著者が惜しみなくFOXG1抗体を提供するための博士Y.笹井に感謝したいと思います。この作品は、コネチカット幹細胞研究助成金（08-SCB-UCHC- 022と11-SCB24）と痙性対麻痺財団によってサポートされていました。

1。ヒト多能性幹細胞凝集体の生成（D1〜D4） <ol><li>ヒト多能性幹細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、4 ng / mlで）を補充したhESC媒体の存在下でマウス胚線維芽細胞（MEF）フィーダー上で培養される。文化の中で5から7日後、コロニーが大きいが、それでも未分化である場合、それらは、次のステップのための準備が整いました。 </li><li>酵素液が最初に用意されるべきである。 50 mlチューブで、DMEM/F12培地に1 mg / mlの濃度でディスパーゼ（またはコラゲナーゼ）を溶かす。温めたときにこれらのソリューションは、最高のミックスなので、10〜15分間37℃の水浴中に培地と酵素を含むチューブを配置し、Steriflipフィルタを使用して、それを殺菌する。 </li><li>細胞から培地を吸引、DMEM/F12でそれらをすすぎ、そして同様に、このオフを吸引除去する。ヒトES細胞のための3-5分（性IPSCの場合は最大10分）のためのインキュベーター内で各ウェル場所にディスパーゼの1ミリリットルを追加します。顕微鏡下で細胞を見て、時エッジが少し丸く/ビット暗くなり、細胞は次のステップのための準備が整いました。 3分後に細胞を確認し、必要な場合にそれらを戻すことが最善です。初めてこのプロトコルを使用する場合、それはできるだけ早くディスパーゼから細胞を除去することが重要であると同時に、細胞の1プレートのみで開始するのが最善です。 </li><li>細胞からディスパーゼを吸引。穏やかに（細胞がこの段階では非常に脆弱であり、比較的容易に板から外れます）ディスパーゼを洗い流すために、各ウェルにDMEM/F12培地の1.5 mlを加える。 DMEM/F12を吸引し、各ウェルにhESCの培地1.5mlを加える。 </li><li>細胞を剥離し、別れること、（垂直）の右下隅に向かって10mlガラスピペットの先端を配置ウェル（細胞に触れる）とピペットを上下に移動して - 上向きのストロークが近くになければなりません手続下向きストロークへ。井戸の反対側に到達すると、水平方向の悲惨で繰り返すction。 </li><li>セルの全てが懸濁状態にされたら、15 mlチューブに置き、2分間200 xgでそれらを遠心分離します。チューブの底部での細胞のペレットがあるはずです。ペレット上から培地を吸引。 </li><li>凝集体を保つために利用されるべきである細胞培養フラスコの大きさは細胞の元の量に依存します。 hESCの培地50mlを活用すべきでhESCの6ウェル（1プレート）は、一つの非組織培養は、T75フラスコを治療した。ステップ1.6から37でフラスコとインキュベート℃にセルを転送</li><li>細胞の破片を取り除くためには、細胞培地、フラスコを約12時間後に交換する必要があります。これを行うには、（2分間200×g）で細胞をスピンダウンして、50 mlチューブに培地/細胞のすべてを置いて、古い培地を吸引。次に、新しいT75フラスコに細胞、場所に新鮮なhESCの培地50mlを加える。次いで、細胞を、これと同じ手順（5日まで）続く毎日供給することができます。 </li></ol><ol><li> 50mlチューブに細胞/培地を移し、200×gで2分間細胞を遠心分離する。次に、上清を吸引し、神経誘導培地（NIM）50mlでT75フラスコ新しい（処理非組織培養）にセルを転送します。 </li><li>細胞はNIMに入ったら、培地の半分が一日おきに交換する必要があります。凝集体は、彼らが数分後に自分で50 mlコニカルチューブの底（ない遠心分離は必要ありません）に沈んでしまう場所に十分に大きくなるはずです。 NIM（D7-D8の合計）で2〜3日後、細胞をプレートに準備ができているはずです。ラミニンまたはウシ胎児血清（FBS）は、細胞がプレートに取り付けるために利用することができます。 </li><li>各集合が他のものに触れることなく、いくつかのより多くの日をプレート上で増殖することができるはずとして必要とされている6ウェルプレートに扱わ組織培養の数は、細胞の密度に依存します。