から（ステップ2.2を参照してください）Eインキュベーター。 </li><li>溶液を十分I.再懸濁するために（ステップ1.5で調製）10倍濃縮細胞懸濁液の5μlを添加する。気泡の形成を避けるように注意してください。混合物は現在、50μlの容量を有し、（ 最終 = 2×10 6細胞/ mlのc）の最終コラーゲン濃度（2.4 mg / ml）で細胞密度を含有する。 </li><li>それはドーム状の液滴（ 図1A）を形成するように、私は、ウェルの中央にゆっくりと細胞含有溶液20μlを追加します。このステップでの気泡形成を避けるように注意してください。バブルフォーム場合は、慎重にしかしすぐにそれを破裂またはピペットチップを使用してそれを吸い出すするかしてみてください。静かに内側のゲルを45分間重合させるために戻ってインキュベーターで料理を置く。 </li><li> （アウター、無細胞コラーゲンゲル用）は、溶液Oこのインキュベーション工程の終了前に約15分を準備します。 注意：アウターゲル状態はコラーゲン濃度および重合のpHの条件に変更することができる異なる微細構造10とのネットワークを得る。 7.4のpHで重合を4.0mg / mlのコラーゲンゲル - このプロトコルでは、1.5に焦点を当てる。 <ol><li>コラーゲンストック濃度に基づいて、最終濃度のコラーゲン溶液のO200μlの準備に必要な必要量を計算する。 </li></ol></li><li>ゆっくりと穏やかな旋回と（ステップ3.4で計算）コラーゲン原液の必要量に10×PBS緩衝液20μlを追加します。キャリブレーションpHメーターの使用と、0.1M NaOHを用いて、最終的なpHに混合物のpHを調整します。 pH調整に関する2.5のステップに注意してご覧ください。 </li><li> H 2 Oを使用して200μlの最終容量に解決策を持参早期のコラーゲン重合を防止するために氷の上のすべての手順を実行します。 </li><li>内側のゲル（ステップ3.3を参照）の45分の重合後にインキュベーターから一品を取る。溶液が完全に内部を覆うように静かに、内側のゲルの上にソリューションOの180μlを添加するゲルとよく（ 図1B）をいっぱいに。 <ol><li>アウターゲル中の不均一な繊維配向につながる可能なソリューションを、攪拌せずに慎重にこの手順を実行します。ピペットチップで内側のゲルに触れないように注意してください、と気泡やエアポケットの形成を避けるため。バブルフォーム場合は、慎重にしかしすぐにそれを破裂またはピペットチップを使用してそれを吸い出すするかしてみてください。ゆっくりと外側のゲル重合さをできるように戻ってインキュベーターで料理を置く。 </li></ol></li><li>重合の45分後にインキュベーターから一品を取る。大体扱う場合には、それはまだ底面から切り離すことができますがゲルはすでにかなり、この時点で固化されるべきである。 <ol><li>静かに皿（ 図1C）に温め、細胞培養培地2mlを注ぐ。ゲルが完全に中に沈めていることを確認します。文化の期間を通じて3日間 - ごとに2培地をリフレッシュします。 </li></ol></li></ol> 4。生細胞イメージング<ol><li>長期生細胞イメージング機能を備えた倒立共焦点顕微鏡を用いて撮像を行う。温度（37℃）でインキュベーションチャンバーを内蔵し、CO 2（5％）の制御が含まれる。顕微鏡の電源を入れ、実験を開始する前に、ステージを少なくとも1時間のウォームアップ。 注：長作動距離対物レンズで使用する3次元ゲル内の細胞の観察および局在化を最適化する。 </li><li> 3Dシステム内のセルの正確な局在化を可能にするために30分間蛍光細胞追跡色素を5μlを含有する培地中でゲルをインキュベートする。その後、1×PBSで3回洗浄して未結合の色素を除去。その後、シャーレに細胞培養培地を加える。 </li><li>インキュベーターから料理を取り、顕微鏡ステージ（ 図1D）の上に置きます。 注：ライブセルイメージングは​​、右アウターゲルの重合後、原則的に開始することができます。しかしこの時点では、細胞のinの内側のゲルはまだ広がっていない。アウターゲルに侵入した最初の細胞の移動を調べるために、生細胞イメージングは​​、培養開始後24時間（細胞型に応じて）を開始することができます。おおよその目安としては、約12 - 14日間の培養は、外側ゲルを入力するように内側のゲル中の細胞のほとんどのために必要とされる。 </li><li>インナーゲルを囲む外側のゲル中の地域で見る（VOVの）のボリュームを選択します。インキュベーションの24時間後に、細胞集団が広がっているので、内側と外側のゲルとの間の界面を越えて、外側のゲルに侵入し始めた。 <ol><li> VOVのために、すぐに次の外側ゲル7の郊外に近いゲル界面、中間領域、および領域へのゲル領域を含む。可能なエッジ効果を回避するために、近い底面及び側面からだけでなく、ゲルの上部からは50μm以上の領域を除外する。各VOVは、一般的にXで（647×647×100μmの3を測定し、のz -stack5μmの間隔で、それぞれ、y、およびz方向）。 </li></ol></li><li>確実に撮影モード、チャンネル/フィルター、露光時間、及び画像の解像度が正しく選択されている。コラーゲンネットワークのラベルフリーイメージングのために、タイムラプス生細胞イメージングの間に同時に共焦点反射顕微鏡を使用しています。 </li><li> 、サンプル画像を取り、強度ヒストグラムをプロットし、十分な信号を観測し、ヒストグラムがゼロと最大強度の間にあることを保証することにより、飽和を避けるために、ゲインおよびオフセットを調整します。実験期間を通じてこれ以上、これらの設定を変更しないでください。 </li><li> 8時間（または必要に応じてより長い）のために10分、時間間隔、Δtと共に、選択したVOV年代のタイムラプス画像を撮影する。 </li></ol> 5.細胞追跡およびデータ分析<ol><li> appropriaを使用してZ -stack画像から定量的な画像後処理を実施<html>テ画像処理ソフトウェア。 <ol><li>セグメントタイムラプス画像は、自動的に（x、y、zの、t）内の3Dセル位置を選択する。 </li><li>フレームごとに、手動でローカライズ精度を確認し、細胞のために間違われている可能性が細胞の破片と細胞の突起に起因する偽陽性を削除する。分析から増殖細胞を取り出し、個別のオブジェクトに重複または接続されたセルを分割する。 </li></ol></li><li>時系列的に各セルの位置を連結することにより、前工程で得られた細胞の座標（x、y、z、t）から3Dタイムラプス細胞トラックを生成する。 </li><li>しきい値トラック長（通常は20分）より短いトラックを除去することによって、ランダムとシステムノイズを排除します。 </li><li>必要に応じて、トラックからの全体の正味の変位を減算することにより、サンプルのドリフトを修正してください。 </li><li>セルの変位を計算し、ジル/ ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg &quot;幅=&quot; 80 &quot;/&gt;、および細胞移動距離、 <img alt="式3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> 、観察細胞の軌跡から、ここで一度にセルの3次元位置を表すベクトルであり、時間点の総数である。 <ol><li> Δtはフレーム間の時間間隔であるS = D /（nは•Δtは）、などの細胞の速度を計算する。 P =Δdを/ Dを使用して、細胞移動の方向性（または持続性）を計算します。持続性のこの単純な尺度は、P = 0のために正味の変位がゼロであり、P = 1のための軌道が直線方向線であることを意味する。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Horwitz, R., Webb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+three-dimensional+collagen+matrices+to+provide+contact+guidance+during+3D+cell+migration.">Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration.</a> Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).</li><li>Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+dimensions+in+cell+migration.">New dimensions in cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).</li><li>Grinnell, F., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices.">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+migrating+cell-induced+matrix+reorganization+on+3D+cancer+cell+migration.">Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).</li><li>Achilli, M., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+mechanical+properties+of+collagen-based+scaffolds+for+vascular+tissue+engineering:+the+effects+of+pH,+temperature+and+ionic+strength+on+gelation.">Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation.</a> Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).</li><li>Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stiffening+and+softening+of+collagen:+interplay+of+deformation+mechanisms+in+biopolymer+networks.">Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).</li><li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy.">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).</li><li>Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+fibrillar+matrix+architecture+on+tumor+cell+invasion+of+physically+challenging+environments.">The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments.</a> Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+limits+of+cell+migration:+control+by+ECM+space+and+nuclear+deformation+and+tuning+by+proteolysis+and+traction+force.">Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force.</a> J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration:+a+mechanistic+perspective.">Collective cell migration: a mechanistic perspective.</a> Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li><li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices.">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li><li>Mouw, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+modulate+microRNA-dependent+PTEN+expression+to+regulate+malignant+progression.">Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression.</a> Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+microrheology+of+heterogeneous+biopolymer+hydrogels+using+covalently+bound+microspheres.">Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).</li><li>Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+feedback+between+actomyosin+and+focal-adhesion+systems+optimizes+rapid+cell+migration.">Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration.</a> Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho/ROCK-dependent+matrix+reorganization.">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion.">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress.">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar...

