この作品は、健康グラントDK083327、及びDK093491（SZHまで）の国立研究所によってサポートされていました。

1。カルシウムイメージングの準備膵臓腺房細胞<ol><li> 20mMのHEPES、95 mMの塩化ナトリウム、4.7のKCl、0.6mMのMgCl 2を 、1.3 mMのCaCl 2を、10 mMグルコース、2mMグルタミン、および1×最小イーグル培地非必須アミノ酸を含有するHEPESインキュベーションバッファーを調製する。 NaOHでpHを7.4への最終的な解決策を調整します。 </li><li> HEPESインキュベーション緩衝液（上記）25 mlにBSA（1％w / vの最終的な）の添加によりBSAインキュベーションバッファーを調製する。 </li><li> 1.1 mg / mlの（200単位/ ml）のBSAのインキュベーション緩衝液（上記）を6mlのタイプ4のコラゲナーゼおよび1 mg / mlの大豆トリプシンインヒビターを添加することによりコラゲナーゼ消化緩衝液を調製する。 </li><li>二つの部分HNO 3と2時間の一部HCl中に浸漬することにより、酸洗浄22x22のmmのカバースリップ。次いで、70％エタノールでDI水とストアを使用してデカント。 </li><li> CO 2窒息により1マウスを安楽死させる。オリエント仰臥位、動物、そしてCLEによって腹部の表面を準備70％エタノールでaning。腹腔を公開する開腹術を行います。膵臓を解剖するとすぐにコラゲナーゼ消化バッファの6ミリリットルを含む小さな量るボートにすすいでください。 </li><li>脂肪や目に見える血管のいずれかの大規模な作品を離れて解剖し、コラゲナーゼ消化緩衝液5mlを除去し、15 mlコニカルチューブに戻ってそれを追加します。 </li><li>細かい解剖はさみを使用すると、コラゲナーゼ消化緩衝液1mlを含む小さな計量ボートに膵臓をミンチ。得られた溶液が均一に分散されるまでミンチ。 </li><li> 125ミリリットルの三角プラスチックフラスコにひき肉製品を移し、コンテナにコラゲナーゼ消化バッファの残りの5 mlを加える。組織が完全にバッファーに沈めていることを確認します。 </li><li> 37℃の水浴中でフラスコを置き、30分間90 rpmで振る。ダウンタイムのこの短い期間の間に、カルシウム活性化アゴニスト（ 例えばセルレイン、カルバコール）を調製し、22x22のmmの酸洗浄カバーをすすぐDI水でスリップ。乾燥した後、実験室の膜で裏打ち平らな面の上に置きます。 </li><li> 30分のダイジェストが完了した後15 mlコニカルチューブに戻って懸濁液を転送し、細胞が沈降することができます。慎重にコラゲナーゼ消化バッファーをピペットBSAインキュベーションバッファー6mlのと交換してください。精力的に小さいクラスターに細胞を分散させるために10秒間手でチューブを振る。すぐに揺れにより、不安定なメディアから任意の大規模な、浮遊ゴミを取り除く。 </li><li>残りの細胞が落ち着く、と新鮮なBSAのインキュベーションバッファーでメディアを交換することができます。 </li><li>懸濁液は肉眼だけ細かく見えるだけ小さなクラスターで構成されるまで、二回1.11を繰り返します。細胞は、 図1A（一番上の行）に描かれたもののようになります。 </li><li> BSAのインキュベーションバッファーを削除し、HEPESインキュベーションバッファーと交換してください。 </li><li> 750μM、10％DMSO中フルオ-4AMの100X株式を準備します。 </li><li>細胞懸濁液とBSAフリーHEPESインキュベーションバッファーを含む15ミリリットルコニカルチューブ内のセルをロードします。これを行うために、細胞懸濁液を原液の適切な量（1:100希釈）を追加する。各22x22のmmのカバースリップの上に、この懸濁液を次にプレートを500μl。 </li><li>室温で暗所でカバースリップを保管してください。最初のCa 2 +測定負荷後30分を取る。色素染料は、自動的に装填後30分発生した灌流を、起動時に媒体から除去される。 </li></ol> 2。