平均して、1からセルT75フラスコは細胞の価値は約4-6 6ウェルプレートをもたらすでしょう。 </li><li><ol class="ualpha"><li>ラミニンを使用している場合は、コート10〜20μg/ mlの6ウェルプレート（ウェル〜0.5ミリリットル/）にNIMでそれを希釈してください。 2〜3時間のためにコーティングした後、6ウェルプレート（ウェル当たり約20から30凝集体）上にプレート細胞凝集体。凝集体が取り付けられた後、NIMの1.5 mlを加える。 </li><li> FBSを使用している場合は、90％のNIMおよび10％FBS（1.5 ml /ウェル）の混合物を準備します。各ウェルに細胞と培地1.5mlを加え、穏やかに集計を広げるためにプレートを前後に振ると、細胞がインキュベーターにO / Nを添付することができます。 FBSを削除するには、次の朝培地（2 ml /ウェルNIMの）を変更してください。 </li></ol></li><li>メッキであることの一日か二日後、各集合は単分子膜を形成するために広がるでしょう。数日以内に、これらの細胞のほとんどの中心は形態学的に円柱状の細胞（細長い）のように表示されます。この期間中、一日おきにNIMを変更します。いくつかのPSCライン（特別なLY IPSC）、あまり効率的柱状細胞を形成することができる。この問題が発生した場合、ステージ2の間のBMPおよびTGF阻害剤（2μMでDorsomorphin 29、SB431542 19）の添加が役立つことがあります。 </li><li>日14から17の周りに、円柱状の細胞がよりコンパクトに表示されます。時には、これらの細胞は内部に見えるルーメンと尾根や環を形成する。円柱状の形態に加えて、この段階での細胞は、このようなPAX6とSOX1 12,26として神経上皮マーカーを発現する。 </li><li>分離を開始する前に、1は最初に存在する任意の非神経上皮細胞があるかどうかを判断するために細胞を調べなければなりません。客観的マーカーは、非上皮コロニーを示すために利用することができます。これらは、その後ピペットチップでそれらを掻き落として除去することができます。 </li></ol> 3。終脳前駆細胞の生成（D17-D24） <ol><li>コロニーの中心は神経上皮細胞が含まれており、植民地の他の部分から隔離されるべきである。これは、使用して行うことができますマイクロピペットと滅菌1mlをピペットチップを濾過した。圧力少量のコロニーの中心部に適用されると、それは一般的に極めて容易にオフに持ち上げる。コロニーの外側部分が同様に切り離すことができないように慎重になる。センターでは、頑固なされているし、自分で抜けない場合は、無菌フードで顕微鏡下で針を使用してそれらを切り出すことにより削除することができます。 2分間、200×gで15 mlのチューブとスピンにコロニーの中心部分を転送します。 </li><li>培地を細胞から吸引されるべきである。 （ビタミン、1:50なし）B27の添加によりNIMの10ミリリットルを含むT25フラスコを処理した細胞の価値がある二つのプレートは、その後、非組織培養に転送することができます。細胞の1プレート当たり培地の5〜10 mlを使用します。 </li><li>細胞は翌日見たときに、彼らは外見のような球を持っている必要があります。それはしばしば末梢細胞であるとして、それは新しいフラスコ（NIMとB27の存在下で、午前1時50分）に、これらの細胞を移すことが必要であるでこっそりとフラスコの底に付着している。 </li><li>ニューロスフィアは、その後B27（1:50）を補っNIMを使用して一週間の浮遊培養しなければならない。セルの耐久性を促進し、増殖、サイクリックAMP（cAMP、1μM）と同様にインスリン成長因子（IGF-1、10 ng / ml）をするために、懸濁培養中の培地に添加することができる。この時点では、ニューロスフィアは、終脳前駆細胞が含まれている（FOXG1 +）と最終分化のためにカバースリップ上に播種する準備が整いました。 </li></ol> 4。終脳のニューロン（D25 +）にさらに分化<ol><li><ol class="ualpha"><li>細胞をメッキするpoly-ornithine/lamininコーティングされたカバーガラス（24ウェルプレート中）を用意します。