細胞の遊走は、胚発生、止血、および免疫応答ならびに、血管疾患、炎症、および癌の1のような病理学的プロセスにおける様々な生理学的応答において重要な役割を果たしている。細胞遊走の基礎となる生化学的および生物物理学的な因子を解剖する細胞機能の基本的な原理を理解するだけでなく、そのような組織工学、抗転移および抗炎症薬の開発のように、様々な生物医学的用途を前進させるだけではなく、したがって基本的に重要である。 in vivoでの観察が技術的に困難であるため、多くの努力は、細胞遊走のインビトロ要約が注目されている。 細胞遊走を研究するためのインビトロ法に大きく、最も顕著なのは、2次元（2D）表面上にアッセイのために傷を設計またはアッセイ2創傷治癒されている。このようなアッセイは、簡単な実験装置を提供し、容易なの生細胞イメージング、および細胞遊走の基礎となる様々な生化学的機構に有用な洞察を提供する。しかし、これらのアッセイは、in vivoの移行で理解する上での重要な側面である細胞外マトリックス（ECM）アーキテクチャと改造、を考慮していない。最近、ますます三次元培養モデルは、多くの場合、コラーゲンベースのマトリックス3において、優れたin vivoでの状況に似ているプラットフォームを提供することが理解されている。実際に、細胞が環境4の異なる次元に特に起因する2次元表面上のものとは異なる遊走動態を示す。また、マトリックスの生物物理学的および機械的特性が敏感に腫瘍細胞の浸潤6との関連を含めて、細胞遊走5に影響を与える。 ここでは、製造条件を容易に変更することができる生物物理学的特性を有するECM内の3D細胞遊走挙動を研究するための方法を提示する。細胞である「内部ゲル」に播種しに逃げ込むと、最初は無細胞「アウターゲル」を侵略するために許可されています。この方法は、密接にセル7 mechanosensingにリンクされている外側のゲル、無細胞領域に遊走する細胞のの存在を認識する能力、及び性向に依存する。本研究では、高浸潤性乳癌細胞、MD-MBA-231に侵略されたECMコラーゲンネットワークを採用する。内部と外部の両方のゲルの機械的性質と微細構造8をチューニングし、生理学的に関連する条件を達成するために9を特徴付けることができる。セルトラックの再構築及び分析は、集団レベルおよび個々の細胞レベルの両方で、時空間移行挙動の詳細な定量的な検査を可能にする。重要なことは、同心円状のゲルシステムのセットアップは、このように重要な洞察を提供し、特に癌細胞に侵入、細胞の移行が直面している生体内組織トポロジを模倣細胞遊走および転移の物理的なメカニズム。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Fisher Scientific Pte Ltd</td>
			<td>Model: 371, S/No 318854-6055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon A1R</td>
			<td></td>
			<td>Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent CellTracker dye CMTMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C2927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dish</td>
			<td>IWAKI Cell Biology</td>
			<td>3931-035</td>
			<td>35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iN CYTO</td>
			<td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprocessor pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>pH 211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutragen Collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>#5010-D</td>
			<td>Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S/No 29153352</td>
			<td>Basic pH Meter PB-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concentric gel system to study the biophysical role of matrix microenvironment on 3d cell migration