膵臓腺房細胞内カルシウムの測定<ol><li> DI水で各灌流セットアップをすすぎ、バッファまたはアゴニストの適切な量で埋める。適切な流れを確保するためのバッファまたはアゴニストと総理それぞれシリンジ。リングに注射器をクランプすると、顕微鏡ステージ上約1〜2フィートに立っている。 </li><li>慎重に細胞懸濁液を含むその縁1カバースリップから把握する細かいピンセットを使用してください。カバーを傾け45°をスリップ、過剰バッファがオフに実行することができます。カバースリップの上に細胞とゴム製のガスケットの上にカバースリップを置き、室（ 図2Aおよび2B）を組み立てる。 </li><li>ステージに灌流チャンバーを固定し、チャンバー（ 図2C）の最初の入口にバッファが含まれているチューブを挿入します。シリンジ含むバッファの電源を入れ、バッファがカバースリップの表面全体に灌流することができます。バッファ室の反対側の端部に到達すると、真空入口に真空ラインを挿入する。チャンバーに沿ったそれらの適切な位置に任意の他のチューブ（アゴニストを含む、阻害剤など ）を挿入します。 </li><li> 488nmの（ 図1A、ボトム）の波長でのFluo-4AMの色素を励起するためにどちらかの200Xや400X、1.4開口客観的かつアルゴンレーザーを用いて細胞を可視化する。レーザの電力設定を調整する必要があり、そのような光電子増倍管（PMT）放出された光によって飽和していない。また、PMTの両端の電圧は最大光量検出のために最適化される必要がある。 </li><li> &gt; 515ナノメートルのロングパス発光信号が2-5秒より速く、グローバルカルシウム波（ 図3および図4）可視化のために低速振動パターンおよび0.2秒/フレームを可視化するための/フレームのフレーム速度で収集される。 </li><li>イメージングが完了した後、注射器を閉じ、すべてのチューブを取り外します。室と繰り返し2.2から2.4を分解します。 </li><li>時間と画像Jへの転送（ソフトウェアパッケージは、国立衛生研究所によってフリーウェアとして提供され、で見つけることができる上に、蛍光強度の数値などのデータを収集し<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ）。 </li><li>リアルタイム細胞の画像を表示し、関心領域（ROIを、すなわち核、基底、頂端など ） を識別</li><li>これらのROIとrのための蛍光強度を取得蛍光強度/ベースラインの蛍光強度（ すなわち F/F0）としてepresent。 </li><li> F / F 0対をプロットすることによってトレーシングを生成する時間。トレーシングに加えて、代表的な画像は、一般に擬似カラーを使用して提供され、表示される。 </li></ol> 3。細胞傷害アッセイのための膵臓腺房細胞の調製<ol><li>暖かいDMEM F-12培地（フェノールレッドなし）37℃ </li><li> DMEM F-12メディアにBSA（0.1％w / vの最終）、およびHCl（50μM最終）を追加します。 </li><li>コニカルチューブにDMEMのアリコート50ミリリットル。 </li><li>添加したDMEM F-12培地を10 mlにコラゲナーゼタイプIVの0.5 mg / mlの（12 U / ml）を加えることによりコラゲナーゼバッファを準備します。 </li><li> CO 2窒息により1マウスを安楽死させる。オリエント仰臥位、動物、70％エタノールで洗浄することにより腹部の表面を準備します。腹腔を公開する開腹術を行います。膵臓を解剖するとすぐに小さな計量ボートcですすぎコラゲナーゼバッファ6mlのをontaining。 </li><li> 3-5分間または得られた溶液を均一に分散されるまで細かい解剖ハサミを使用して組織をミンチ。 </li><li> 5分間90 rpmで振とうしながら37℃の水浴中に追加のコラゲナーゼバッファ、その後場所5mlで125ミリリットルの三角フラスコにみじん切りの組織を移す。 </li><li>シェーカーから外し、細胞は簡単に解決することができ、新鮮なコラゲナーゼ緩衝液5mlとの交流。その後、90 rpmで振とうしながら37℃の水浴中でさらに35分間インキュベートする。 </li><li>サスペンションは明らかな細胞塊を均質に表示されるまで、精力的に転送ピペットを使用してダイジェストを再懸濁します。ゆっくりコニカルフラスコにプリウェットナイロンメッシュを介して細胞懸濁液をピペッティング。 </li><li>精力的に残っているセルを強制するために、メッシュを通して新鮮DMEM F-12メディア（コラゲナーゼ付き）のさらに3ミリリットルピペット。 </li><li>別の6-10 DMEM F-12メディアのml及び追加2-3分のために解決するために、細胞をLLOW。二回、この手順を繰り返して、最終洗浄の後、上清を除去します。 </li><li> 48ウェル組織培養プレートの各ウェルに新鮮なDMEM F-12媒体、細胞を再懸濁し、細胞懸濁液のプレート500μLを加える。細胞は、図1Bに示されたもののようになります。 </li><li>プレートはアゴニストを追加する前に、5分間90 rpmで37℃の水浴中で座ることができます。 </li><li> 2-4時間アゴニストを変えて細胞を刺激する。 </li><li>細胞が落ち着くと慎重にメディアのアリコート（通常100μl）を、液体窒素でフラッシュ凍結をピペットできるように角度でプレートを傾けて。 </li><li> Flashには、残りの細胞懸濁液を凍結。フラッシュ凍結LDH測定のために必須ではない。それらは同じ日アッセイまたは長期保存のために-20°Cに格納されている場合、代替のサンプルを氷上に維持することができるように</li></ol> 4。乳酸脱水素酵素漏れを測定<ol><l主としてプロメガCytoTox 96非放射性細胞毒性アッセイキット（特定の試薬および材料の表を参照）で提供試薬および手順を使用してI&gt;測定乳酸脱水素酵素（LDH）漏出。 </li><li>アッセイ緩​​衝液（も提供）12mlを有する再構成LDH基板（キットに提供される）。 </li><li>室温で水浴中で凍結した細胞懸濁液とメディアサンプルを解凍。 </li><li> 96ウェルプレート中の各メディアサンプルの50μlのプレート。 </li><li>細胞懸濁液に、最終濃度が1×10倍となるように溶解緩衝液の必要量を加える。 60分間37℃でボルテックス簡潔とインキュベート。 </li><li>ペレット細胞の破片〜4分間、250×gで溶解したサンプルを遠心分離します。 </li><li>細胞溶解物のために、96ウェルプレートの各ウェルに10倍希釈の50μlのプレート。 </li><li>各ウェルに再構成された基板の50μlを添加し、30分間室温で暗所に静置します。 </li><li>て反応を停止させる各ウェルに停止液50μlのを（キットに付属）を追加。 </li><li> 490nmで吸光度を測定します。 </li><li> ％LDH漏れを計算するには、次の式を使用します。下記の光学濃度はよくのみを含むPBS、基板からのブランクODの読みを差し引いて修正し、ソリューションを停止している。 </li></ol>メディア=中のLDH（メディアOD492）×（メディア希釈係数）×（メディアの体積）はメディアサンプルを希釈することは通常不要であるため*、希釈係数は意志最も頻繁に一律。 合計LDH =（（ライセートOD 490）×（ライセートの希釈係数）×（細胞懸濁液中の体積））+（（メディアOD 490）×（希釈倍率）×（サンプリング用小分けメディアの体積）） <img alt="式（1）" fo:src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1.jpg" /> 5。アデノウイルスによる感染膵臓腺房細胞<ol><li>準備をするセクション3に記載されているよう膵腺房細胞。 </li><li>ステップ3.12続いて、細胞懸濁液にアデノウイルスの10 7感染単位（IFUs）を追加し、37℃で30分間インキュベート℃に</li><li> 6ウェルプレート中の細胞懸濁液の均等板2 mlであった。 </li><li>最も発現構築のために、細胞を十分に18時間以内に感染されるべきであるし、ちょうど6時間内のいくつかのルシフェラーゼコンストラクトのために。 </li></ol>