カバーガラスを最初にクリーニングされ、その後、策略-オルニチン（0.1 mg / mlの、37℃、O / N、および冷凍庫に保存されている）でコーティングされています。 ポリオルニチンコーティング： <ol><li>カバースリップを滅菌：のカバーガラスを置き硝酸の入ったビーカー、優しく1時間ドラフト内で振る。 、硝酸を注ぐDI水で数回すすぎ、少なくとも15分間のDI流水でカバースリップのままにしておきます。 95％エタノールでカバーガラスを置き、どちらのRTで30分間（直ちに使用している場合）またはエタノールの店のために振る。 </li><li>無菌フードでは、6ウェルプレートのふたに滅菌カバースリップを含む50 mlチューブの中身を注ぐ。滅菌ピンセットを用いて、一度に1つのカバーグラスをピックアップし、24ウェルプレートの1ウェル内に立設。各ウェルにカバースリップを持つように繰り返します。 </li><li>カバースリップは各ウェルでフラット落ちているまで、彼らが完全に乾いた後、プレートをタップします。次の各カバースリップにポリオルニチンμlの100を（滅菌のdH 2 Oで0.1 mg / ml）を追加し、37℃でプレートO / Nをインキュベート℃に</li><li>翌日、インキュベーターからプレートを取り外し、それらを室温まで冷まします。 （tの端から各カバースリップのオフポリオルニチンアスピレート彼カバースリップ）は、プロセス内のカバーガラスに触れたり、傷を付けないことを確認して。カバーガラスは、洗濯前に約30分間乾燥させます。 </li><li>各ウェルに1 mlの滅菌dH 2 Oを追加し、10分間放置し、各ウェルから水を吸引。この洗浄工程を2回繰り返します。プレートが完全に乾燥した後、（休業はフードでオフカバー）アルミホイルで覆い、上にふたを置き、-20℃で保存する</li></ol></li><li><ol><li>ラミニンでコートしたカバーガラスをして、唯一のカバースリップ自体を（触れる液体を持つように注意しながら、各ポリオルニチン扱わカバースリップに神経分化培地およびラミニン（20μg/ mlの最終濃度）の混合物50μlを加えるとこぼしていないオフ）。添付ファイル用の細胞を準備する前に1〜2時間37℃でそれらをインキュベートする。 </li></ol></li></ol></li><li> 15mlチューブで2分間200 xgでニューロスフィアを収集し、遠心分離する。上清を吸引。 </li> &lt;LI&gt; <ol class="ualpha"><li> DMEM-F12で細胞を洗浄し、再び細胞を遠心分離する。ニューロスが正しくアタッチするには大きすぎる場合は、この段階でAccutaseと解離させることができる。 </li><li> Accutaseを使用する場合と：DMEM-F12で細胞を洗浄した後、ニューロスフェアはAccutase（約2ミリリットル）を加え、3分間37℃で細胞をインキュベートすることにより、小さなクラスターに解離する。次に、トリプシンインヒビター（〜2ミリリットル）の同量を追加し、3分間200 xgで細胞を遠心分離します。次いで、細胞を、NDMに再懸濁し、P200のピペットを用いて分割する必要があります。小さなクラスターは、その後、予め被覆カバーガラス上にめっきすることができる。 </li></ol></li><li>媒体の大半を吸引し、それらを選択すると、より簡単になるように培地に数滴6cmのシャーレ上にセルを配置する。各プレコーティングされたカバースリップに約4-5ニューロスフェアを追加します。第一ラミニンを吸引する必要はありません。 </li><li>ニューロスフィアは、少なくとも2〜4時間のために添付しましょう​​。かつて彼らは持っているよくttached、もっと培地（0.5ミリリットル/カバースリップ）を追加する必要があります。それは、神経B27（1:50）を補充した分化培地は、cAMP（1μM）、および神経栄養因子（BDNF、GDNF、およびIGF、すべてのng / mlで10℃）で構成する必要があります。この時点で、培地の半分は一日おきに変更することができ、これらの細胞は数ヶ月の間維持することができる。 </li></ol>

