私達は私達の株を送信するための教授平岡に感謝。我々は、ゴランGustafssons財団とスウェーデンの癌協会（939分の2008）からの支援を認める。

1。分裂酵母の培養<ol><li>エディンバラ最少培地（EMM）を準備し、塩化アンモニウムのないEMM（EMM - N）8。自家蛍光グルコース溶液を減らすためにオートクレーブしてはいけませんが、代わりにフィルタし、その後オートクレーブメディアに追加さ0.2μmのを使用して滅菌フィルター。 </li><li>新鮮な濾過滅菌グルコースとEMM液体培地3mlに、8 YEA、リッチメディアと寒天プレート上に成長した分裂酵母の細胞を接種する。軽く細胞の十分な換気を確保するためにキャップをプッシュで13mLチューブを使用してください。細胞は30で225回転でそれらを揺することによって成長しましょう​​℃に適切な希釈、毎朝と夕方に続いてBurkerチャンバーを使用して、それらをカウントすることにより、 - （2 × 10 7細胞/ mLの1 × 10 6）2日間細胞は対数増殖期に成長しておいてください。 </li><li>実験の日に早期対数増殖期、5で細胞を持っていることを確認してくださいX 10 6 - 1 × 10 7細胞/ mLの。 </li><li> tを飢えへEMMメディアからEMM - Nのメディアへの切り替え20分間の間に窒素のための彼の細胞。これは、分裂酵母9のストレス応答を誘発する可能性が速い速度での遠心分離のように最大1.5 rcfで、ベンチトップ遠心分離機で1.5mlのエッペンドルフチューブに細胞を3mlのを収穫することによって行われます。ダブル紡績技術、意味が使用する、2分間の最初のスピンを、次にエッペンドルフチューブ180 °回転し、1.5 RCF 2分10秒間再びスピン。これはチューブの底に一つペレット内のすべての細胞を回収するのに役立ちます。 EMM - Nで1回洗浄し、EMM - Nでペレットを溶解し、30℃で15分間細胞をインキュベート℃で225 rpmで振盪し、次に2を指すように続ける。サンプルの準備。 </li></ol> 2。サンプルの準備<ol><li>速い速度で遠心分離などの収穫最大1.5 rcfで、ベンチトップ遠心分離機で1.5mlのエッペンドルフチューブに細胞を1.5 mLのは、分裂酵母9のストレス応答を誘発するかもしれない。ダブル紡績技術、meaniを使用NG、2分間の最初のスピンは、その後、エッペンドルフチューブ180 °回転し、2分10 1.5 RCFのために再びスピン。これはチューブの底に一つペレット内のすべての細胞を回収するのに役立ちます。 </li><li>上清を取り除くが、10から15μLを残し、残りのメディアに細胞を懸濁します。また、細胞ペレットを再懸濁させる新鮮な培地の10μLを加える。 </li><li>透明なガラススライドとカバーガラス（無1.5）を持っていることを確認してください。通常は、それらをクリーンアップする必要がありますが、それらが塵のフルではないことを確認していない。 </li><li>冷凍庫からフィルター滅菌されています1mg/mLレクチンのストック溶液のアリコートを取り出してください。レクチン溶液は数回再凍結することができます。レクチンは、カバーガラスで酵母細胞を固定するために使用されます。 </li><li>客観的なガラス上で濾過滅菌グルコースとEMMの代わりに5μL。 </li><li>カバーガラスの隅にあるレクチン溶液5μLを置きます。その後、レクチンドロップで同じコーナー、すなわち、細胞培養の5μLを配置。その後数回ピペッティングしてミックスがピペットの先端の長い側を使用して、カバーガラスを通して細胞培養レクチンミックスを広げる。あなたの細胞混合物の密度に応じてすべてのものを残したり、カバーガラスの反対側の隅にある余分な液体を吸い上げる。 </li><li>客観的なガラスとベンチで反対側の片側で、上のトップ、カバーガラスを置きます。カバーガラスは、数分間少し乾かします。それは絶対に完全に乾燥させてはならないが、それはあまりにも多くの液体ガラス上であってはならない。 </li><li> EMMのドロップによる客観的なガラスからおおよそ70 °の天使とカバーガラスを置きます。それはEMMのドロップにトップダウン落下するように、カバーガラスを放す。 </li><li>シリコングリースとの縁をシールすると、2 mLの注射器を準備する。 200μlの先端の広い方の端をカットして注射器に添付します。シリコングリスの約1 mLの注射器を埋める。シリコンの微細な線を穏やかに膿がカバーガラスの端に適用されます興注射器のピストン。今、あなたはS.の小さな成長チャンバーを持っている分裂酵母細胞。 </li></ol> 3。顕微鏡検査<ol><li>水銀/キセノンランプ、顕微鏡とコンピュータをオンにして蛍光顕微鏡を初期化する。蛍光顕微鏡で酵母の成長室を置きます。 63 ×対物レンズまたはNA = 1.3以上で100 Xの目標を使用してください。油浸対物が使用されている場合は、オイルを追加。 </li><li>セルを検索し、シャープな画像を得るために明るいフィールドを使用してください。 </li><li>蛍光顕微鏡の設定は、酵母細胞と顕微鏡を標識するために使用される蛍光色素によって異なります。我々は、16ラインの平均平面スキャン設定とプラン - アポクロマート63x油浸対物レンズ（NA = 1.4）との共焦点顕微鏡ツァイスLSM 700レーザー走査型顕微鏡を使用してください。ピンホールは、0.8 mmの光学的スライスを与える1から1.1エアリーユニット、に設定する必要があります。我々は、このようにD 582 nmのビームスプリッタでアレクサ488用のフィルタセットを使用して、トラック1にGFPを検出488と582 nmの間の波長をetecting。トラック2に我々は、578と600nmの波長を検出するので、578 nmのビームスプリッタを使用してmCherryに最適なフィルターセットを使用してください。これは、トラック2にMRFP（SPB）とNM（mCherry）の両方が検出されることを意味します。 </li><li>多くの写真がそれぞれの株について60種類の細胞で測定できるように、必要に応じてかかります。通常、独立した顕微鏡の分野の15枚は十分です。それは、顕微鏡の時間が60分を超過した場合、新鮮な細胞を用いた新たな成長チャンバーが行われることをお勧めします。 </li></ol> 4。細胞内の距離の定量的測定<ol><li>ツァイス禅ライト版のプログラムで画像を開きます。測定ツールの測定のすべての信号が同じ焦点面内にあるすべてのセルに異なる蛍光色素間程度の距離を使用する。蛍光シグナルの中心を識別するために、光強度とコントラストを調整します。この簡略化されたプロトコルは、2つだけ異なるcを使用していますolours、したがって、SPBとNMは、同じチャネルになります。 SPBは、NMで、その大きな丸い構造によって選び出されます。メモ帳のシートまでの距離を転送する。少なくとも60細胞で測定します。このようなImageJのような他のプログラムにも距離を測定するために使用することができるが、ツァイス禅のライトは、その高い画像の解像度と、そのプログラムを使用してズームインおよびズームアウトする使いやすさのために好ましい。 ImageJの年にオープンLSM形式の画像はお互いの上に二つのチャンネルを持つことになります。両方のチャンネルを持つ画像を作成するには、最初の2つのチャンネルを分割し、その後、それらをマージする。その後ラインツ​​ールは、前述のように距離を測定するために使用することができます。 </li><li> SigmaStat - 3.5ソフトウェアを使用して、例えばt検定またはMann - Whitneyの順位和検定、例えば、統計的なプログラムを使用して、異なる菌株と両群間の平均または中央値細胞内の距離を比較する。短い持つセルの選択があるだろうので、頻繁にデータが正常に配布されていませんすべての信号からの蛍光信号間の距離を測定すると同じ焦点面にある必要があります。マン-ホイットニー順位和検定は、正規分布を欠いているデータセットの比較を可能にしながら、データが正規分布しているときに、t検定にのみ使用できます。マン-ホイットニー順位和検定で中央値が比較されている間t検定では二つの異なるデータセットの平均値が比較されます。 </li></ol> 5。代表的な結果ひずみPJ1185：（H + his7 +：：dis1placR - GFP塩基番号[：：ura4 + hphMX6 lacO] sid4 - MRFP：：kanMX6 cut11 - mCherry：：natMX6 ura4 - D18 leu1 - 32 ade6 - DN / N）が EMMに成長させた。サンプルを取り出し、小さな成長チャンバーと絵に取り付け（図1A + N）採取した。その後、増殖培地は、EMM W / O塩化アンモニウム（EMM - N）に置き換え、そして細胞はgであったれました振盪しながら15分間rown。飢餓状態の細胞をEMM - Nと映像との成長チャンバーにマウントされた窒素は、（図1A - N）を採取した。測定ツールは、遺伝子座（GFP）とSPB（図1Bおよび表1）の間の距離を測定するために使用されていました。さらに、遺伝子座（GFP）とNM間の距離は、（図1Bおよび表2）を測定した。窒素の枯渇の前と後の中央値は細胞内の距離は、SigmaStat - 3.5ソフトウェア（表3）を用いて比較した。 SBPに向かってNMから離れて移動する遺伝子クラスターの局在において統計的に有意な変化があった。 GFPとSBPの間の距離を測定するデータはt -検定（表1と3）を使って比較できるので、正規分布と平均距離（1.777μmの+ Nと1587μmの- N）を有していた。 2つの平均値（P = 0.008、t検定）との間に有意差があった。 GFPとNM間の距離を測定するデータは、通常のディを持っていなかったstribution従って中央値の距離は（0μmの+ Nおよび0.390μmの- N）のMann - Whitney順位和検定（表2および3）を用いて比較した。 two中央値（P &lt;0.001、Mann - Whitneyの順位和検定）との間に有意差があった。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" /> 図1 GFPでマークされた塩基番号という名前の遺伝子のクラスターの局在は、窒素飢餓後に変更。 （A）左列、+ N、EMM右側の列で育った細胞、- N、EMM - Nに生育細胞から代表的な細胞核からの代表的な細胞核。グリーンが塩基番号クラスタのラベル付けGFPのシグナルである、赤はそれぞれ、SPBとNMをラベリングMRFPとmCherryです。 （B）同一細胞の核として（A）が、現在測定された核内の距離で、黄色：細胞核の直径は、青色：SPBとGFPシグナルとピンクの間の距離：GFPのシグナルと核膜の間の距離。 <pクラス=&quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg" /> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" /> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" /> 表1。EMMで育ったPJ1185ひずみの程度で測定された核内の距離。最初の行、セルの直径（D）、2行目、GFPとSPB、3行目の間の距離、GFPとNM間の距離。 <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" /> <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" /> <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" /> 表2。EMM - Nで栽培さPJ1185ひずみの程度で測定された核内の距離。最初の行、セルの直径（D）、2行目、GFPとSPB、3行目の間の距離、GFPとNM間の距離。 <imgALT =&quot;表3&quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/3454/3454table3.jpg&quot;/&gt; 表3。歪みPJ1185で観測された核内の距離の記述統計量の窒素飢餓の前に（+ N）と（- N）の後。最初の行：測定されたセルの数、2行目：平均直径（D）、3行目：中位径（D）、など行：GFPとSPB、番目の行の間の距離を意味する：GFPとNMとの間の中央値の距離。