<ol>
	<li>Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+agonist-evoked+cytoplasmic+Ca2++signals+in+exocrine+acinar+cells+analysed+by+digital+image+microscopy.">Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy.</a> Embo J. 11, 1623-1629 (1992).</li><li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromolar+and+submicromolar+Ca2++spikes+regulating+distinct+cellular+functions+in+pancreatic+acinar+cells.">Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells.</a> Embo J. 16, 242-251 (1997).</li><li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ryanodine+receptor+mediates+early+zymogen+activation+in+pancreatitis.">The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).</li><li>Raraty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+enzyme+activation+and+vacuole+formation+in+the+apical+granular+region+of+pancreatic+acinar+cells.">Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13126-13131 (2000).</li><li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+mitigates+caerulein-induced+pancreatitis+in+vivo+in+mice.">Dantrolene mitigates caerulein-induced pancreatitis in vivo in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299, G196-G204 (2009).</li><li>Shah, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+Activation+during+in+vivo+Pancreatitis+is+Dependent+upon+Calcineurin+Activation.">Protease Activation during in vivo Pancreatitis is Dependent upon Calcineurin Activation.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2009).</li><li>Muili, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+and+genetic+inhibition+of+calcineurin+protects+against+carbachol-induced+pathologic+zymogen+activation+and+acinar+cell+injury.">Pharmacologic and genetic inhibition of calcineurin protects against carbachol-induced pathologic zymogen activation and acinar cell injury.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li><li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+enhances+carbachol-induced+protease+activation+and+accelerates+Ca2++waves+in+isolated+rat+pancreatic+acini.">Ethanol enhances carbachol-induced protease activation and accelerates Ca2+ waves in isolated rat pancreatic acini.</a> J. Biol. Chem. 286, 14090-14097 (2011).</li><li>Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O'Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Ca2++wave+propagation+in+pancreatic+acinar+cells.">Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 267, 18118-18121 (1992).</li><li>Reed, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+extracellular+pH+induces+damage+in+the+pancreatic+acinar+cell+by+enhancing+calcium+signaling.">Low extracellular pH induces damage in the pancreatic acinar cell by enhancing calcium signaling.</a> J. Biol. Chem. 286, 1919-1926 (2011).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Van Acker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+progression+locus-2+is+a+critical+regulator+of+pancreatic+and+lung+inflammation+during+acute+pancreatitis.">Tumor progression locus-2 is a critical regulator of pancreatic and lung inflammation during acute pancreatitis.</a> J. Biol. Chem. 282, 22140-22149 (2007).</li><li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+control+of+multiple+forms+of+Ca(2+)+spikes+by+inositol+trisphosphate+in+pancreatic+acinar+cells.">Kinetic control of multiple forms of Ca(2+) spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells.</a> J. Cell Biol. 146, 405-413 (1999).</li><li>Leite, M. F., Burgstahler, A. D., Nathanson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+require+sequential+activation+of+inositol+trisphosphate+receptors+and+ryanodine+receptors+in+pancreatic+acini.">Ca2+ waves require sequential activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors in pancreatic acini.</a> Gastroenterology. 122, 415-427 (2002).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li><li>Schild, D., Jung, A., Schultens, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+calcium+entry+through+calcium+channels+in+olfactory+receptor+neurones+using+a+laser+scanning+microscope+and+the+calcium+indicator+dyes+Fluo-3+and+Fura-Red.">Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red.</a> Cell Calcium. 15, 341-348 (1994).</li><li>Saluja, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretagogue-induced+digestive+enzyme+activation+and+cell+injury+in+rat+pancreatic+acini.">Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini.</a> Am. J. Physiol. 276, 835-842 (1999).</li><li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors+contribute+to+bile+acid-induced+pathological+calcium+signaling+and+pancreatitis+in+mice.">Ryanodine receptors contribute to bile acid-induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li><li>Gurda, G. T., Guo, L., Lee, S. H., Molkentin, J. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholecystokinin+activates+pancreatic+calcineurin-NFAT+signaling+in+vitro+and+in+vivo.">Cholecystokinin activates pancreatic calcineurin-NFAT signaling in vitro and in vivo.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 198-206 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