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	<li>Takahashi, K., Tanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+specification+in+the+spinal+cord:+inductive+signals+and+transcriptional+codes.">Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes.</a> Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).</li><li>Wilson, S. I., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction:+toward+a+unifying+mechanism.">Neural induction: toward a unifying mechanism.</a> Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).</li><li>Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells.">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).</li><li>Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).</li><li>Singh Roy, N., Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer-specified+GFP-based+FACS+purification+of+human+spinal+motor+neurons+from+embryonic+stem+cells.">Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).</li><li>Lee, H., Shamy, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+motoneurons.">Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons.</a> Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).</li><li>Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).</li><li>Li, X. J., Du, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li><li>Perrier, A. L., Tabar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).</li><li>Roy, N. S., Cleren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes.">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).</li><li>Yan, Y., Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+dopaminergic+neuronal+subtypes+from+human+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 781-790 (2005).</li><li>Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).</li><li>Osakada, F., Ikeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse,+monkey+and+human+embryonic+stem+cells.">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li><li>Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+neurons+and+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).</li><li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li><li>Chambers, S. M., Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).</li><li>Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity.">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li><li>Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+embryonic+forebrain.">Patterning of the embryonic forebrain.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).</li><li>Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+in+glutamatergic+neurogenesis:+conserved+programs+in+neocortex,+cerebellum,+and+adult+hippocampus.">Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus.</a> Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).</li><li>Watanabe, K., Kamiya, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).</li><li>Watanabe, K., Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage.">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li><li>Li, X. J., Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells.">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136, 4055-4063 (2009).</li><li>Zeng, H., Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5, e11853 (2010).</li><li>Kim, D. S., Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity.">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).</li><li>Zhang, X., Huang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6+is+a+human+neuroectoderm+cell+fate+determinant.">Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant.</a> Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).</li><li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+patterning+of+the+central+nervous+system:+how+many+organizers.">Initial patterning of the central nervous system: how many organizers.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).</li><li>Ma, L., Hu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+GABA+neurons+correct+locomotion+deficits+in+quinolinic+acid-lesioned+mice.">Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).</li><li>Li, W., Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li><li>Lowry, W. E., Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts.">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li><li>Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons.">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li><li>Ebert, A. D., Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient.">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li><li>Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li><li>Park, I. H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li><li>Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+models+of+the+genomic+imprinting+disorders+Angelman+and+Prader-Willi+syndromes.">Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).</li><li>Kiskinis, E., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+the+clinical+application+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells.">Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).</li><li>Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1+L166P+mutant+human+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+exhibit+partial+loss+of+gamma-secretase+activity+in+endogenous+amyloid-beta+generation.">Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation.</a> Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).</li><li>Walsh, R. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Rett+syndrome+with+stem+cells.">Modeling Rett syndrome with stem cells.</a> Cell. 143, 499-500 (2010).</li><li>Egawa, N., Kitaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Screening+for+ALS+Using+Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates.">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).</li></ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