遊走する細胞の能力は、腫瘍および癌転移に胚発生及び創傷治癒から一生を通じて細胞機能のさまざまな重要である。熱心な研究の努力にもかかわらず、細胞遊走の基本的な生化学的および生物物理学的な原理は、まだ完全には特に、生理学的に関連する3次元（3D）の微小環境において、理解されていない。ここでは、三次元細胞遊走挙動の定量的検査を可能にするように設計されたインビトロアッセイを記載する。この方法は、以前に占有されていない細胞外マトリックス（ECM）の中に移動する細胞のmechanosensing能力や傾向を利用する。我々は、モデル系としてコラーゲンゲルにおける高浸潤性乳癌細胞の浸潤、MDA-MB-231を使用する。培養の数週間にわたる細胞集団の広がりと個々の細胞の遊走ダイナミクス生細胞イメージングを用いてモニターし、時空間的に分解されたデータを抽出するために分析することができる。さらに、したがって、この方法は、細胞遊走に微小環境における生物物理学的因子の役割を調査するため、シンプルでありながら強力な方法を提供し、多様な細胞外マトリックスのために容易に適応可能である。

ここに提示同心ゲルアッセイは高度に浸潤性乳癌細胞を用いて実施した、MDA-MB-231、2.4 mg / mlの内側のコラーゲンゲルと、一例として= 2×10 6細胞/ mlの細胞播種密度、を有する。 図2に示すように、典型的には培養の数日後に、細胞を、内外ゲル界面に違反し、外側ゲルに侵入し始めた。細胞集団は、主に半径方向外側に広がる。 外側のゲルの重合条件?...

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Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

機械的性質と細胞外マトリックスの微細構造は強く、細胞の3D移行に影響。 インビトロ方法は、集団及び個々の細胞レベルの両方での生物物理学的に可変環境における時空間細胞移動の挙動を研究するために、記載されている。

同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K ビュー.  FOM Institute AMOLF. 機械的性質と細胞外マトリックスの微細構造は強く、細胞の3D移行に影響。 インビトロ方法は、集団及び個々の細胞レベルの両方での生物物理学的に可変環境における時空間細胞移動の挙動を研究するために、記載されている。 

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

生物工学

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

微細加工チャネルにおける細胞移動の研究

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

世界的な細胞のマトリックスメタロプロテアーゼと 3 D ゲルの代謝活性を測定

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

軟骨外植木における移動と取り込みモニタリングのための細胞外小胞の標識

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

ヒト神経構築物の埋め込み3D印刷のためのミクロゲル-細胞外マトリックス複合サポート

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...