細胞単離法およびその後のアッセイは、膵臓外分泌の生理学的および病態生理学的機能を研究するためにいるとの強力なツールを表してここに示されている。分散した膵腺房細胞を単離するための方法が1972年にアムステルダム11とジェイミソンによって記述されていた。ここで紹介する方法は、ヴァンアッカーら12によって記述より最近の分離方法から適応されている。これ?...

細胞質カルシウムの動的変化は、生理学的および病理学的両方腺房細胞のイベントのために必要である。カルシウム、これらの発散効果はカルシウムシグナリング1の明確な空間的および時間的パターンに起因すると考えられている。例えば、腺房細胞から酵素液分泌は、分泌が行わ2を取るアピカルポールの限定された領域からのカルシウムスパイクにリンクされています。これとは対照的に、強烈な非振動カルシウムシグナルが続くグローバルカルシウム波が急性膵炎3,4につながる初期の病理学的イベントに関連付けられています。これらは内腺プロテアーゼ活性化、減少酵素の分泌、および腺房細胞傷害が含まれています。私たちの研究室では、in vivoおよびin vitroで 5-7両方病気につながるこれらの初期の病理学的事象を研究するために分離された膵臓の腺房を使用しています。ここで詳述方法は、CYを測定するために一次腺房細胞の単離を記載tosolicカルシウムレベルと細胞傷害。これらの細胞のアデノウイルス感染のための方法も提供される。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mice</td>
 <td>NCI</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>American Bioanalytical</td>
 <td>AB00892</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Chloride</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>3624-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium Chloride</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>3040-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M-8266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium Chloride</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C79</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextrose</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>1916-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G-8540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11140-050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide</td>
 <td>EM</td>
 <td>SX0593</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A7906</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>4188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Soybean Trypsin Inhibitor</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T-9003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbon Dioxide</td>
 <td>Matheson Gas</td>
 <td> 124-38-9 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>125 ml Erlenmeyer plastic flask</td>
 <td>Crystalgen </td>
 <td>26-0005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection kit</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14161-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td>LabChem</td>
 <td>LC222102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000, P100, P10 pipettes</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>FA10005P</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Weighing boat</td>
 <td>Heathrow Scientific</td>
 <td>HS1420A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic transfer pipettes</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>1020-2500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml conical tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352095</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml conical tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 ml micro-centrifuge tube</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>05-408-129</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.65 ml micro-centrifuge tube</td>
 <td>VWR</td>
 <td>20170-293</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>22 x 22 mm glass coverslips</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>032811-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitric Acid</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A483-212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric Acid</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A142-212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Deionized water</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 x 18 mm coverslips</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>021510-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laboratory film</td>
 <td>Parafilm</td>
 <td>PM-996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4AM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F14201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylsulfoxide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luer lock</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>932777</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 ml syringe</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>DG567805</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>23 &frac34; gauge needle</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>9328270</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PE50 tubing</td>
 <td>Clay Adam</td>
 <td>PE50-427411</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flat head screwdriver </td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM F-12, no Phenol Red</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21041-025 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30.5 gauge needle</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>305106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 CC syringe</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>309603</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml Erlenmeyer flask</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FB50025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon mesh filter </td>
 <td>Nitex</td>
 <td>03-150/38</td>
 <td>150 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>48 well tissue culture plate</td>
 <td>Costar</td>
 <td>3548</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well tissue culture plate </td>
 <td>Costar</td>
 <td>3795</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6 well tissue culture plate</td>
 <td>Costar</td>
 <td>3506</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen</td>
 <td>Matheson Gas</td>
 <td>7727-37-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cytotoxicity assay kit</td>
 <td>Promega</td>
 <td>G1782</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adeno-GFP</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Gift from J. Williams</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring stand with clamps</td>
 <td>United Scientific</td>
 <td>SET462</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perifusion chamber</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum line</td>
 <td>Manostat</td>
 <td>72-100-000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water bath with shaker</td>
 <td>Precision Scientific</td>
 <td>51220076</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>LSM 710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BioTek Synergy H1 plate reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td>11-120-534</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture hood</td>
 <td>Nuaire</td>
 <td>NU-425-600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture Incubator</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>3110</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