神経分化プロセスの間に、いくつかの重要なステップがあります。そうでなければ細胞はすでに非神経系統になってきに偏っている可能性があるため、人間のPSCが多能性であることを確認することが重要です。これは、あるOct4、Sox2は、Nanog遺伝子、及びTRA-1-60 1から3のように多能性マーカーに対する抗体を用いた人間のPSCを染色することによって確認することができます。人間のPSC?...

ヒト胚性幹細胞（hESC）や人工多能性幹細胞（性IPSC）の両方を含む、ヒト多能性幹細胞（PSCの）、1-3ニューロンを含む体のあらゆる細胞の種類を生成する能力を持っている。人間のPSCからの様々な神経細胞サブタイプの監督の分化は、再生医療におけるこれらの細胞のアプリケーションのための鍵を握っている。開発中の機能的なニューロンのサブタイプの世代は、神経系統の誘導、rostro -尾軸に沿った地域の前駆体の仕様、および4,5地域の前駆細胞から有糸分裂後ニューロンタイプの分化を伴う複雑なプロセスである。 2001年以降、いくつかのシステムは、ニューロンのサブタイプ6,7の次の世代のためのプラットフォームを提供してきたヒトES細胞から神経系統を生成するために設立されました。発達の原理、そのような脊髄の運動ニューロン8-12、中脳DOPのようないくつかのニューロンタイプに基づいアミン作用性のニューロン13から15、および神経網膜細胞16,17を効率的に人間のPSCから指定されています。これは、 生体内で開発中にこれらのニューロンタイプの仕様のために重要である重要なモルフォゲンを適用することによって行われていた。他のプロトコルはまた、分化21を促進するためにこのような小さな分子として、または他の種類の細胞と共培養することにより、追加の要因18から20のいずれかを使用して、神経細胞にヒトES細胞の分化を促進するために開発されている。 人間の大脳新皮質は、高度に発達し、学習、記憶、認知機能22,23において重要な役割を果たしているグルタミン酸作動性ニューロンを含む多くの種類の細胞が含まれています。培養中のグルタミン酸作動性ニューロンを生成するための最初のステップは終脳前駆細胞を指定することです。芳樹さんのグループは、第一の無血清サスペンシオを使ってマウスのESC（​​mESCs）から終脳前駆体の分化を指示報告n個のDKK1の存在下で培養（Wntシグナル伝達を阻害する）、ならびにLeftyA（Nodalシグナル伝達を阻害する）24。その後、自験例を含め、いくつかのグループはまた、無血清培地中で25から27までの人間のPSCから終脳前駆体の仕様を報告している。人間のPSCから終脳前駆体の生成は、外因性のモルフォゲンの使用を必要としないと、これらの前駆体を生成するのに効率がmESCs 26,27からのそれよりはるかに高いです。ここでは、よくZhangさんのグループ7によって確立された神経誘導のために化学的に定義されたシステムが記載されている。外因caudalizing因子の添加なしで、このプロトコルは、効率的に人間のPSC 27日から終脳前駆体を生成します。これらの前駆細胞は、その後、Wntとソニックヘッジホッグ（Shh）のシグナル伝達を調節することにより、背や腹前駆細胞に分化させることができる。背前駆細胞はさらに、グルタミン酸作動性ニューロンに分化することができる電子fficiently 27。また、このプロトコルはまた、作用機序、ならびに疾患の大規模な配列のための潜在的な治療法を模索するために利用することができる患者固有ニューロンの生成を可能にする人間性IPSC 28日からのグルタミン酸作動性ニューロンの生成に適しています。また、我々のシステムはまた、終脳の多様なニューロンタイプの開発と仕様を探るためのプラットフォームを提供します。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td>Supplier</td>
			<td>Catalog #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1140-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (14.3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>116K5103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (human)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-6274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17104-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxg1 antibody</td>
			<td>Dr. Y. Sasai</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoxb4 antibody (1:50)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>I12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6 antibody (1:5000)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>PAX6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nkx2.1 antibody (1:200)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB5460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr1 antibody (1:2000)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGLUT1 antibody (1:100)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>450-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>450-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin growth factor 1 (IGF1)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>100-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic AMP (cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-0260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic hedgehog (SHH)</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>1845-SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>352098</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks (untreated)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks (untreated)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Chemiglass Life Sciences</td>
			<td>1760-012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>BD</td>
			<td>353004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9'' glass pipetes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip filters (0.22 &mu;M)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup filters 1,000 ml (0.22 &mu;M)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope (Observer A1)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>R2625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood (Sterilgard III Advance)</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5702 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells

ここでは、効率的にヒト多能性幹細胞（PSCの）から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンを生成するための段階的な手順が記載されている。分化過程は、細胞が浮遊培養に置かれたときに凝集体を形成するために切り上げ塊に人間のPSCを壊すことによって開始されます。凝集体は、その後自発的分化を可能にするために日1月4日からのhESC培地で栽培されています。この間、細胞は三胚葉のいずれかになるための能力を持っている。日5月8日から、細胞は、神経系統にプッシュした神経誘導培地に置かれます。 8日目ごろ、細胞を6ウェルプレートに取り付け、その間神経上皮細胞の形の間を区別するために許可されています。これらの神経上皮細胞は、17日目に単離することができる。彼らはカバースリップ上に播種できるようになるまで細胞はその後ニューロスフェアとして保持することができる。任意caudalizing要因なしに基本的な培地を用いて、神経上皮細胞はspecifieアールその後、さらに効率的に背側終脳前駆細胞とグルタミン酸作動性神経細胞に分化させることができる終脳前駆体にD。全体的に、我々のシステムは、これらのニューロンの開発とそれらに影響を与える疾患を研究する研究者のための人間のグルタミン酸作動性ニューロンを生成するためのツールを提供しています。

ここでは、いくつかの重要な工程を経て終グルタミン酸作動性ニューロンへの人間のPSCを区別するために、プロトコル：終脳のニューロンへのPSC凝集体の形成、神経上皮細胞の誘導、終脳前駆細胞の生成、およびこれらの前駆細胞の最終分化（ 図1）があります記載されて。このシステムは、終脳前駆細胞とグルタミン酸作動性ニューロンの生成に堅牢かつ効率的です。例（ <stro...

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The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

この手順では、人間の発達の間に観察されるものと類似しているチェックポイントを通過することによって終脳のニューロンを生成します。細胞は、自発的に区別するために許可されている神経系統に向かってそれらをプッシュする要因にさらされて、分離され、最終分化と成熟を可能にするためにカバーガラス上にメッキが施されています。

ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

the-specification-telencephalic-glutamatergic-neurons-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.8K ビュー.  The University of Connecticut Health Center. この手順では、人間の発達の間に観察されるものと類似しているチェックポイントを通過することによって終脳のニューロンを生成します。細胞は、自発的に区別するために許可されている神経系統に向かってそれらをプッシュする要因にさらされて、分離され、最終分化と成熟を可能にするためにカバーガラス上にメッキが施されています。

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Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

神経科学

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

ひと成人皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞の高収率文化の生成の単純です

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human neurons, which may contribute to neurodegeneration in various disease states. Although it is challenging to examine mitochondrial dynamics in live human nerves, such paradigms are critical for studying the role of mitochondria in neurodegeneration. Described here is a protocol for analyzing mitochondrial transport and mitochondrial morphology in forebrain neuron axons derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). The iPSCs are differentiated into telencephalic glutamatergic neurons using well-established methods. Mitochondria of the neurons are stained with MitoTracker CMXRos, and mitochondrial movement within the axons are captured using a live-cell imaging microscope equipped with an incubator for cell culture. Time-lapse images are analyzed using software with &#34;MultiKymograph&#34;, &#34;Bioformat importer&#34;, and &#34;Macros&#34; plugins. Kymographs of mitochondrial transport are generated, and average mitochondrial velocity in the anterograde and retrograde directions is read from the kymograph. Regarding mitochondrial morphology analysis, mitochondrial length, area, and aspect ratio are obtained using the ImageJ. In summary, this protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology to facilitate studies of neurodegenerative diseases.

Impaired mitochondrial transport and morphology are involved in various neurodegenerative diseases. The presented protocol uses induced pluripotent stem cell-derived forebrain neurons to assess mitochondrial transport and morphology in hereditary spastic paraplegia. This protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology, which will facilitate the study of neurodegenerative disease.

遺伝性痙性対麻痺におけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態学の解析

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

多能性幹細胞からのヒト神経細胞および希突起膠細胞の作製によるニューロン-希突起膠細胞相互作用のモデル化

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...