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我々は、開示することは何もない。

過去10年間中に携帯電話のイベントを監視するための生細胞イメージングの使用は、ますます人気となっている。それはクラゲオワンクラゲから緑色蛍光タンパク質の使用を開始し、現在多くの異なる蛍光色素は、シアン（475 nm）から遠赤（648 nm）を11に幅広いスペクトルを介して発光蛍光ご利用いただけます。免疫上の生細胞イメージングの大きな利点の一つは、細胞がそれ故に固定のプロセスから可能なアーチファクトを避けること、顕微鏡の前にホルムアルデヒドやエタノール/アセトン処理により固定されていないということです。さらに、生細胞イメージングでは、個々のセルを追跡し、携帯電話のイベント12の動画を取得することが可能となり、インキュベーションの数時間または数日中に頻繁な間隔で写真を撮るために可能性を提供しています。哺乳動物細胞は、約3〜4＆の直径を小さく酵母細胞に比べ、約100μmの直径で、大きいサイズを有するという利点を持っているムー、M.一方、酵母の利点は、操作が簡単なゲノムである。相同組換えが酵母で非常に効率的に発生し、異なる蛍光色素3に目的のタンパク質を融合するために使用されます。また、lacOシーケンスとLacR - GFPタンパク質のその後の発現の標的との統合を使用すると、細胞核2内のゲノムの特定の部分の検出を可能にする。 S.の使い方彼らは低コストの細胞の培養条件での高速生成時間とともに成長する自然な単細胞生物なので、顕微鏡での分裂酵母細胞は、追加の利点があります。また、S.分裂酵母は、後生動物の相同遺伝子を持っているので、優れた真核生物のモデル生物です。 この手法の主要な限界の一つは、真の信号の検出を妨害する酵母細胞における自家蛍光である。この問題は、代わりにオートクレーブのフィルター滅菌グルコースと最小限の増殖培地を使用することで解決できます。のさらに、酵母細胞は、それらをマウントする前に、ログフェーズで2日間増殖されるべきである。ここで紹介するプロトコルは、酵母細胞内のタンパク質の細胞内局在を決定するために比較的単純な、まだ定量的な方法を提供しています。また、異なる時点で写真を撮ることによって我々は携帯電話のイベントを続けることができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/装置の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>レクチン</td><td>シグマ</td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td>シリコングリース</td><td>ダウコーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査顕微鏡 LSM 700 </td><td>ツァイス</td><td> LSM 700 </td><td>他の共焦点顕微鏡を使用することができる。 </td></tr><tr><td> SigmaStat 3.5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3.5 </td><td>統計分析のための任意のソフトウェアを使用することができる。 </td></tr></tbody></table>