preparation of pancreatic acinar cells for the purpose of calcium imaging, cell injury measurements, and adenoviral infection

膵臓腺房細胞は、膵臓外分泌の主な実質細胞であると膵管に膵酵素の分泌の主な役割を果たしている。また、膵炎の開始のための部位である。ここでは、全体の膵臓組織から分離され、細胞内カルシウムシグナルの測定方法腺房細胞説明する。さらに、in vitroでの腺房細胞傷害を誘導する条件の中に、アデノウイルス構築物で、これらの細胞をトランスフェクトし、その後乳酸脱水素酵素、細胞損傷のマーカーの漏れを測定する技術が記載されている。これらの技術は、腺房細胞生理学と病理学を特徴づけるための強力なツールを提供します。

生理学的刺激に応答し腺房細胞のカルシウム測定の例を図3に設けられている。腺房細胞は、カルシウム染料のFluo-4にロードされ、アセチルコリンアナログカルバコール（のCCh; 1μM）を灌流した）8。細胞が頂端地域で開始し、基底地域3,9に伝播カルシウム波の形で答えた。 図3Bに示す代表的なトレーシングは、一般的に、1μMのカルバコールで観察さ?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection at JoVE.com

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

我々は、生理学的および病理学的に関連性の刺激と腺房細胞のカルシウムシグナルおよび細胞傷害を調べる目的で、マウスからマウスの膵臓腺房細胞を調製する再現性のある方法が記載されている。これらの細胞のアデノウイルス感染のための方法も提供される。

カルシウムイメージング、細胞傷害測定、およびアデノウイルス感染の目的のための膵臓腺房細胞の調製

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

preparation-pancreatic-acinar-cells-for-purpose-calcium-imaging-cell

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K ビュー.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. 我々は、生理学的および病理学的に関連性の刺激と腺房細胞のカルシウムシグナルおよび細胞傷害を調べる目的で、マウスからマウスの膵臓腺房細胞を調製する再現性のある方法が記載されている。これらの細胞のアデノウイルス感染のための方法も提供される。

ビデオ: Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

生物学

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

イメージング細胞膜の損傷および修復に関与する細胞内プロセス

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

ディスク顕微鏡スピニング共焦点の使い方アデノウイルスやレンチウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞の生細胞イメージング

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work demonstrates how the secretory capacity of these cells can be assessed by culture of isolated acini. The setup is advantageous since isolated acini, which retain many characteristics of the intact exocrine pancreas can be manipulated and monitored more readily than in the whole animal. Proper isolation of pancreatic acini is a key requirement so that the ex&#160;vivo culture will represent the in&#160;vivo nature of the acini. The protocol demonstrates how to isolate intact acini from the mouse pancreas. Subsequently, two complementary methods for evaluating pancreatic secretion are presented. The amylase secretion assay serves as a global measure, while direct imaging of pancreatic secretion allows the characterization of secretion at a sub-cellular resolution. Collectively, the techniques presented here enable a broad spectrum of experiments to study exocrine secretion.

Isolated pancreatic acini retain their in&#160;vivo morphology and activity and offer powerful ways for monitoring and manipulating secretion. This work demonstrates how acini can be isolated from the mouse pancreas, and how their secretory capacities can be assessed.

膵臓腺房細胞の分泌能力を評価する

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

注入カテーテル電極の繰り返し測定を可能にすると目がさめているラットの膀胱内圧測定と外部尿道括約筋の測定

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...