quantitative live cell fluorescence-microscopy analysis of fission yeast

いくつかの顕微鏡技術は、細胞内の特定のタンパク質を検出することができる、今日利用可能です。過去10年間の間に直接、目的のタンパク質に接続された緑色蛍光タンパク質（GFP）のような蛍光色素を用いた生細胞のイメージングは、1人気が高まっています。 GFPと同様の蛍光色素を用いてタンパク質の細胞内ローカライゼーションと動きを蛍光顕微鏡で検出することができます。また、また、染色体の特定の領域の核内局在性は、この手法を用いて研究することができます。 GFPは、Lacリプレッサータンパク質（LacR）に融合させ、異所的lacO配列のタンデムリピートが染色体2上の関心領域に挿入されている細胞内で発現されています。 LacR - GFPは、lacOの繰り返しにバインドされ、ゲノムのその領域は、蛍光顕微鏡で緑色のドットとして表示されます。酵母は、特に相同ので、このタイプの操作に適しています組換えは、非常に効率的であり、それによってlacOを繰り返すとGFP 3人工融合タンパク質の標的を統合することができます。ここでは、分裂酵母の生細胞解析のための定量的な方法を説明します。分裂酵母の生細胞解析のための追加のプロトコルは、減数分裂の染色体の行動の4のムービーを作成する方法の例については、見つけることができます。この特定の実験では核内の組織とそれがどのように遺伝子の誘導中に影響を受けているに焦点を当てる。我々は、遺伝子の近傍にlacO結合部位を導入することにより、塩基番号という名前の遺伝子クラスターを、、ラベルを貼っている。遺伝子クラスターは、分裂酵母5の窒素飢餓時に早期に誘導される遺伝子を濃縮される。株では核膜（NM）が赤色蛍光シグナルを生じさせるNMタンパク質Cut11にmCherryを接続してラベルが付けられます。紡錘体極体（SPB）化合物Sid4は、赤色蛍光タンパク質（Sid4 - MRFP）6に融合させる</s上&gt;。栄養成長している酵母細胞では動原体は常にNM 7に埋め込 ​​まれているSPBに添付されています。 SPBは、NMの大きな丸い構造として識別されます。前の画像と20分窒素源の枯渇後に我々は、遺伝子クラスター（GFP）とNM / SPBの間の距離を決定することができます。窒素の枯渇の前と後の平均値や中央値の距離が比較され、我々は、このように窒素の枯渇後の遺伝子クラスターの細胞内局在の変化があるか否かを定量化することができます。

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Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

分裂酵母、<em&gt;シゾサッカロマイセスポンベ</em&gt;、基本的な細胞プロセスを研究する良いモデルシステムです。ここでは、分裂酵母の定量的な生細胞の解析を実行する方法を説明します。この特定の実験では細胞核内でゲノムの組織に焦点を当てるが、この方法はまた、細胞質因子を研究するために使用することができます。

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

quantitative-live-cell-fluorescence-microscopy-analysis-fission

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K ビュー.  University of Uppsala. 分裂酵母、シゾサッカロマイセスポンベ、基本的な細胞プロセスを研究する良いモデルシステムです。ここでは、分裂酵母の定量的な生細胞の解析を実行する方法を説明します。この特定の実験では細胞核内でゲノムの組織に焦点を当てるが、この方法はまた、細胞質因子を研究するために使用することができます。

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

生物学

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

定量的なフィットネスの分析ワークフロー

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

分裂酵母における細胞質分裂のイベントの時空間解析

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...